楊永霞，張嘉煒，張洪映，張松濤，賈宏昉，崔紅

國家煙草栽培生理生化研究基地 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州市文化路95號(hào) 450002

生物技術(shù)

過表達(dá)Lcy-b基因?qū)煵蓊惡}卜素代謝及香氣物質(zhì)的影響

楊永霞，張嘉煒，張洪映，張松濤，賈宏昉，崔紅

國家煙草栽培生理生化研究基地 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州市文化路95號(hào) 450002

為揭示類胡蘿卜素代謝關(guān)鍵基因番茄紅素β-環(huán)化酶基因（Lycopene beta-cyclase，Lcy-b）對(duì)類胡蘿卜素及香氣物質(zhì)代謝的影響，通過同源克隆法獲得煙草品種K326Lcy-b基因cDNA全長序列。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入煙草，測(cè)定Lcy-b過表達(dá)對(duì)類胡蘿卜素各組分及烤后樣香氣物質(zhì)含量的影響。序列分析表明：K326Lcy-b基因包含一個(gè)1503bp的開放讀碼框(ORF)，編碼500個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主，蛋白質(zhì)分子量為56.06KDa，理論等電點(diǎn)(pI)為6.98。部分過表達(dá)陽性植株Lcy-b基因的表達(dá)量顯著高于對(duì)照，類胡蘿卜素組分中的β-胡蘿卜素、新黃質(zhì)、紫黃質(zhì)比例增加，葉黃素所占比例降低。過表達(dá)植株烤后樣β-胡蘿卜素降解產(chǎn)物顯著高于對(duì)照，而葉黃素降解產(chǎn)物則低于K326對(duì)照或與對(duì)照相當(dāng)。研究結(jié)果說明Lcy-b過表達(dá)可以改變煙草類胡蘿卜素組分比例，影響烤后煙葉香氣物質(zhì)含量。

煙草；Lcy-b基因；過表達(dá); 類胡蘿卜素；香氣物質(zhì)

類胡蘿卜素是重要的光輔助色素，在光吸收和防止光氧化方面起著重要作用[1-2]。類胡蘿卜素是煙草許多生理活性物質(zhì)尤其是重要致香物質(zhì)的前體物，其降解產(chǎn)物的種類及含量與煙葉品質(zhì)有關(guān)[3]。在煙葉總揮發(fā)性香氣成分中，類胡蘿卜素降解產(chǎn)生的香味物質(zhì)是影響煙葉香氣質(zhì)和香氣量的重要組分[4]。關(guān)于煙草類胡蘿卜素的代謝途徑已有詳細(xì)綜述[5]，在類胡蘿卜素生物合成途徑中，番茄紅素可以在番茄紅素β-環(huán)化酶（LCY-b）和番茄紅素ε-環(huán)化酶（LCY-ε）的催化下發(fā)生環(huán)化作用，形成 β-胡蘿卜素（β分支）和α-胡蘿卜素（α分支）(見圖1)，這是類胡蘿卜素合成途徑中的關(guān)鍵分支點(diǎn)，α分支最終生成葉黃素，β分支最終生成紫黃質(zhì)、新黃質(zhì)等產(chǎn)物[6]。研究表明，Lcy-b基因編碼番茄紅素 β-環(huán)化酶，過表達(dá)Lcy-b基因煙草的耐鹽和耐旱能力提高[7-8]；過表達(dá)Lcy-b基因番茄的番茄紅素含量減少；Lcy-b轉(zhuǎn)錄后基因沉默則會(huì)導(dǎo)致Lcy-b基因表達(dá)下調(diào)、β-胡蘿卜素和葉黃素含量降低[9-10]。強(qiáng)光會(huì)誘導(dǎo)小麥Lcy-b基因強(qiáng)烈表達(dá)，β-胡蘿卜素含量增加[11]。而 α 支路編碼番茄紅素ε-環(huán)化酶的Lcy-ε基因被干擾時(shí)下游產(chǎn)物葉黃素明顯下降，處于 β 支路的 β-胡蘿卜素含量卻有所增長，植物的抗鹽性能力也提高[12]。對(duì)兩條支路關(guān)鍵基因的調(diào)控會(huì)影響支路（上）下游的物質(zhì)代謝,調(diào)控Lcy-b基因?qū)煵葜蓄惡}卜素降解產(chǎn)生的香氣物質(zhì)的影響未見相關(guān)報(bào)道。本研究從煙草品種 K326 中克隆了Lcy-b基因，采用in-fusion方法構(gòu)建Lcy-b基因過表達(dá)載體，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草植株，探討Lcy-b過表達(dá)對(duì)煙草香氣物質(zhì)代謝的影響，從而為調(diào)控?zé)煵蓊惡}卜素代謝，改善煙草香氣品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。

