馬夢(mèng)婷，高慶華，王姍姍，陳曉利，鄭永富

（1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，阿拉爾843300；2.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300；3.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300）

牙釉質(zhì)基因巢式擴(kuò)增鑒定牛早期胚胎性別的研究

馬夢(mèng)婷1，2，高慶華1，3，王姍姍1，3，陳曉利1，鄭永富1，3

（1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，阿拉爾843300；2.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300；3.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300）

根據(jù)牙釉質(zhì)基因在牛X染色體和Y染色體上存在的差異設(shè)計(jì)巢式引物，對(duì)牛靜脈血基因組DNA樣本以及10枚牛早期胚胎DNA樣本進(jìn)行巢式擴(kuò)增和電泳分析，以鑒定性別。結(jié)果表明：利用此方法能夠?qū)ε?0 pg量血液基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增鑒定性別，雌性產(chǎn)生1條片段長(zhǎng)度為311 bp的源于X染色體的條帶，雄性產(chǎn)生1條源于X染色體的條帶（311 bp）和1條片段長(zhǎng)度為251 bp的源于Y染色體的條帶，對(duì)10枚胚胎進(jìn)行鑒定，6枚為雄性，4枚為雌性。說明牙釉質(zhì)基因巢式PCR擴(kuò)增鑒定牛早期胚胎性別方法可靠，準(zhǔn)確性和敏感性較高。

牙釉質(zhì)基因；牛；胚胎；性別鑒定；巢式PCR

性別控制一直是家畜及經(jīng)濟(jì)動(dòng)物生產(chǎn)繁育的重要環(huán)節(jié)，通過人為控制獲得所需性別后代可以提高優(yōu)秀母畜利用率，同時(shí)可加快繁殖速率［1-2］。性別鑒定可以在胚胎移植前確定胚胎性別，根據(jù)需要移植不同性別胚胎，從而達(dá)到人為控制家畜后代性別的目的。性別鑒定方法眾多，現(xiàn)階段最為常用的方法為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），此方法能夠快速準(zhǔn)確地完成性別鑒定［3］。PCR技術(shù)鑒定早期胚胎性別多使用Y染色體所特有的基因SRY，SRY是哺乳動(dòng)物的性別決定基因［4］，只有雄性會(huì)被擴(kuò)增。無法準(zhǔn)確判斷胚胎為雌性或者未擴(kuò)增成功，需要設(shè)計(jì)一對(duì)常染色體基因引物作為對(duì)照。哺乳動(dòng)物的牙釉質(zhì)基因（amelogenin）在豬［5］、牛［6］、羊［7］的X染色體和Y染色體上均可以被檢測(cè)到，但其在兩條性染色體上的長(zhǎng)度不同，只需設(shè)計(jì)一對(duì)引物就可以擴(kuò)增出不同長(zhǎng)度的X染色體及Y染色體序列，更為簡(jiǎn)便。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)牛牙釉質(zhì)基因序列設(shè)計(jì)巢式擴(kuò)增的內(nèi)、外引物，對(duì)牛早期胚胎進(jìn)行性別鑒定，以期建立一種高效、快速、準(zhǔn)確的牛早期胚胎性別鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 材料

DL-2000 DNAmarker、瓊脂糖均購(gòu)自Takara公司；2×EasyTaq○RPCR SuperMix DNA聚合酶及血液基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自Transgen公司。

高速冷凍離心機(jī)（Sigma30，德國(guó)），凝膠成像系統(tǒng)（GELDOC2000，德國(guó)），電熱恒溫水浴鍋（HH-S，江蘇），穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（DYY-2，北京），PCR擴(kuò)增儀（TC-500，Techne）連續(xù)變倍體視顯微鏡（XTZ-D，上海）。

牛胚胎為新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 DNA樣品制備

牛靜脈血基因組DNA提取使用Transgen公司的血液基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行。提取的血液基因組DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度后10倍稀釋至10pg/μL。

牛胚胎DNA提取使用水煮法，胚胎從液氮中取出后37℃水浴解凍，排除甘油，分別裝入10個(gè)1.5 mLEP管，加入20 μL滅菌去離子水，沸水加熱處理10 min，轉(zhuǎn)入冰浴，冷卻后4000r/min離心2min。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)據(jù)牛AMEL基因序列（AMELX，GenBank accession no.NM_001014984；AMELY，GenBank accession no. NM_174240），采用BLAST和Clustal W程序設(shè)計(jì)巢式引物，見表1。引物由上海生工合成。

表1 內(nèi)、外引物序列

1.4 PCR擴(kuò)增

第一輪PCR反應(yīng)體系：Taq mix（50 mmol/L KCl，20 mmol/L Tris-HC，3 mmol/L MgSO4，400 mmol/L dNTPs，0.1 U/μLTaq酶）10 μL，上下游巢式外引物（10 μmol/L）各0.2μL，1μL模板，6.6μL滅菌超純水，共20μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃30 s、62℃30 s、72℃30 s，共25個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min。

