涂世英，汪 琦，柴志欣，鐘金城

（1.云南省動物衛(wèi)生監(jiān)督所，昆明650000；2.西南民族大學，動物遺傳育種學國家民委-教育部重點實驗室，成都610041；3.西南民族大學，青藏高原研究院，成都610041）

中甸牦牛mtDNA D-Loop區(qū)遺傳多樣性及系統(tǒng)進化分析

涂世英1，汪 琦2，3，柴志欣2，3，鐘金城2，3

（1.云南省動物衛(wèi)生監(jiān)督所，昆明650000；2.西南民族大學，動物遺傳育種學國家民委-教育部重點實驗室，成都610041；3.西南民族大學，青藏高原研究院，成都610041）

根據(jù)牦牛線粒體DNA序列設(shè)計引物，擴增獲得了中甸牦牛線粒體D-loop區(qū)全序列，并以山羊為外屬對牛亞科部分牛種（野牦牛、九龍牦牛、麥洼牦牛、西藏牦牛、天祝牦牛、青海牦牛、大通牦牛、美洲野牛、歐洲野牛、印度野牛、亞洲水牛和普通牛）的mtDNA D-loop序列進行了系統(tǒng)進化分析，以期了解中甸牦牛的遺傳多樣性，從而為中甸牦牛遺傳資源的保護、開發(fā)和利用奠定理論基礎(chǔ)。結(jié)果表明：①中甸牦牛線粒體D-loop區(qū)序列長在890～910 bp之間，T、C、A、G四種堿基的平均含量分別為28.78%、24.41%、32.34%和14.47%，存在一定的堿基組成偏倚性；②中甸牦牛共有13種單倍型，平均單倍型多樣性（Hd）為0.983 3，平均核苷酸多樣性（Pi）為0.005 34，遺傳多樣性較為豐富；③中甸牦牛與已知牛種mtDNA D-loop區(qū)序列雙參數(shù)距離顯示，其與麥洼牦牛距離最小（0.006），與亞洲水牛距離最大（0.179）；④系統(tǒng)進化分析顯示，中甸牦牛是我國眾多家牦牛類群中的一支，與麥洼牦牛聚為一類，推測其可能與麥洼牦牛因地理位置存在基因交流，由共同祖先進化而來。

中甸牦牛；D-loop區(qū)；牛亞科；系統(tǒng)發(fā)育

doi：10.3969/j.issn.2095-3887.2016.03.002

牦牛是青藏高原特有的珍稀家畜品種，是高寒草地不可替代的生物資源，已成為青藏高原地區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展的獨立板塊。中甸牦牛主要分布在海拔3 000 m以上的高寒地區(qū)，是云南迪慶高原地區(qū)特有的畜種，主產(chǎn)于中甸縣尼西、格咱、大中甸、小中甸等藏族聚居的鄉(xiāng)鎮(zhèn)，在大理州高寒地區(qū)也有分布，數(shù)量以迪慶中甸縣最多，是我國優(yōu)良牦牛類型之一［1］。中甸牦牛毛色以黑色居多，其次為黑白花，公母都有角，角為黑色或灰白，體格粗壯結(jié)實，具有耐寒耐粗飼，乳肉品質(zhì)優(yōu)良和抗病力強等優(yōu)良種質(zhì)特性［2-3］。由于受中甸地區(qū)社會經(jīng)濟、自然氣候條件以及公犏牛不育等因素制約，目前仍處在用本地黃牛與牦牛雜交繁殖犏牛的階段，因此將來對中甸牦牛的研究主要集中在適宜高寒自然環(huán)境的生理特性和改良遺傳性狀等方面。

線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）因具有母系遺傳、多態(tài)性豐富以及結(jié)構(gòu)簡單等特點，被認為是研究物種起源、演化和分類最好的分子遺傳標記［4］，其中D-loop區(qū)進化速度快，變異較大，適用于對亞科內(nèi)屬、種間的系統(tǒng)學研究［5］。張成福等［6-7］通過測定西藏牦牛類群的D-loop區(qū)序列對西藏牦牛的遺傳多樣性、類群間親緣關(guān)系和系統(tǒng)進化關(guān)系進行了研究；李齊發(fā)等［8］通過測定九龍牦牛的D-loop區(qū)全序列并對其進行了系統(tǒng)發(fā)育分析。目前尚未見云南中甸牦牛線粒體基因的相關(guān)報道。本研究利用DNA測序技術(shù)，測定了中甸牦牛線粒體基因D-Loop區(qū)全序列，并以羊亞科（Caprinae）中的山羊（Capra hircus）作為外類群，以及部分牛品種（野牦牛、九龍牦牛、麥洼牦牛、西藏牦牛、天祝牦牛、青海牦牛、大通牦牛、美洲野牛、歐洲野牛、印度野牛、亞洲水牛和普通牛）進行系統(tǒng)進化分析，探究中甸牦牛的遺傳多樣性及其物種間的親緣關(guān)系，以期從分子水平上探討牛亞科不同物種間的系統(tǒng)進化關(guān)系及中甸牦牛的分類地位，為中甸牦牛遺傳資源的進一步保護、定向育種、開發(fā)和利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在云南省迪慶中甸縣，選取成年健康的中甸牦牛（15頭），采集耳組織樣品，75%乙醇保存帶回實驗室，存于-20℃的冰箱中備用。