圖1 植物類胡蘿卜素合成途徑示意圖Fig.1 Schematic diagram carotenoid biosynthesis pathway in plants

1 材料和方法

1.1 Lcy-b基因的克隆及序列分析

1.1.1 Lcy-b基因的克隆

試驗(yàn)材料為煙草品種 K326，按照 Invitrogen 公司 TRIzol RNA提取方法及反轉(zhuǎn)錄說明書提取煙草葉片總 RNA ，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。參考 GenBank 收錄的煙草品種SamsunLcy-b基因序列（X81787.1），采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)煙草品種K326Lcy-b全長基因擴(kuò)增引物 F1/R1 (引物序列見表1)。PCR程序?yàn)椋?4℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 50 s，35個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物采用 1% 瓊脂糖凝膠電泳分離?；厥占兓笏?Invitrogen 公司測(cè)序。

1.1.2 Lcy-b基因的生物信息學(xué)分析

利用NCBI網(wǎng)站的BLAST和ORF finder進(jìn)行核苷酸序列比較和開放閱讀框分析。采用DNAstar和Expasy Protparam軟件推測(cè)該基因編碼的氨基酸序列、蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)。利用Conserved Domains和SMART軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能域預(yù)測(cè)。使用在線工具SOPMA進(jìn)行蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1.2 過表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因植株的獲得

采用in-fusion方法構(gòu)建Lcy-b基因過表達(dá)載體pCAMBIA-NPT-Lcy-b，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物F2/ R2 (表1)。引物的5’末端分別包含與載體末端相同的17/16個(gè)堿基序列，引物的3’末端包含與目的基因片段相互補(bǔ)的特異堿基序列。以測(cè)序正確的陽性菌落搖菌擴(kuò)繁后提取的pMD19-T-Lcy-b質(zhì)粒為模版，擴(kuò)增含有SpeI 和 EcoR I 酶切位點(diǎn)的 K326Lcy-b基因，用限制性內(nèi)切酶SpeI-HF和EcoR I-HF雙酶切pCAMBIA-NPT載體，回收目的片段后連接，得到pCAMBIA-NPT-Lcy-b過表達(dá)載體重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 DH5α，挑選陽性克隆，菌落 PCR 及測(cè)序正確后，凍融法將構(gòu)建好的pCAMBIA-NPT-Lcy-b過表達(dá)載體轉(zhuǎn)到農(nóng)桿菌LBA4404 中，在含有利福平、卡那霉素的 YEB固體培養(yǎng)基上篩選，菌落 PCR 鑒定后葉盤法浸染煙草品種K326葉片。共培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2～3 d后，用無菌水（含cef500）洗苗，在含有卡那霉素的分化培養(yǎng)基上進(jìn)行陽性篩選，待芽長到 1～2 cm時(shí)，移至含卡那霉素的生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，得到T0代幼苗。將幼苗移到營養(yǎng)土中培養(yǎng)。

1.3 轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)

1.3.1 轉(zhuǎn)基因植株DNA的PCR鑒定

采用CTAB法提取轉(zhuǎn)化苗及未轉(zhuǎn)基因?qū)φ諢熋鏒NA，以其為模板，用包含Lcy-b基因起始密碼子的引物F3和過表達(dá)載體序列的檢測(cè)引物R3進(jìn)行PCR驗(yàn)證，Lcy-b過表達(dá)質(zhì)粒DNA為陽性對(duì)照，未轉(zhuǎn)化植株葉片DNA為陰性對(duì)照，檢測(cè)T0代轉(zhuǎn)化苗中Lcy-b基因的轉(zhuǎn)化情況。