第二輪PCR反應(yīng)體系：Taq mix10 μL，上下游巢式內(nèi)引物（10 μmol/L）各0.4 μL，取第一輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μL作為模板，4.2 μL滅菌超純水，共20 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃30 s、62℃30 s、72℃30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min。

1.5 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

制作1%的瓊脂糖凝膠，取5 μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣，電壓200 V，15 min，電泳結(jié)束后EB染色7 min，于凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)，PCR結(jié)果有兩條帶者為雄性，一條帶者為雌性。

2 結(jié)果與分析

對(duì)濃度為10 pg/μL牛血液基因組DNA樣品采用牙釉質(zhì)基因巢式PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增效果如圖1所示，雌性胚胎擴(kuò)增只得到源于X染色體的1條帶（311 bp），雄性胚胎擴(kuò)增得到一條X染色體條帶以及源于Y染色體（251 bp）的1條帶，共2條帶。

圖1 牛血液DNA（10 pg）牙釉質(zhì)基因擴(kuò)增部分結(jié)果

應(yīng)用牙釉質(zhì)基因巢式擴(kuò)增鑒定牛早期胚胎性別，如圖2所示，擴(kuò)增得到1條帶者為雌性，2條帶者為雄性。10枚胚胎中，6枚為雄性，4枚為雌性。

圖2 牙釉質(zhì)基因巢式擴(kuò)增鑒定牛胚胎結(jié)果

3 討論

性別鑒定對(duì)所有哺乳動(dòng)物繁殖生產(chǎn)有巨大意義。通過對(duì)早期胚胎性別鑒定可以有效地控制用于移植的胚胎性別，獲得所需性別的后代。現(xiàn)階段，性別鑒定多使用X染色體與Y染色體的差異表達(dá)基因進(jìn)行擴(kuò)增，如性別決定基因SRY以及與睪丸決定因子相近的ZFY基因［8］。SRY基因只存在于Y染色體上，擴(kuò)增后只有雄性樣品可以被擴(kuò)增出現(xiàn)1條帶，雌性樣品不會(huì)被擴(kuò)增，無法準(zhǔn)確判斷是雌性樣品或者未擴(kuò)增成功。經(jīng)改進(jìn)，研究人員使用Y染色體特異基因擴(kuò)增時(shí)會(huì)選用常染色體上的1個(gè)基因作為對(duì)照［9］，從而增加了擴(kuò)增結(jié)果的可靠性，然而對(duì)胚胎性別進(jìn)行鑒定時(shí)，因?yàn)榕咛NA模板量較少，PCR擴(kuò)增容易出現(xiàn)失誤，因此需要使用巢式PCR擴(kuò)增來增大擴(kuò)增效率及提高引物特異性，由此進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增就需要設(shè)計(jì)4對(duì)引物，引物設(shè)計(jì)復(fù)雜。本實(shí)驗(yàn)選擇的牛牙釉質(zhì)基因同時(shí)存在于X染色體和Y染色體上，卻在X染色體及Y染色體上的長(zhǎng)度及位置不同，存在60 bp的長(zhǎng)度差異，利用這種特性，只需設(shè)計(jì)兩對(duì)引物就可以通過巢式PCR擴(kuò)增鑒定胚胎性別。

本實(shí)驗(yàn)使用牙釉質(zhì)基因?qū)?0 pg（約3個(gè)細(xì)胞）［10］的牛血液基因組DNA樣本及10枚牛早期胚胎進(jìn)行性別鑒定，并獲得成功，雌性擴(kuò)增得到1條源于X染色體的條帶（311bp），雄性擴(kuò)增出1條源于X染色體的條帶和1條源于Y染色體的條帶（251bp），在驗(yàn)證牙釉質(zhì)基因鑒定性別準(zhǔn)確性的同時(shí)，證明了其高靈敏度。PCR擴(kuò)增效率受底物濃度影響，底物濃度低有可能導(dǎo)致擴(kuò)增失敗，胚胎DNA模板量較少，擴(kuò)增也容易達(dá)到平臺(tái)期，只使用單純PCR可能無法檢測(cè)到擴(kuò)增產(chǎn)物。Song等［11］的研究說明，巢式PCR擴(kuò)增效率高于普通單次PCR效率100倍，因此在進(jìn)行牛早期胚胎性別鑒定時(shí)，為提高靈敏性及特異性較常使用巢式PCR擴(kuò)增技術(shù)，巢式PCR擴(kuò)增的第二輪以第一輪反應(yīng)產(chǎn)物為模板，可以獲得更多的擴(kuò)增產(chǎn)物，從而提高擴(kuò)增效率。羅光彬等［12］應(yīng)用巢式PCR法使用8個(gè)細(xì)胞鑒定牛早期胚胎性別獲得成功；Park等［13］使用SRY基因鑒定胚胎性別發(fā)現(xiàn)，胚胎卵裂球數(shù)少于4個(gè)時(shí)，擴(kuò)增的準(zhǔn)確性及靈敏度都會(huì)下降，而使用牙釉質(zhì)基因可以對(duì)單個(gè)胚胎細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，因此牙釉質(zhì)基因擴(kuò)增的靈敏度較高。本實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。