1.2 基因組DNA的提取及檢測

運用動物組織基因組提取試劑盒（TianGen生物技術(shù)公司）提取基因組DNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計分別檢測DNA的純度和濃度，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計與序列擴增

根據(jù)GenBank中公布的普通牛線粒體DNA序列（AF492351.1），利用Primer Premier 5.0設(shè)計1對引物擴增三江黃牛的D-loop區(qū)，引物序列F：CTGCAGTCTCAC CCATCAACC；R：GGGGTGTAGATGCTTGC，由英濰捷基（上海）生物科技有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系為25 μL。其中，上、下游引物各1 μL（10 pmol/μL），DNA模板1 μL（200～600 ng/μL），2×long Taq DNA預(yù)混酶12.50 μL（0.625 U），ddH2O（純化水）9.50 μL。

PCR擴增條件：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性15 s，57.7℃退火15 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃延伸3 min，4℃保存。

1.4 目的基因克隆測序

PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的片段大小，再用DNA純化試劑盒（由TianGen公司生產(chǎn)）進行回收分離純化，直接連接到pMDTM19-T載體（由TaKaRa公司生產(chǎn)）上，并轉(zhuǎn)化到高效感受態(tài)細胞DH5α中，LB平板培養(yǎng)基（含有2%X-Gal、1%IPTG和1%Amp）上37℃培養(yǎng)12～16 h，篩選陽性克隆在700 μLLB液體培養(yǎng)基（含1%Amp）中37℃振蕩培養(yǎng)6～7 h。重組子經(jīng)菌液PCR鑒定后，送往英濰捷基（上海）生物科技有限公司進行正反雙向測序。

1.5 牛亞科部分牛種和外類群構(gòu)建D-loop區(qū)序列的來源

選取牛亞科中具有代表性的牛種和中甸牦牛進行系統(tǒng)建群分析，包括野牦牛（Poephagus mutusc）、九龍牦牛（Jiulong yak）、麥洼牦牛（Maiwa yak）、西藏牦牛（Xizang yak）、天祝牦牛（Tianzhu yak）、青海牦牛（Qinghai yak）、大通牦牛（Datong yak）、美洲野牛（Bison bison）、歐洲野牛（Bison bonasus）、印度野牛（Bison gaurus）、亞洲水牛（Bubalus bubalis）、普通牛（Bos taurus）與中甸牦牛（Zhongdian yak）比對分析，并選取與牛亞科親緣關(guān)系較近的羊亞科中的山羊（Capra hircus）作為系統(tǒng)發(fā)育分析的外類群，從GenBank上下載這些相關(guān)牛種D-loop區(qū)的全序列（見表1）。

1.6 數(shù)據(jù)分析和系統(tǒng)進化分析

選取擴增所得中甸牦牛線粒體DNA D-loop區(qū)序列以及從GenBank下載的所有序列用DNAMAN進行序列編輯整理，再用clustalX軟件進行序列同源性比對，利用Dnasp 5.0軟件統(tǒng)計三江黃牛線粒體DNAD-loop區(qū)的核苷酸單倍型數(shù)目（number ofhaplotypes）、單倍型多樣度（haplotype diversity）、核苷酸多樣性（nucleotide diversity）、平均核苷酸差異（average number ofnucleotide differences）等，并對所有突變位點進行Tajima中性檢驗。用MEGA5.0軟件統(tǒng)計三江黃牛核苷酸序列的堿基組成、轉(zhuǎn)換/顛換比（transition/transversion，Ts/Tv），并用Kimura2-parameter模型計算遺傳距離，運用鄰接法（NJ）與其他各牛種構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自舉分析（bootstrap test）1 000次重復抽樣檢驗獲得置信度（BP）。