1.3.2 轉(zhuǎn)基因植株Lcy-b基因的表達(dá)分析

根據(jù) K326Lcy-b基因 cDNA 序列設(shè)計(jì)Real Time PCR引物F4/R4，轉(zhuǎn)基因葉片總RNA的反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，以煙草組成型表達(dá)的L25基因 (F5/R5)為內(nèi)參。參照Invitrogen公司的Real MasterMix(SYBR Green)試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR (Reverse Transcription Quantitative Real-Time PCR， RT-qPCR），每個(gè)樣品3次重復(fù)。RT-qPCR 數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt算法進(jìn)行分析，假設(shè)目的基因表達(dá)量是對(duì)照的N倍，N = 2-ΔΔCt，ΔΔCt = Treat(Ct樣品 - Ct L25) - CK(Ct樣品 - Ct L25)。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.4 煙葉質(zhì)體色素及香氣成分的檢測(cè)方法

將轉(zhuǎn)基因陽性株系的無菌苗進(jìn)行快繁，葉片剪成約1 cm2的小塊，置于分化培養(yǎng)基（MS+IAA0.1+BA1.5+Kan30）上28℃進(jìn)行培養(yǎng)，每15 d左右換一次培養(yǎng)基。待轉(zhuǎn)基因苗不定芽長到1～2cm 時(shí)，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基（MS+ Kan30+NAA0.1）上生根，生根后長出7～8片葉時(shí)轉(zhuǎn)移到含有育苗基質(zhì)的漂浮盤上進(jìn)行培養(yǎng)，之后將快繁后的T0代轉(zhuǎn)基因植株移栽至大田，以K326做對(duì)照，用于質(zhì)體色素和香氣成分的檢測(cè)。

1.4.1 煙葉質(zhì)體色素含量的檢測(cè)

在煙株旺長期和成熟期，取中部葉，-80℃冰箱冷凍后，用凍干機(jī)進(jìn)行冷凍干燥處理，參照中華人民共和國煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YC/T382-2010[13]煙草及煙草制品中質(zhì)體色素的高效液相色譜法測(cè)定。

1.4.2 烤后樣香氣成分的檢測(cè)

每個(gè)轉(zhuǎn)基因T0代株系選取煙株長勢(shì)、煙葉的葉色、葉片大小相對(duì)一致、成熟度基本相同的中部葉片，采用熱動(dòng)密集烤房，以三段式烘烤工藝煙夾掛桿烘烤。烘烤參數(shù)：變黃期36～42℃，36h；定色期42～55℃，50h；干筋期：55～72℃，50～60h。

烤后樣選取C3F煙葉，參考文獻(xiàn)[14]采用“水蒸氣蒸餾、二氯甲烷溶劑萃取”法進(jìn)行前處理，用HP5890II-5972氣質(zhì)連用儀對(duì)樣品采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定性分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，由新復(fù)極差法分析均值差異的顯著性, 顯著性水平P＜ 0.05，以a、b、c 、d和e表示其差異性，數(shù)字后不含有相同字母表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；采用Excel 2013 軟件繪圖制表。

2 結(jié)果與分析

2.1 Lcy-b基因的克隆及序列分析

2.1.1 Lcy-b基因的克隆

采用TRIzol RNA提取法獲得28S和18S比例較好的K326 RNA，同源克隆法得到1600 bp左右的片段（圖2），回收相應(yīng)片段，測(cè)序驗(yàn)證后獲得基因全長序列1525 bp。

圖2 Lcy-b擴(kuò)增電泳檢測(cè)圖Fig.2 PCR amplification of Lcy-b

2.1.2 Lcy-b 基因的生物信息學(xué)分析

對(duì)克隆獲得的序列進(jìn)行ORF finder分析，該序列包含5’端 UTR 2 bp，3’端 UTR 20 bp，含有一個(gè)1503 bp的完整開放讀碼框(ORF)，GC含量為 41.25 %。與NCBI收錄的煙草品種Samsun（X81787.1）和Virginia Gold#1（KC484706）Lyc-b基因相似性均為 99%，僅有一個(gè)堿基的差異，證明該序列為 K326Lyc-b基因。生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)該序列編碼500個(gè)氨基酸，其中堿性氨基酸 (Arg、Lys) 57個(gè)，強(qiáng)酸性氨基酸 (Asp,Glu) 59個(gè)，蛋白質(zhì)分子量為 56.06KDa，理論等電點(diǎn) (pI) 為6.98。應(yīng)用 Conserved Domains 在線分析軟件預(yù)測(cè)該基因編碼的蛋白含有 LCY-b蛋白家族保守結(jié)構(gòu)域。詳見圖3。

