陳希++趙建華

[摘要] 目的 研究消化道腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶P53、bcl-2、survivin與化療藥敏性的關(guān)系。 方法 選擇62例消化道惡性腫瘤患者的原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的腫瘤組織，進行四氮唑鹽（MTT）法原代細胞培養(yǎng)體外化療藥敏性實驗，對腫瘤細胞對順鉑（DDP）、長春新堿（VCR）、紫杉醇（PTX）、甲氨蝶吟（MTX）4種常用化療藥物的體外化療藥敏性進行檢測，并采用免疫組織化學(xué)法（SP）對原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶中的P53、bcl-2、survivin的表達進行檢測。 結(jié)果 P53與bcl-2在原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶間的表達呈顯著相關(guān)性（P<0.05），而survivin無顯著相關(guān)性（P>0.05）。DDP、VCR、MTX對轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細胞抑制率顯著低于原發(fā)灶（P<0.05），而PTX在原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶對腫瘤細胞的抑制情況無顯著差異（P>0.05）；原發(fā)灶中的化療藥物抑制率均與P53、bcl-2、survivin不相關(guān)（P>0.05）；而在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中，P53與DDP對腫瘤細胞的抑制率呈負相關(guān)（P<0.05），survivin及bcl-2均與PTX抑制率呈負相關(guān)（P<0.05）。 結(jié)論 消化道腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中P53、bcl-2、survivin的表達情況及化療藥敏性均體現(xiàn)出異質(zhì)性，術(shù)后化療應(yīng)盡量避免化療靶目標(biāo)的偏差，以提升癌癥綜合治療的效果。

[關(guān)鍵詞] 消化道腫瘤；淋巴結(jié)；凋亡抑制蛋白；化療藥敏性

[中圖分類號] R735 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）25-0012-03

Research of relationship between expression of P53， bcl-2， survivin and chemosensitivity in lymph node metastases of gastrointestinal tumors

CHEN Xi ZHAO Jianhua

Department of Oncology， the First Peoples Hospital of Jingdezhen City in Jiangxi Province， Jingdezhen 333000， China

[Abstract] Objective To explore the relationship between expression of P53， bcl-2， survivin and chemosensitivity in lymph node metastases of gastrointestinal tumors. Methods The tumor tissue and metastasis lymph nodes of 62 patients with gastrointestinal tumors were collected， and the tumor cells chemosensitivity to DDP， VCR， PTX， MTX were detected by MTT assay，meanwhile the expression of P53， bcl-2 and survivin in primary tumors and lymph node metastases were detected by immunohistochemically. Results The expression of P53 and bcl-2 in primary tumors and lymph node metastases were significant correlation（P<0.05），while survivin were not（P>0.05）. The inhibition of tumor cells of DDP， VCR， MTX in lymph node metastases were significantly lower than those in primary tumors（P<0.05）， while PTX were not（P>0.05）. There were no correlation between expression of P53， bcl-2， survivin and inhibition rate of tumor cells（P>0.05）， but in lymph node metastases，the expression of P53 was negative correlation with inhibition rate of tumor cells for DDP inhibition（P<0.05）， and both of survivin and bcl-2 were negative correlation for PTX（P<0.05）. Conclusion The expression of P53， bcl-2， and survivin chemosensitivity in lymph node metastases of gastrointestinal tumors are different from primary tumors， so it is necessary to avoid the deviation of chemotherapy target postoperative as far as possible to improve the comprehensive curative effect.

[Key words] Gastrointestinal tumors； Lymph node； Apoptosis inhibiting protein； Chemosensitivity

消化系統(tǒng)惡性腫瘤在我國各類系統(tǒng)腫瘤的發(fā)病率中占首位，其中胃癌、食管癌、結(jié)直腸癌、肝癌的死亡總數(shù)占前10位，在惡性腫瘤中的比例占到40.75%[1]。術(shù)后輔助化療是治療消化道惡性腫瘤的重要手段。研究表明，多數(shù)化療藥物抗腫瘤的機制都是通過對凋亡相關(guān)基因或腫瘤細胞DNA發(fā)揮作用、誘導(dǎo)細胞凋亡來實現(xiàn)的[2，3]。然而化療藥物誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡卻會受凋亡抑制蛋白的抑制作用，產(chǎn)生多藥耐藥（multi-drug resistance，MDR）表型，從而嚴重影響化療的效果。P53是一種重要的凋亡調(diào)節(jié)基因，bcl-2與survivin是兩種新發(fā)現(xiàn)的耐藥基因蛋白。本研究對消化道腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶P53、bcl-2、survivin與化療藥敏性的相關(guān)性進行了探討，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料

選擇2015年1月～2016年5月的62例消化道惡性腫瘤并伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，疾病診斷均經(jīng)手術(shù)及病理證實，排除術(shù)前放、化療者。其中男35例，女27例；年齡29～78歲，平均（59.44±4.16）歲；胃癌28例，食管癌17例，大腸癌17例。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理要求，且取得所有患者的知情同意。