表1 牛亞科代表性牛種和外類群的D-loop區(qū)序列

2 結(jié)果與分析

2.1 中甸牦牛mtDNA D-loop區(qū)的PCR擴增

中甸牦牛mtDNAD-loop區(qū)PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳（圖1），目的片段大小1 000 bp左右，與預(yù)期結(jié)果一致，表明擴增成功。

2.2 中甸牦牛mtDNA D-loop區(qū)的核苷酸組成及多樣性

通過測序可知，15頭中甸牦牛mtDNA D-loop區(qū)全長均在909～911 bp之間，存在堿基插入、缺失和替換，共有51個變異位點，其中15個插入或缺失位點，36個轉(zhuǎn)化或顛換位點，轉(zhuǎn)換/顛換（Ts/Tv）比1.77，表明中甸牦牛核苷酸多態(tài)性的變異主要以轉(zhuǎn)換為主，其中A→G/C→T轉(zhuǎn)換次數(shù)最多，顛換次數(shù)較少。在轉(zhuǎn)換變異類型中以A/G和T/C為主，在插入類型以C堿基為主。單態(tài)突變位點35個，占多態(tài)位點總數(shù)的68.63%，簡約信息位點16個，占多態(tài)位點總數(shù)的31.37%。T、C、A、G四種堿基的平均含量為28.78%、24.41%、32.34%和14.47%，G+C含量為38.88%，A+T的含量為61.12%，說明中甸牦牛mtDNA D-loop區(qū)富含A/T堿基，具有一定偏倚性。

圖1 中甸牦牛線粒體DNAD-loop區(qū)擴增產(chǎn)物

用Dnasp5.0軟件對15頭中甸牦牛個體的單倍型進行多樣性分析（表2），結(jié)果表明，中甸牦牛共有13種單倍型，平均單倍型多樣性（Hd）為0.983 3，平均核苷酸多樣性（Pi）為0.005 34。對所有的突變位點進行Tajima中性檢驗，得到Tajim’D值：1.465 04＞0.1，表明差異不顯著，所有的變異均符合中性進化。

表2 中甸牦牛mtDNAD-loop區(qū)的單倍型分布

2.3 中甸牦牛與各牛種類群間D-loop區(qū)遺傳多樣性差異

除印度野牛外，所列各牛種中4種堿基分布情況大致相同（表3），T、C、A、G四種核苷酸的平均含量分別為 28.66%（28.36%～29.18%）、25.11%（24.40%～25.51%）、32.36%（31.69%～32.85%）、13.87%（13.34%～14.47%），其中A/T含量（61.02%）明顯高于G/C含量（38.98%），表明各牛種線粒體DNA D-loop區(qū)均富含堿基A和T。

牛亞科內(nèi)部分牛種類群間D-loop區(qū)序列差異百分比見表4。由表4可知，中甸牦牛與美洲野牛的序列差異最小，為1.96%，與其他幾種家牦牛的序列差異百分比在5.42%～7.99%之間，與印度野牛差異最大，為25.70%。在牛亞科中，九龍牦牛和大通牦牛序列無差異，麥洼牦牛和天祝牦牛序列也無差異；麥洼牦牛、西藏牦牛、天祝牦牛與青海牦牛的序列間差異較小，為0.11%，而與印度野牛、亞洲水牛的序列差異百分比較大（23.29%～33.58%）；這與以往的研究結(jié)果基本一致。

表3 牛亞科部分牛種和外類群的D-loop區(qū)段的堿基組成%

表4 牛亞科內(nèi)不同物種間線粒體DNAD-loop區(qū)序列差異百分比%

2.4 中甸牦牛與各牛種類群間的遺傳距離及系統(tǒng)進化分析

根據(jù)中甸牦牛和各牛種類群間線粒體DNA D-loop區(qū)堿基序列，用Mega 5.0軟件計算14個牛種間的遺傳距離（表5）。結(jié)果表明，14個牛種間的遺傳距離范圍在0～0.192之間，其中中甸牦牛和亞洲水牛的距離最大（0.179），與麥洼牦牛遺傳距離最短（0.006），這表明它們的親緣關(guān)系較近，麥洼牦牛是主要分布于四川省的優(yōu)良草地型地方品種，而中甸牦牛常年在云南高海拔草場上放牧生存，兩者均屬于家牦牛，推測因地理位置接壤可能存在基因交流，親緣關(guān)系上可能由共同的祖先進化而來。在其他牛種中，歐洲野牛與普通牛的遺傳距離最遠（0.186），天祝牦牛與青海牦牛的遺傳距離最短（0.001）。