圖3 LCY-b蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Protein domain analysis of LCY-b

蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，K326 LCY-b蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有 35% 的 α 螺旋、21.8%的延伸鏈、9.4%的 β 折疊，33.8 % 的無規(guī)則卷曲。 LCY-b蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以α 螺旋和無規(guī)則卷曲為主。

2.2 轉(zhuǎn)基因煙草植株的陽性檢測(cè)

當(dāng)轉(zhuǎn)化苗長到8～10片葉時(shí)，提取全基因組DNA，以Lcy-b基因檢測(cè)引物F3/ R3進(jìn)行PCR檢測(cè)，有6個(gè)株系擴(kuò)增片段長度符合預(yù)期大?。?909 bp，其中包含基因全長序列1503 bp，過表達(dá)載體序列406 bp）（如圖4）。提取轉(zhuǎn)基因陽性植株葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，應(yīng)用RT-qPCR分析Lcy-b基因的表達(dá)，六個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中2、3、5Lcy-b基因表達(dá)量顯著高于K326對(duì)照，株系4、6表達(dá)量顯著低于K326對(duì)照，這可能是由于轉(zhuǎn)基因插入位點(diǎn)的隨機(jī)性，插入位點(diǎn)破壞了內(nèi)源基因的完整性，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)源基因表達(dá)量降低（如圖5）。

圖4 轉(zhuǎn)基因植株的DNA檢測(cè)Fig.4 DNA detection of transgenic plants

圖5 Lcy-b過表達(dá)株系的基因表達(dá)檢測(cè)Fig.5 Expression analysis of Lcy-b in transgenic plants

2.3 轉(zhuǎn)基因株系的類胡蘿卜素含量及烤后樣中性致香物分析

選取過表達(dá)成功的轉(zhuǎn)基因株系2、3、5，檢測(cè)生長發(fā)育過程中轉(zhuǎn)基因煙株中部葉的類胡蘿卜素含量，測(cè)定烤后樣中性致香物含量。

2.3.1 類胡蘿卜素含量變化

由圖6可知，除轉(zhuǎn)基因株系3外，旺長期轉(zhuǎn)基因各株系類胡蘿卜素總量顯著高于未轉(zhuǎn)基因?qū)φ?，成熟期差異不顯著。從類胡蘿卜素各組分來看，旺長期轉(zhuǎn)基因中β-胡蘿卜素、新黃質(zhì)、紫黃質(zhì)含量均高于K326，株系2和5均達(dá)顯著水平。旺長期葉黃素含量株系2差異不明顯，株系3顯著低于對(duì)照。成熟期轉(zhuǎn)基因株系3葉黃素含量顯著低于K326對(duì)照，其余株系類胡蘿卜素各組分與K326差異不顯著。

圖6 轉(zhuǎn)基因株系類胡蘿卜素含量Fig.6 Carotenoid contents in transgenic plants

2.3.2 類胡蘿卜素組分變化比較

類胡蘿卜素各組分分析結(jié)果如圖7所示，在旺長期，各株系β-胡蘿卜素/葉黃素、紫黃質(zhì)/葉黃素和新黃質(zhì)/葉黃素均顯著高于CK。成熟期，β-胡蘿卜素/葉黃素、新黃質(zhì)/葉黃素與CK差異不明顯，株系2和3的紫黃質(zhì)/葉黃素顯著高于CK。結(jié)合對(duì)類胡蘿卜素各組分含量的分析結(jié)果可知，Lcy-b基因的過表達(dá)提高了類胡蘿卜素中β-胡蘿卜素、新黃質(zhì)、紫黃質(zhì)的組分比例和含量；此外，過表達(dá)株系葉黃素含量雖然總體變化不明顯，但是由于類胡蘿卜素其它組分增加，導(dǎo)致葉黃素在類胡蘿卜素組分中所占的比例降低。

