張 宇 鞏珊珊 柴龍會(huì) 張晶鈺 肖向紅

(東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，哈爾濱，150040)

東北林蛙GSK3β基因熒光定量PCR引物篩選體系的建立

張 宇 鞏珊珊 柴龍會(huì) 張晶鈺 肖向紅*

(東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，哈爾濱，150040)

稿件運(yùn)行過程

GSK3β；熒光定量PCR；引物

為探究低溫條件下東北林蛙(Ranadybowskii)肝臟中GSK3β基因表達(dá)量變化，需利用熒光定量PCR(Fluorescence quantitative real-time PCR)對(duì)GSK3β基因表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，而在此過程中PCR引物的篩選直接影響到檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性與真實(shí)性。本實(shí)驗(yàn)以東北林蛙為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，基于本研究組前期獲得的東北林蛙轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，并參考其他物種GSK3β基因，利用Beacon Designer 7軟件設(shè)計(jì)了6對(duì)引物，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，篩選出1對(duì)GSK3β基因熒光定量PCR引物(F- TCCTACATCTGCTCTCGGTA，R- ACATCTATGCTGGAGGTATAATCA)，其擴(kuò)增效率為E=99.3%、R2=0.998，可用于東北林蛙GSK3β基因?qū)崟r(shí)表達(dá)量的研究。

東北林蛙廣泛分布在中國(guó)東北三省亞寒帶地區(qū)和內(nèi)蒙古地區(qū)[1]，作為典型耐寒兩棲類，其抗凍保護(hù)機(jī)制具有重要研究?jī)r(jià)值。楊翠軍等研究結(jié)果顯示，東北林蛙在低溫狀態(tài)下可通過降低糖原含量來提高血糖從而達(dá)到抗凍目的[2-3]。GSK3β作為胰島素信號(hào)通路重要磷酸化酶，在整個(gè)糖代謝過程中起到承上啟下的作用。Dieni等人通過免疫蛋白印跡法(Western blot)證實(shí)低溫使美洲木蛙(Ranasylvatica)體內(nèi)GSK3β基因磷酸化能力增強(qiáng)，與底物發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng)從而抑制糖原合成酶GS(Glycogen synthetase)活性，使蛙體內(nèi)血糖維持在較高水平[4]。東北林蛙體內(nèi)是否存在GSK3β基因且其在蛙耐凍過程中扮演著何種角色更具研究意義。為了確保檢測(cè)GSK3β基因mRNA表達(dá)量變化的數(shù)據(jù)結(jié)果真實(shí)有效[5]，本實(shí)驗(yàn)以東北林蛙為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，基于本研究組前期獲得的東北林蛙轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，并參考其他物種GSK3β基因，利用Beacon Designer 7軟件設(shè)計(jì)出多對(duì)引物，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，篩選出1對(duì)或數(shù)對(duì)擴(kuò)增效果好的GSK3β基因熒光定量PCR引物，旨在為測(cè)定東北林蛙mRNA實(shí)時(shí)表達(dá)量的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

東北林蛙，2～3齡成年雄性3只，2014年10月采于黑龍江省哈爾濱方正縣地區(qū)，室溫暫養(yǎng)1周后備用。

1.2 方法

1.2.1 東北林蛙組織取樣

對(duì)東北林蛙進(jìn)行雙毀髓處死，并迅速分離肝臟組織，加入樣品保存液(寶生物工程公司)放入液氮中待完全冰凍后移入-80℃冰箱進(jìn)行保存以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 GSK3β熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)

基于本研究組前期獲得的東北林蛙轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，并與NCBI Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中非洲爪蟾(Xenopus laevis)GSK3β核酸序列進(jìn)行比對(duì)得出保守序列，使用軟件Beacon Designer 7設(shè)計(jì)用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的引物6對(duì)及內(nèi)參引物GAPDH 1對(duì)(表1)。

表1 GSK3β基因熒光定量PCR備選引物序列

1.2.3 總RNA提取與cDNA的合成

按照TRIZOL?Reagent說明書，提取東北林蛙肝臟總RNA，瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其完整性和濃度。用于PCR反應(yīng)的cDNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(Takara，日本)進(jìn)行。將所得逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液即cDNA樣品放置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)及電泳檢查引物