根據(jù)各牛種間的遺傳距離，以山羊作為外類群，用鄰接法（NJ）構(gòu)建分子系統(tǒng)進化樹（圖2）。由圖2可知，牛亞科和外類群（山羊）分別各自聚為一類，牛亞科內(nèi)，亞洲水牛與其他物種各自聚為一類；中甸牦牛和麥洼牦牛聚在一起，再與九龍牦牛、大通牦牛、天祝牦牛和青海牦牛相聚，同屬于家牦牛的分支。中甸牦牛分布于云南省，而麥洼牦牛分布于四川省，兩地的距離較近，由此推測，兩者存在地理上的親緣關(guān)系或是基因交流。此外，野牦牛和西藏牦牛聚為一類，歐洲野牛和普通牛聚為一類，聚類結(jié)果與以往的動物分類學結(jié)果基本一致。

表5 牛亞科各牛種間Kimura雙參數(shù)遺傳距離

圖2 基于Kimura雙參數(shù)遺傳距離的各牛種類群間NJ系統(tǒng)進化關(guān)系

3 討論

遺傳多樣性是所有生物多樣性的重要組成部分，它是生物進化和物種分化的基礎(chǔ)［9］，也對種群維持繁衍和適應(yīng)生境變化具有重要意義。由于Cytb、l2S rRNA等線粒體編碼基因的變異過程較慢，常用來進行種以上等級的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系重建［10］，而mtDNA D-Loop區(qū)的序列變異則較快，因此被用來進行種以下水平的系統(tǒng)關(guān)系研究。通常動物mtDNA進化主要以核苷酸轉(zhuǎn)換為主，插入和缺失較少，核苷酸的轉(zhuǎn)換是插入和缺失的2～10倍，而在mtDNAD-Loop區(qū)核苷酸的轉(zhuǎn)換概率更是遠大于核苷酸插入和缺失的概率。家牦牛豐富的遺傳多樣性對我國乃至全世界牦牛產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展起著舉足輕重的作用。

目前對家牦牛的mtDNA D-loop區(qū)研究主要集中在四川牦牛和西藏牦牛上。賴松家等［5］運用測序技術(shù)測定了中國5個家牦牛品種的mtDNA D-loop區(qū)全序列，表明我國牦牛mtDNA D-loop單倍型類型豐富并有2個母系來源，分別是橫斷高山型和青藏高原型兩大生態(tài)類型；鐘金城等［11］和肖玉萍等［12］采用RAPD和AFLP標記對九龍牦牛、麥洼牦牛、大通牦牛和天祝白牦牛進行了分析，結(jié)果表明九龍牦牛的遺傳多樣性最為豐富，天祝白牦牛遺傳多樣性最低，4個牦牛品種聚為兩大類：九龍牦牛為一類，其他3個牦牛品種聚為一類，這與本研究聚類分析所得結(jié)論基本一致。鐘金城等［13］和柴志欣等［14］用RAPD引物對西藏11個牦牛群體進行研究，表明西藏牦牛類群內(nèi)部具有較多遺傳變異，推測西藏西部可能是牦牛的起源地之一。

本研究以動物mtDNAD-loop區(qū)為分子標記，對中甸牦牛mtDNAD-loop區(qū)進行序列分析，結(jié)果顯示，15頭中甸牦牛mtDNA D-loop區(qū)序列長度在890～910 bp之間，個體間差異較小。通過對中甸牦牛mtDNA D-loop區(qū)序列的比對分析，發(fā)現(xiàn)T、C、A、G四種堿基的平均含量為28.78%、24.41%、32.34%和14.47%，堿基組成偏好性明顯。中甸牦牛平均單倍型多樣性（Hd）為0.983 3，平均核苷酸多樣性（Pi）為0.005 34，序列變異存在堿基插入、缺失和替換，共有51個變異位點，其中15個插入或缺失位點，36個轉(zhuǎn)化或顛換位點，轉(zhuǎn)換/顛換（Ts/Tv）比1.77，表明中甸牦牛種內(nèi)遺傳多樣性豐富，這與田應(yīng)華等［15］利用微衛(wèi)星標記技術(shù)對中甸牦牛分析的結(jié)果一致，揭示中甸牦牛群體變異在中國牦牛地方群體中處于較高水平。

