李少斌，焦 丹，王繼卿，劉 秀，羅玉柱

（甘肅省草食動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省牛羊基因改良工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070）

HIF-lα和HIF-2α基因在藏綿羊不同組織中的表達(dá)及其意義

李少斌，焦 丹，王繼卿，劉 秀，羅玉柱

（甘肅省草食動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省牛羊基因改良工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070）

高原低氧適應(yīng)性研究對(duì)于了解高原土著動(dòng)物的遺傳進(jìn)化和高原疾病的治療有著重要意義。HⅠF（hypoxia inducible factor）是氧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞的低氧應(yīng)答中起著關(guān)鍵作用。實(shí)驗(yàn)旨在研究HIF-lα和HIF-2α基因表達(dá)特征在藏綿羊低氧適應(yīng)中的意義。采用RT-qPCR技術(shù)對(duì)藏綿羊HIF-la和HIF-2a基因進(jìn)行了組織表達(dá)分析。結(jié)果表明：HIF-lα和HIF-2α基因在藏綿羊的8種組織（心、肝、脾、肺、腎、大腦、小腦和腦干）中均有表達(dá)。HIF-lα基因在肺和小腦中有高水平表達(dá)，其他依次是腎、腦干、大腦、心、脾和肝。HIF-2α基因在肺中表達(dá)水平最高，其他依次是腦干、心、腎、小腦、大腦和肝。結(jié)論：該研究首次證實(shí)，HIF-lα和HIF-2α基因在藏綿羊脾、大腦、小腦和腦干中均有表達(dá)，且HIF-lα在小腦中的表達(dá)水平較高。HIF-lα和HIF-2α基因在藏綿羊上呈表達(dá)廣泛性和組織差異性，與其他高原土著動(dòng)物有著類(lèi)似的表達(dá)特征。這種個(gè)別組織HIF-lα和HIF-2α表達(dá)水平的提高提示，其正是維持低氧環(huán)境下生物體功能活動(dòng)正常運(yùn)轉(zhuǎn)的分子基礎(chǔ)。

HIF-lα；HIF-2α；藏綿羊；mRNA表達(dá)；低氧適應(yīng)

高原低氧環(huán)境能夠引起動(dòng)物機(jī)體的一系列生理反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致高原病。高原土著動(dòng)物主要通過(guò)體型外貌、行為特征、生長(zhǎng)發(fā)育和生理生化功能等變化來(lái)適應(yīng)低氧環(huán)境［1-3］。探索高原土著動(dòng)物低氧適應(yīng)性機(jī)制，有助于了解動(dòng)物的進(jìn)化、高原疾病和種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)利用。對(duì)于低氧適應(yīng)的研究包括整體、器官、細(xì)胞和分子水平，而目前主要集中在分子水平。

HIF是氧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞的低氧應(yīng)答中起著關(guān)鍵作用。HIF由α和β兩個(gè)亞基構(gòu)成，其中α為調(diào)節(jié)亞基，β為構(gòu)建亞基。目前發(fā)現(xiàn)，α亞基存在3種異構(gòu)體，HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α。HIF-lα和HIF-2α是細(xì)胞在低氧狀態(tài)下最主要的調(diào)節(jié)因子。HIF-lα和HIF-2α在動(dòng)物中表現(xiàn)為多組織表達(dá)，且有明顯的組織差異性。藏綿羊是青藏高原最主要的畜種之一，其對(duì)高原低氧環(huán)境有著良好的適應(yīng)性。揭示高原動(dòng)物的低氧適應(yīng)機(jī)制，對(duì)于了解動(dòng)物的遺傳進(jìn)化及高原病的預(yù)防治療有著積極的意義。本實(shí)驗(yàn)擬研究藏綿羊HIF-lα和HIF-2α基因表達(dá)的組織差異性，為藏綿羊低氧適應(yīng)機(jī)制的研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 藏綿羊選自甘肅省合作市某屠宰場(chǎng)，共5只，屠宰后立即提取組織樣品，DEPC滅菌水沖洗后并置于液氮中保存?zhèn)溆?。所采集組織包括心、肝、脾、肺、腎、大腦、小腦和腦干。