按照2×Taq Master Mix說明書，以反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)所獲cDNA為模板進(jìn)行PCR試驗(yàn)。PCR擴(kuò)增獲得所需片段，電泳檢測(cè)其條帶質(zhì)量，切膠回收進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.5 熒光定量PCR檢測(cè)引物及最適退火溫度

熒光定量PCR以CFX96TM Real-Time System(Bio-Rad，美國(guó))為實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，使用10倍稀釋的上述cDNA樣品為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(Fluorescence quantitative PCR standard curve)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立篩選機(jī)制，并根據(jù)熔解曲線(Fluorescence quantitative PCR melting curve)峰值的單一性確定引物的特異性進(jìn)而確定熒光定量PCR最適引物。

2 結(jié)果

2.1 總RNA的提取

通過紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所提取的東北林蛙肝臟組織總RNA的OD值及樣品濃度，結(jié)果顯示各樣品OD260nm/OD280nm均在1.8～2.0之間。用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA質(zhì)量可見28S、18S、5SRNA清晰條帶(圖1)，說明樣本無(wú)蛋白質(zhì)污染，RNA沒有降解，質(zhì)量符合試驗(yàn)要求，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 東北林蛙肝臟組織總RNA電泳圖Fig.1 Results of total RNA in liver of Rana dybowskii

2.2 東北林蛙肝臟GSK3β引物RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

使用400 ng東北林蛙肝臟總RNA進(jìn)行擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)得出的6對(duì)引物進(jìn)行編碼，可見6對(duì)引物(1號(hào)～6號(hào))中有4對(duì)引物(2號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、6號(hào))出現(xiàn)明亮清晰條帶，說明東北林蛙肝臟組織中存在GSK3β基因，而1號(hào)引物出現(xiàn)多條條帶，推測(cè)引物特異性不強(qiáng)或存在引物二聚體；3號(hào)引物條帶不明顯推測(cè)引物擴(kuò)增出條帶濃度較低(圖2)。且2號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)引物得出條帶長(zhǎng)度與設(shè)計(jì)引物時(shí)片段大小相吻合，經(jīng)測(cè)序得出條帶的核苷酸序列與高通量測(cè)序與Genebank里的對(duì)比得出的保守序列一致。條帶單一、無(wú)引物二聚體及雜帶的特異性引物(2號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、6號(hào))均初步滿足后續(xù)熒光定量PCR的條件。

圖2 RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 RT-PCR results

2.3 東北林蛙肝臟GSK3β引物標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，2號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)引物初步滿足熒光定量PCR GSK3β基因所需特異性引物的條件，實(shí)時(shí)熒光定量PCR繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線由CFX Manager軟件(Bio-Rad，美國(guó))輸出如下(圖3)。

圖3 東北林蛙肝臟GSK3β引物標(biāo)準(zhǔn)曲線(橫坐標(biāo)為初始模板量Log值，縱坐標(biāo)為循環(huán)值)Fig.3 Standard curve of GSK3β in liver of Rana dybowskii

①GSK3β 2號(hào)引物標(biāo)準(zhǔn)曲線：Slope=0.429y-int=12.699(E=-99.5%，R2=0.001)

②GSK3β 4號(hào)引物標(biāo)準(zhǔn)曲線：Slope=-3.645y-int=37.841(E=99.3%，R2=0.998)

③GSK3β 5號(hào)引物標(biāo)準(zhǔn)曲線：Slope=-4.015y-int=48.894(E=77.4%，R2=0.984)

④GSK3β 6號(hào)引物標(biāo)準(zhǔn)曲線：Slope=-4.331y-int=57.448(E=70.2%，R2=0.986)

可見4號(hào)引物擴(kuò)增效率為E=99.3%，且R2=0.998均滿足引物擴(kuò)增最佳條件。

標(biāo)準(zhǔn)曲線中擴(kuò)增效率及相關(guān)系數(shù)的計(jì)算結(jié)果可看出4號(hào)引物最符合實(shí)驗(yàn)要求，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。隨即觀察4號(hào)引物熔解曲線，發(fā)現(xiàn)其峰值單一，熔解溫度為81.0℃，結(jié)果表明4號(hào)引物沒有產(chǎn)生GSK3β mRNA的非特異性擴(kuò)增及引物二聚體，實(shí)驗(yàn)中的熒光值均來自于特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物。