通過早期胚胎性別鑒定可以有效地控制后代性別比率，從而提高家畜繁殖效率及經(jīng)濟(jì)效益，并且在早期胚胎性別鑒定中，切割胚胎量越少對(duì)胚胎移植效果影響越小。本實(shí)驗(yàn)使用巢式擴(kuò)增牙釉質(zhì)基因，靈敏度達(dá)到10 pg，大約為3個(gè)細(xì)胞的量［10］，驗(yàn)證了牙釉質(zhì)基因用于鑒定胚胎性別的準(zhǔn)確性及高靈敏度，為牛早期胚胎性別鑒定提供簡(jiǎn)便、可靠的方法。

［1］ 劉卓，李純錦，李萬宏，等.鑒定牛體外培養(yǎng)胚胎性別的一種新PCR方法及其應(yīng)用［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，32（1）：140-143.

［2］ Johnson L A.Sexing mammalian sperm for production of offspring：the state-of-the-art［J］.Animal Reproduction Science，2000，60-61（4）：93-107.

［3］ Fu Q，ZhangM，Qin W S，et al.Cloningthe swamp buffalo SRY gene for embryosexingwith multiplex-nested PCR［J］.Theriogenology，2008，68（9）：1211-1218.

［4］ Polanco J C，Wilhelm D，Mizusaki H，et al.Functional analysis of the SRY-KRAB interaction in mouse sex determination［J］.Biol Cell，2009，101（1）：55-67.

［5］ Fontanesi L，Scotti E V.Differences of the porcine amelogenin X and Y chromosome genes（AMELXand AMELY）and their application for sex determination in pigs［J］.Molecular Reproduction&Development，2008，75（11）：1662-1668.

［6］ Grzybowski G，Prusak B，Romaniuk B.Anovel variant ofthe amelogenin gene（AMEL-X）in cattle and its implications for sexdetermination［J］. AnimalSciencePapers&Reports，2006：111-118.

［7］ Pfeiffer I，BrenigB.X-andY-chromosomespecific variants ofthe amelogenin gene allowsex determination in sheep（Ovis aries）and European reddeer（Cervuselaphus）［J］.BmcGenetics，2005，6（12）：16.

［8］ 白文林，尹榮煥，羅光彬，等.巢式PCR擴(kuò)增SRY基因序列鑒定牛胚胎性別的研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34（8）：1589-1590.

［9］ 張偉，王世銀，許蕓，等.利用性別決定基因（SRY）進(jìn)行牛早期胚胎性別鑒定的研究［J］.黑龍江動(dòng)物繁殖，2010，18（6）：20-22.

［10］Pomp D，Good BA，GeisertRD，et al.Sexidentification in mammals with polymerase chain reaction and its use toexamine sexeffects on diameter of day-10 or-11 pig embryos.［J］.Journal of Animal Science，1995，73（5）：1408-1415.

［11］Song D W，Shin S J，Kim D E，et al.Detection of MAGE and SSX gene expressionsbyRT-nested PCRusingcommon primersin head and neck cancer［J］.Clinical&Experimental Otorhinolaryngology，2008，1（1）：97-102.

［12］羅光彬，孫明亮，紀(jì)英卓，等.應(yīng)用巢式PCR法鑒定牛早期胚胎性別［J］.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，38（1）：80-84.

［13］Park J H，Lee J H，Choi K M，et al.Rapid sexing of preimplantation bovine embryo using consecutive and multiplex polymerase chain reaction（PCR）with biopsied single blastomere［J］.Theriogenology，2001，55（9）：1843-1853.

Sex Identification of Early Embryo in Bovine by Nested Amplification of Amelogenin Gene

Ma Mengting1，2，GaoQinghua1，3，WangShanshan1，3，et al
（（1.KeyLaboratoryofTarimAnimal HusbandryScience and TechnologyofXinjiang Production and Construction Groups，Alar 843300，China；2.College ofLife Science，TarimUniversity，Alar 843300，Xinjiang，China；3.College ofAnimal Science，TarimUniversity，Alar 843300，Xinjiang，China）

Based on the difference between AMEL-X and AMEL-Y genes of bovine，the nested primers were designed.Nested amplification and electrophoresis were used to identify the gender of bovine blood genomic DNA and 10 early embryos of bovine. The results showed that the nested PCR could identify gender on 10 pg genomic DNA.One 311 bp fragment from X chromosome in female，and a 311 bp fragment from X chromosome and a 251 bp fragment from the Y chromosome in male were found.10 embryos were identified，6 was male，4 was female.The method based nested PCR amplifying amelogenin gene for sex identification was highlyaccurate and sensitive.

amelogenin gene；bovine；embryo；sexidentification；nested PCR

S823.3

A

2095-3887（2016）03-0031-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.03.008

2016-03-29

塔里木大學(xué)研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（TDGRI201401）

馬夢(mèng)婷（1991-），女，碩士研究生。

高慶華，教授，博士。