1.1.2 主要試劑 Trizol（Invitrogen產(chǎn)品）、PrimeScript RT Reagent kit和SYBR PremixExTaq（TaKaRa產(chǎn)品）。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 參照劉芳［4］設(shè)計(jì)的引物，內(nèi)參基因選擇l8S rRNA（見(jiàn)表1）。引物由華大基因公司合成。

表1 引物名稱(chēng)、序列、預(yù)期產(chǎn)物大小及退火溫度

1.2.2 RNA提取和cDNA合成 按照Trizol試劑盒說(shuō)明提取各組織總RNA，純度和完整性檢測(cè)后，DNaseⅠ處理除去可能混入的基因組DNA，按照TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒的使用說(shuō)明將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 表達(dá)分析 采用SYBR○RGreenⅠ熒光定量PCR兩步法進(jìn)行表達(dá)分析。所用儀器為羅氏LightCycler○R480 System。采用20 μL反應(yīng)體系：SYBR PremixEx TaqTMⅡ10μL、引物各0.8μL、cDNA模板2μL和滅菌雙蒸水6.4μL。每個(gè)組織重復(fù)3次。熒光定量PCR條件：95℃預(yù)變性：30 s（升溫速率4.4℃/s）1循環(huán)，95℃變性5 s（升溫速率4.4℃/s），60℃反應(yīng)30 s（升溫速率2.2℃/s，Acquistion Mode：Single）40循環(huán)。隨后進(jìn)行溶解曲線分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用 2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量分析，其中△Ct= CtHIF-lα或HIF-2α-Ctl8SrRNA，△△Ct=△Ct組織-△Ct肝。

2 結(jié)果

經(jīng)檢測(cè)HIF-lα和HIF-2α基因在藏綿羊的8種組織中均有表達(dá)。根據(jù)檢測(cè)出的Ct值，經(jīng)2-△△Ct法計(jì)算，發(fā)現(xiàn)2個(gè)基因均在肺組織中的表達(dá)最高，在肝組織中的表達(dá)最低（見(jiàn)表2）。其中，HIF-lα基因在肺和小腦中有高水平表達(dá)，其他依次是腎、腦干、大腦、心、脾和肝。HIF-2α基因在肺中表達(dá)水平最高，其他依次是腦干、心、腎、小腦、大腦和肝。同時(shí)，在肺和腦干中2個(gè)基因的表達(dá)個(gè)體間差異比較大。值得注意的是，HIF-lα基因在小腦中的表達(dá)水平很高，基本與肺中的持平，而HIF-2α基因在小腦中的表達(dá)較低。

表2 HIF-lα和HIF-2α基因在藏綿羊各組織中的表達(dá)水平比較

3 討論

氧是動(dòng)物生存不可或缺的關(guān)鍵因子之一，在能量代謝和信號(hào)傳導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用。為了維持氧平衡，動(dòng)物機(jī)體形成了復(fù)雜的呼吸系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)。低氧是人和動(dòng)物高原生存的不利因素之一。在低氧應(yīng)答中，轉(zhuǎn)錄因子HIF在氧信號(hào)轉(zhuǎn)錄中起著至關(guān)重要的作用，通過(guò)調(diào)控其靶基因發(fā)生系列應(yīng)答反應(yīng)，如增加紅細(xì)胞數(shù)量、調(diào)節(jié)葡萄糖代謝和細(xì)胞外機(jī)制等。也正是由于其功能的重要性，HIF表達(dá)于所有研究過(guò)的后生動(dòng)物中［5］。