本研究對14個牛亞科部分牛種進行遺傳距離和系統(tǒng)進化分析，顯示中甸牦牛是我國家牦牛中的一個品種，與麥洼牦牛遺傳距離最近，為0.006，說明兩者關(guān)系較近，中甸牦牛產(chǎn)自云南省，而麥洼牦牛產(chǎn)自四川省，兩地的距離較近，并且中甸牦牛和麥洼牦牛同屬草地型牦牛，生活在高山草甸草場，因此推測兩者可能存在基因交流。所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，牛亞科中水牛屬最早分化出來，然后是印度野牛、歐洲野牛與普通牛、美洲野牛、家牦牛與野牦牛的分支；聚類分析結(jié)果表明，歐洲野牛與普通牛的親緣關(guān)系較近，另外美洲野牛與牦牛之間親緣關(guān)系較近，這與郭松長等［10］所得出的結(jié)果一致；系統(tǒng)進化樹還顯示，西藏牦牛和野牦牛是一個分支，這也和以往得出的的研究成果相同，現(xiàn)在的家養(yǎng)牦牛起源于我國的西藏，野牦牛則是家養(yǎng)牦牛的近緣野生種［16］。以牦牛化石作為考證，野牦牛與家牦牛都曾分布在歐亞大陸東北部，是原始牦牛的后代，由于地殼運動、氣候變化等原因遷移至我國青藏高原地區(qū)，并適應(yīng)了高寒、缺氧等生態(tài)環(huán)境從而生存下來，因此今天的家牦牛和野牦牛都由同一祖先進化而來，它們之間不存在祖先和后代的關(guān)系［17］。

目前對中甸牦牛的遺傳多樣性研究尚未見報道，本研究首次對中甸牦牛的遺傳多樣性和系統(tǒng)進化作了系統(tǒng)全面的研究。中甸牦牛是我國優(yōu)良地方家牦牛品種之一，是我國眾多牦牛類群中的一支，其群體遺傳變異程度較高，遺傳多樣性較豐富，該結(jié)果可為中甸牦牛遺傳資源的進一步保護、定向育種、開發(fā)和利用提供理論基礎(chǔ)。

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Analysis on Genetic Diversity and Phyletic Evolution of Mitochondrial DNA D-loop Region from Zhongdian Yak

Tu Shiying1，WangQi2，3，ZhongJincheng2，3，et al
（1.The Animal Health Supervision，Yunnan Province，Kunming650000，China；2.KeyLaboratoryofAnimal Genetics and BreedingofState Ethnic Affair Commission and MinistryofEduction，Chengdu 610041，China；3.Qinghai-Tibet Plateau College，Southwest Universityfor Nationalities，Chengdu 610041，China）

The Zhongdian yak mitochondrial D-loop area was cloned using a specific primers designed according to the mitochondrial DNA sequence of yak，which was then used for phylogenetic analysis combined with the mtDNA D-loop sequence of bovine typical cattle breeds，including Poephagus mutusc，Jiulong yak，Maiwa yak，Xizang yak，Tianzhu yak，Qinghai yak，Datong yak，Bison bison，Bison bonasus，Bison gaurus，Bubalus bubalis and Bos Taurus，with that of sheep as the exogenous reference.These data may be beneficial for our understanding the genetic diversity of Zhongdian yak，and put forward the theoretical foundation for the protection，development and utilization of genetic resources of Zhongdian yak.The results showed that，①Zhongdian yak mitochondrial D-loop area sequence length between 890～910 bp.T，C，A，G took the average content of 28.78%，24.41%，32.34%and 14.47%，respectively，and there was a certain base composition of bias；②a total of 13 Zhongdian yak haploid type with the average haploid typediversity（Hd）of 0.983 3，the average nucleotide diversity（Pi）of 0.005 34 was identified；③Zhongdian yak shared the minimum sequence distance with that ofMaiwa yak（0.000 6），and hit the maximum sequence distance on Asian buffalo（0.179），which was used the Kimura two-parameter genetic distance with known cattle mtDNA D-loop region sequences；④phylogenetic evolution analysis found that Zhongdian yak is an independent yak breeds，obtained the Maiwa yak into one group，and speculated that yak presence ofgene flowdue totheir location，it was evolved froma common ancestor.

Zhongdian yak；D-loop region；bovine；phylogeny

S823.8+5

A

2095-3887（2016）03-0005-06

2016-03-24

四川省科技計劃項目（2015JY0248）

涂世英（1968-），女，高級畜牧師。研究方向：牦牛生產(chǎn)學。

鐘金城（1963-），男，教授，博士。研究方向：動物遺傳學。