圖7 轉(zhuǎn)基因株系類胡蘿卜素組分變化Fig.7 Carotenoid component changes in transgenic plants

2.3.3 烤后樣中性致香物含量測(cè)定

香氣物質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系5烤后樣中性致香物總量和新植二烯含量顯著高于K326對(duì)照，其余株系差異不顯著；棕色化反應(yīng)產(chǎn)物與對(duì)照相比差異均不顯著；苯丙氨酸類香氣成分均顯著低于K326對(duì)照；類西柏烷類香氣成分株系2顯著高于K326，株系5與K326含量相當(dāng)，株系3顯著低于K326。類胡蘿卜素降解產(chǎn)物總量株系2和株系5顯著高于K326對(duì)照。

煙葉中β-胡蘿卜素主要降解產(chǎn)物有β-二氫大馬酮、香葉基丙酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、β-環(huán)檸檬醛、藏花醛等[4]，其中前四種物質(zhì)含量較多，香氣貢獻(xiàn)大，本研究中將其作為β-胡蘿卜素代表產(chǎn)物進(jìn)行分析；葉黃素主要降解產(chǎn)物為巨豆三烯酮（4種同分異構(gòu)體）、β-大馬酮和氧化異佛爾酮等[4]，其中巨豆三烯酮和β-大馬酮含量最多，由于β-大馬酮是葉黃素和新黃質(zhì)的共同降解產(chǎn)物，本研究中將巨豆三烯酮作為葉黃素代表產(chǎn)物。如圖8所示，轉(zhuǎn)基因株系中類胡蘿卜素降解產(chǎn)物組分有所變化，株系2和5中β-胡蘿卜素降解產(chǎn)物代表產(chǎn)物總量顯著高于K326，而轉(zhuǎn)基因株系中葉黃素降解產(chǎn)物代表物質(zhì)總量與K326相當(dāng)。

圖8 轉(zhuǎn)基因株系香氣物質(zhì)含量Fig.8 Content of aroma substances in transgenic plants

3 結(jié)論與討論

Lyc-b基因是煙葉類胡蘿卜素合成途徑β-分支中合成β-胡蘿卜素、紫黃質(zhì)、新黃質(zhì)的關(guān)鍵基因，其中β-胡蘿卜素由γ-胡蘿卜素在Lcy-b基因作用下直接形成，推測(cè)Lyc-b基因的過表達(dá)會(huì)影響煙葉類胡蘿卜素合成途徑中β-支路上相關(guān)產(chǎn)物的合成，使β-胡蘿卜素、紫黃質(zhì)、新黃質(zhì)含量提高，導(dǎo)致類胡蘿卜素組分的變化?；诖思僭O(shè)，本研究采用同源克隆法克隆了煙草Lcy-b基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)K326Lcy-b基因包含一個(gè)1503 bp的開放讀碼框(ORF)，與香料煙巴斯瑪和烤煙弗吉尼亞品種的Lcy-b基因僅有一個(gè)堿基的差異，該基因編碼500個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量分別為56.06 KDa，理論等電點(diǎn)(pI)為6.98。蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主。過表達(dá)Lcy-b基因煙草植株的熒光定量PCR結(jié)果顯示，株系2、3、5 的Lcy-b基因表達(dá)量顯著提高，并在旺長期相應(yīng)的提高了類胡蘿卜素總量及β-分支代謝產(chǎn)物β-胡蘿卜素、新黃質(zhì)、紫黃質(zhì)的含量及組分比例，其中對(duì)β-胡蘿卜素含量的影響最為顯著，而 α-分支代謝產(chǎn)物葉黃素的含量（及組分比例）不變或者減少。已有的研究表明，植物通過控制LCY-b和LCY-ε兩種環(huán)化酶的相對(duì)數(shù)量以及相對(duì)活性來調(diào)節(jié)不同具環(huán)類胡蘿卜素的數(shù)量、組分及種類[15]，而LCY-b酶在兩條環(huán)化途徑中起主導(dǎo)作用[16-17]，植物中過表達(dá)Lcy-b基因可能會(huì)導(dǎo)致番茄紅素含量減少， α-分支LCY-ε底物量減少，進(jìn)而影響下游代謝產(chǎn)物葉黃素的含量。對(duì)烤后樣香氣成分的分析表明，Lcy-b基因過表達(dá)株系的β-胡蘿卜素降解產(chǎn)物β-二氫大馬酮、β-環(huán)檸檬醛、香葉基丙酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯等明顯增加。而葉黃素降解產(chǎn)物巨豆三烯酮（四種同分異構(gòu)體）含量降低或者無顯著變化。證實(shí)Lcy-b基因過表達(dá)可以改變類胡蘿卜素合成途徑β-分支和α-分支代謝產(chǎn)物的比例，進(jìn)而影響烤后樣類胡蘿卜素類降解產(chǎn)物香氣物質(zhì)的含量。本研究還發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Lcy-b基因?qū)νL期類胡蘿卜素含量影響較大，而對(duì)成熟期影響較小，結(jié)合對(duì)烤后樣類胡蘿卜素降解產(chǎn)物的分析結(jié)果，可以推測(cè)，與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾?，成熟期轉(zhuǎn)基因煙草植株的類胡蘿卜素降解更為充分，可能與轉(zhuǎn)基因植株復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后時(shí)空調(diào)控有關(guān)。