本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)了HIF-lα和HIF-2α基因在藏綿羊不同組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示在心、肝、脾、肺、腎、大腦、小腦和腦干中2個(gè)基因均有表達(dá)，且均在肺組織中表達(dá)水平最高。這種表達(dá)廣泛性和組織差異性與其他高原動(dòng)物（牦牛、高原屬兔、高原根田鼠）的研究結(jié)果一致［6-8］。目前已有關(guān)于藏綿羊HIF-lα和HIF-2α基因組織表達(dá)的研究，但只研究了心、肝、肺、腎和骨骼肌5種組織，且是作為藏羚羊研究的對(duì)照組［4］。本研究首次證實(shí)，2個(gè)基因在藏綿羊脾、大腦、小腦和腦干中均有表達(dá)，且HIF-lα在小腦中表達(dá)水平比較高。這種組織特異性調(diào)節(jié)在小鼠、藏雞和魚(yú)類(lèi)等動(dòng)物上已經(jīng)得到證實(shí)［9-11］。Stroka等［9］研究表明，小鼠低氧暴露，HIF-lα在腦、腎、肝、心和骨骼肌表達(dá)水平會(huì)提高，但表達(dá)量和代謝動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)出組織差異性。印度鯰屬于低氧耐受性較強(qiáng)的魚(yú)類(lèi)，短期低氧暴露導(dǎo)致HIF-lα和HIF-2α在腦、肝和腎中的表達(dá)增加，但長(zhǎng)期低氧暴露導(dǎo)致HIF-lα在脾和HIF-2α在肌肉中的表達(dá)增加［11］。高原動(dòng)物個(gè)別組織HIF-lα和HIF-2α表達(dá)水平的提高提示其正是維持低氧環(huán)境下生物體功能活動(dòng)正常運(yùn)轉(zhuǎn)的分子基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

HIF-lα和HIF-2α基因在藏綿羊的心、肝、脾、肺、腎、大腦、小腦和腦干中均有表達(dá)。HIF-lα和HIF-2α基因在藏綿羊上呈表達(dá)廣泛性和組織差異性，這種個(gè)別組織表達(dá)水平的提高提示其正是維持低氧環(huán)境下生物體功能活動(dòng)正常運(yùn)轉(zhuǎn)的分子基礎(chǔ)。

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Expression and Significance of HIF-lα and HIF-2α Genes in Tibetan Sheep

Li Shaobin，JiaoDan，LuoYuzhu，et al
（Gansu KeyLaboratoryofHerbivorous Animal Biotechnology，Gansu EngineeringLab ofGenetic Improvement in Ruminants，College ofAnimal Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China）

Hypoxia adaptation research has important significance on understanding genetic evolution of highland animal and treatment ofhigh altitude disease.HIF（hypoxia inducible factor）is an important transcription factor in oxygen signal transduction system，which plays a keyrole in cellular hypoxia response.In this study，Tibetan sheep were selected tostudythe expression and significance of HIF-lα and HIF-2α genes using RT-qPCR technique.The results showed that both HIF-lα and HIF-2α genes expressed in the eight tissues（heart，liver，spleen，lung，kidney，brain，cerebellum and brain stem）.HIF-lα gene had high level expressioninlungandcerebellum，theexpressionorderinothertissueswaskidney＞brainstem＞brain＞heart＞spleen＞liver.HIF-2α expression showed that the highest level was in the lung，followed bybrain stem，heart，kidney，cerebellum，brain and liver.It was demonstrated for the first time that these two genes were expressed in spleen，brain，cerebellum and brain stem，and the expressionlevelofHIF-lαinthecerebellumwasrelativelyhigh inTibetansheep.TheexpressionofHIF-lα andHIF-2α genes in the Tibetan sheep were extensive and with organizational differences，and had similar expression profiles with other highland indigenous animals.The increasement of expressionlevels of the HIF-lα and HIF-2α in some individual organizations suggested that this was molecular mechanism for maintaining normal functions ofthe organisms under a lowoxygen environment.

HIF-lα；HIF-2α；Tibetan sheep；mRNAexpression；hypoxia adaptation

S826.2

A

2095-3887（2016）03-0011-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2016.03.003

2016-02-29

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD13B05-02）；甘肅省國(guó)際科技合作專(zhuān)項(xiàng)（1304WCGA178）；甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)盛彤笙科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目（GSAU-STS-134）；甘肅省青年科技基金計(jì)劃項(xiàng)目（1308RJYA025）；甘肅省高等學(xué)校科研項(xiàng)目（2015B-052）

李少斌（1983-），男，助理研究員，碩士研究生。研究方向：現(xiàn)代生物技術(shù)與動(dòng)物育種。

羅玉柱（1962-），男，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：現(xiàn)代生物技術(shù)與動(dòng)物育種應(yīng)用。