3 討論

自1996年熒光定量PCR被美國(guó)Applied Biosystems作為一種新定量技術(shù)推出后，因其特異性強(qiáng)，自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)被廣泛利用[6-7]，該技術(shù)涉及病毒細(xì)菌、動(dòng)植物和人的基因篩選檢測(cè)及食品安全監(jiān)測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域的研究[8-11]。熒光定量分子識(shí)別的高度準(zhǔn)確性及靈密度高、數(shù)碼顯像的自動(dòng)生成、操作簡(jiǎn)單已成為了熒光定量PCR的優(yōu)點(diǎn)[12]。為了對(duì)東北林蛙體內(nèi)GSK3β基因變化量進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析，且由于該熒光體系中PCR引物的篩選直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，有必要建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物篩選的反應(yīng)體系。本實(shí)驗(yàn)通過逆轉(zhuǎn)錄PCR與熒光定量PCR相結(jié)合的方法，對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR分析東北林蛙肝臟中GSK3β基因表達(dá)量的引物進(jìn)行篩選，實(shí)驗(yàn)中通過逆轉(zhuǎn)錄PCR篩選去除在凝膠系統(tǒng)顯示中有雜帶，擴(kuò)增效率低的備選引物1號(hào)和3號(hào)，將PCR條帶進(jìn)行膠回收并測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析比對(duì)得出符合條件的引物2號(hào)、4號(hào)、5號(hào)與6號(hào)，通過熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)建立GSK3β引物標(biāo)準(zhǔn)曲線可獲得各對(duì)引物擴(kuò)增效率E值與R2，且引物需滿足E值在90%～110%之間，R2>0.98的條件，4號(hào)引物符合此條件；根據(jù)熔解曲線對(duì)該引物進(jìn)行特異性分析，最終選取特異性強(qiáng)且擴(kuò)增效率高的4號(hào)引物，建立了更加完善的東北林蛙GSK3β基因熒光定量PCR引物篩選體系。本實(shí)驗(yàn)通過逆轉(zhuǎn)錄PCR首先篩選得到的引物雖可擴(kuò)增出目的條帶，且測(cè)序結(jié)果均為GSK3β基因序列，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示可擴(kuò)增出目的條帶的引物在熒光定量PCR中擴(kuò)增效率不高，可見引物的篩選不能簡(jiǎn)單地通過逆轉(zhuǎn)錄PCR進(jìn)行篩選，還需進(jìn)一步通過熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線與熔解曲線的建立來進(jìn)一步檢測(cè)引物的擴(kuò)增效率與實(shí)用性。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)東北林蛙肝臟GSK3β引物篩選來提高實(shí)時(shí)定量PCR中該基因表達(dá)量變化數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，為東北林蛙基因?qū)崟r(shí)表達(dá)量的研究提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

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GSK3-beta；Fluorescence quantitative real-time PCR；Primers

Selection of Primers and Development of a GSK3 BetaReaction System for Rana dybowskii

Zhang Yu Gong Shanshan Chai LonghuiZhang Jingyu Xiao Xianghong*

(College of Wildlife Resources，Northeast Forestry University，Haerbin，150040，China)

In order to further explore the condition of GSK3-beta mRNA expression volume change inRanadybowskii’sliver at low temperature，we need to use the realtime fluorescent quantitative PCR (RTQF-PCR) to test the amount of GSK3-beta gene expression，and the process of PCR primers screening directly affects the authenticity and accuracy of test results.Based on the transcriptome database ofRanadybowskii，and using GSK3 beta gene of other species as reference，we designed 6 pairs of primers using the software Beacon Designer 7.These primer-pairs were screened by RT-PCR and Real-time fluorescent quantitative PCR.One pair of fluorescence quantitative PCR primers (F-TCCTACATCTGCTCTCGGTA，R-ACATCTATGCTGGAGGTATAATCA)for the GSK3 beta gene was selected.The amplification efficiency wasE=99.3%，andR2=0.998.The pair of primers can be used for research on GSK3 beta gene expression byRanadybowskii.

2016-04-20

修回日期：2016-05-10

發(fā)表日期：2016-08-10

Q959.6

A

2310-1490(2016)03-242-04

國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心建設(shè)專項(xiàng)，國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30870301)，黑龍江省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(ZJN0604-02)

張宇，女，26歲，碩士研究生；主要從事分子生物學(xué)研究。

*通訊作者：肖向紅，E-mail：xiaoxh2010@sina.com