[1] Giuliano G, Tavazza R, Diretto G, et al. Metabolic Engineering of Carotenoid Biosynthesis in Plants[J]. Trends Biotechnol, 2008,26(3): 139-145.

[2] Tracewell C A, Cua A, Stewart D H, et al. Characterization of Carotenoid and Chlorophyll Photooxidation in Photosystem Ⅱ [J].Biochemistry, 2001,40(1): 193-203.

[3] Maldonado-Robledo G, Rodriguez-Bustamante E, Sanchez-Contreras A, et al. Production of Tobacco Aroma from Lutein.Specific Role of the Microorganisms Involved in the Process[J].Appl Microbiol Biot, 2003,62(5/6): 484-488.

[4] 史宏志，劉國順，楊慧娟，等. 煙草香味學(xué) [M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社，2011:137-144.SHI Hongzhi, LIU Guoshun, YANG Huijuan, et al. Tobacco flavor[M]. Beijing: China Agriculture Press,2011: 137-144. (in Chinese)

[5] 楊永霞，馮琦，王景，等. 煙草類胡蘿卜素代謝的遺傳及基因工程研究進(jìn)展[J].中國煙草學(xué)報(bào). 2013，19(1): 90-94.YANG Yongxia, FENG Qi, WANG Jing, et al. Recent advances in tobacco carotenoid metabolism researchand its application in genetic engineering[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2013, 19(1): 90-94.(in Chinese)

[6] Cazzonelli C I, Pogson B J. Source to sink: regulation of carotenoid biosynthesis in plants[J]. Trends Plant Sci. 2010, 15, 266-274.

[7] Shi Y, Guo J, Zhang W, et al. Cloning of the Lycopene beta-cyclase Gene in Nicotiana tabacum and Its Overexpression Confers Salt and Drought Tolerance[J]. Int J Mol Sci, 2015, 16(12): 30438-30457.

[8] Chen X Y, Han H P, Jiang P, et al. Transformation of β-lycopene

cyclase genes from Salicornia europaea and Arabidopsis conferred salt tolerance in Arabidopsis and tobacco[J]. Plant Cell Physiol.2011, 52, 909-921.

[9] Rosati C, Aquilani R, Dharmapuri S, et al. Metabolic engineering of beta-carotene and lycopene content in tomato fruit［J］. Plant Journal, 2000, 24(3): 413-419.

[10] Guo F, Zhou W, Zhang J, et al. Effect of the Citrus Lycopene β-Cyclase Transgene on Carotenoid Metabolism in Transgenic Tomato Fruits[J]. PLoS ONE, 2012, 7, e32221.

[11] Zeng Jian, Wang Cheng, Chen Xi, et al. The lycopene β-cyclase plays a significant role in provitamin A biosynthesis in wheat endosperm [J]. BMC Plant Biol, 2015,15:112.

[12] Kim S H，Kim Y H，Ahn Y O, et al. Downregulation of the lycopene epsilon-cyclase gene increases carotenoid synthesis via the beta-branch-specific pathway and enhances salt-stress tolerance in sweetpotato transgenic calli. Physiol Plant, 2013, 147(4): 432-442.

[13] YC/T382-2010, 煙草及煙草制品, 質(zhì)體色素的測(cè)定, 高效液相色譜法[S].YC/T382-2010, Tobacco and tobacco products, Determination of plastid pigments, High performance liquid chromatography method[S]. (in Chinese)

[14] 秦衛(wèi)普，趙銘欽，瞿永生，等. 不同基因型烤煙煙葉質(zhì)體色素及其降解產(chǎn)物含量的研究[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，21(11):17-19.QIN Weipu, ZHAO Mingqin, Qu Yongsheng, et al. Study on chromoplast pigment and its degraded products contents in different genotypes of flue-cured tobacco[J]. Acta Agriculturae Jiangxi,2009, 21(11):17-19. (in Chinese)

[15] 梁燕,王鳴,陳杭,等. 植物L(fēng)YCs的特性功能及其相互關(guān)系[J].西北植物學(xué)報(bào), 2002, 22(4): 993 -998.Liang Yan, Wang Ming, Chen Hang, et al. The Characteristics Functions and Relationships of LYCs in Plant. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica. 2002, 22(4): 993-998. (in Chinese)

[16] Cunningham F X Jr，Gantt E．Genes and enzymes of carotenoid biosynthesis in plants．[J].Plant Mol Biol，1998,49:557-583.

[17] 張建成, 劉和. 植物類胡蘿卜素生物合成及其調(diào)控與遺傳操作[J]. 植物農(nóng)學(xué)通訊, 2007, 23(11): 211-218.Zhang Jiancheng, Liu He. Recent Advances in Carotenoid Biosynthesis, Regulation and Manipulation. Acta Agric Sci Bull,2007, 23(11):211-218. (in Chinese)

Effects of overexpression lycopene beta-cyclase gene on carotenoids metabolism and aroma compounds in tobacco

YANG Yongxia, ZHANG Jiawei, ZHANG Hongying, ZHANG Songtao, JIA Hongfang, CUI Hong
National Tobacco Cultivation, Physiology & Biochemistry Research Centre; College of Tobacco Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou, 450002, China

In order to reveal function of lycopene beta-cyclase (Lcy-b) gene in the growth and development of tobacco plants, especially its influence on aroma substance metabolism, full-length cDNA sequence ofLcy-bwas cloned from tobacco variety K326 homology cloning strategy and effects of overexpression of lycopene beta-cyclase gene on carotenoid components and aroma compounds were determined by agrobacterium-mediated transformation. Sequences analysis showed that tobaccoLcy-bcontained 1503-bp open reading frame (ORF) and coded 500 amino acid residues, the calculated molecular mass was 56066.12Da with theoretical isoelectric point (pI) of 6.98. Secondary structure prediction results showed that they were mainly made up of alpha helix and random coil. The expression ofLcy-bgene was significantly higher in some of the transgenic positive plants than that of K326 untransformed control. Correspondingly, the proportion of beta-carotene, neoxanthin and violaxanthin increased and the proportion of lutein reduced. Aroma substance in the cured leaves also displayed that the amounts of beta-carotene degradation products were significantly higher in transgenic positive plants than that of K326 untransformed control while the lutein degradation products were equivalent to or lower than that of K326 control. These results showed thatLcy-bcould change the proportion of carotenoid components and affect the content of aroma components in cured samples.

tobacco;Lcy-bgene; overexpression; carotenoids; aroma compounds

楊永霞，張嘉煒，張洪映，等. 過表達(dá)Lcy-b基因?qū)煵蓊惡}卜素代謝及香氣物質(zhì)的影響[J]. 中國煙草學(xué)報(bào)，2016,22（3）

中國煙草總公司特色優(yōu)質(zhì)煙葉開發(fā)重大專項(xiàng)濃香型項(xiàng)目（110200902045 TS-01）

楊永霞（1980—），博士，講師，主要從事煙草生物技術(shù)研究，Email:yyx624@126.com

崔 紅（1966—），教授，主要從事煙草生物技術(shù)研究，Email:cuihonger_13@163.com

2016-03-02

:YANG Yongxia, ZHANG Jiawei, ZHANG Hongying, et al. Effects of overexpression lycopene beta-cyclase gene on carotenoids metabolism and aroma compounds in tobacco [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016, 22(3)