1.2 腫瘤細胞培養(yǎng)及化療藥敏性實驗

采集患者的原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的腫瘤組織置于雙抗培養(yǎng)液中，在2 h內(nèi)進行四氮唑鹽（MTT）法原代細胞培養(yǎng)體外化療藥敏性實驗。選用4種常用化療藥物：順鉑（DDP）、長春新堿（VCR）、甲氨蝶吟（MTX）、紫杉醇（PTX），藥物終濃度以血漿峰值藥物濃度為準(zhǔn)，以不加藥物的細胞為對照，每種藥物均設(shè)3個復(fù)孔，接種細胞懸液200 μL/孔，振蕩混勻后加入5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，溫度控制在37℃，加5 g/L噻唑藍（MTT）20 μL/孔再進行3～24 h的培養(yǎng)。終止培養(yǎng)后進行離心處理棄上清，之后加入二甲基亞礬（DMSO）100 μL/孔，混勻后使用酶標(biāo)儀570 nm對各孔吸光度（A）進行測試。腫瘤細胞生長抑制率（IR）=（1-給藥孔A/對照組A）×100%。

1.3免疫組織化學(xué)法（SP）測定

采用SP法對原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的P53、bcl-2、survivin進行測定，嚴格按試劑盒說明書操作。由深圳市國賽生物技術(shù)有限公司提供鼠抗人P53、bcl-2、survivin單克隆抗體及免疫組織化學(xué)染色試劑盒。用已知陽性切片作陽性對照，用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對照。每張切片取5個高倍視野，各計數(shù)100個細胞，P53染色陽性表現(xiàn)為胞核著黃色，bcl-2與survivin均為胞膜和（或）胞質(zhì)著黃色。著色強度計分標(biāo)準(zhǔn)與陽性細胞率計分標(biāo)準(zhǔn)參考李勇[4]的研究，根據(jù)二者的積分乘積判斷陰陽性，即乘積=1為（-）；乘積2～3為（+）；乘積4～7為（++）；乘積≥8為（+++）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以（x±s）表示，比較采用配對t檢驗及直線相關(guān)分析，等級資料采用Wilcoxon配對秩和檢驗與Spearman等級相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的P53、bcl-2、survivin表達情況

P53在原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達一致率為68.04%（36/62），survivin為25.81%（16/62），bcl-2為43.55%（27/62）；P53與bcl-2的表達一致率較高，而survivin較低。三者在原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達強度無顯著差異（P>0.05）。P53與bcl-2在原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶間的表達呈顯著相關(guān)性（P<0.05），而survivin無顯著相關(guān)性（P>0.05）。

2.2 4種化療藥物對原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細胞抑制率比較

PTX對原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細胞抑制率無明顯差異（P>0.05），但DDP、VCR、MTX對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶腫瘤細胞抑制率顯著低于原發(fā)灶（P<0.05）。直線相關(guān)分析顯示，MTX對原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細胞抑制率呈正相關(guān)性。

2.3原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶P53、bcl-2、survivin表達與化療藥物抑制率的關(guān)系

原發(fā)灶中的P53、bcl-2、survivin均與化療藥物抑制率無明顯相關(guān)性（P>0.05）。而在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中，P53與DDP對腫瘤細胞的抑制率呈負相關(guān)（r=-0.426，P<0.05）；survivin及bcl-2均與PTX抑制率呈負相關(guān)（r=-0.399，r=-0.483，P<0.05）。

3討論

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響惡性腫瘤預(yù)后的獨立危險因素[5]，消化系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的比例達到60%～80%[6，7]。在腫瘤進展過程中，亞克隆細胞群的侵襲能力、化療藥敏性等部分細胞學(xué)特性可能會發(fā)生異質(zhì)變化。腫瘤的MDR與不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路協(xié)調(diào)的級聯(lián)樣網(wǎng)絡(luò)式調(diào)節(jié)機制及多種基因/蛋白的表達有密切聯(lián)系[8]，其呈現(xiàn)的明顯異質(zhì)性變化涉及到腫瘤進展過程中不同細胞亞群發(fā)生的基因及大分子改變[9]，但目前國內(nèi)尚缺乏有關(guān)消化道腫瘤轉(zhuǎn)移灶凋亡抑制蛋白的表達與化療耐藥性的關(guān)系的研究報道。

P53、bcl-2及survivin是三種具有細胞凋亡調(diào)節(jié)功能的凋亡抑制蛋白，也是與消化道腫瘤耐藥相關(guān)的因子之一。本研究顯示，P53與bcl-2在原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達一致率較高，而survivin較低，提示消化道腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶凋亡抑制蛋白的表達發(fā)生了異質(zhì)性變化；4種常用化療藥物對原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶腫瘤細胞的抑制率有明顯差異，提示轉(zhuǎn)移灶的化療藥敏性也具有異質(zhì)性。

目前認為，MDR形成機制至少包括兩個途徑，其一為經(jīng)典耐藥途徑，其二為化療藥物作用于腫瘤細胞后產(chǎn)生的凋亡抵抗[10，11]?；熕幬锟蓪δ[瘤細胞DNA構(gòu)成破壞，細胞可通過P53通路反式激活P21WAF/CIP1基因程序而誘導(dǎo)細胞凋亡，與野生型P53不同，突變型P53不具有對bcl-2及survivin負反饋調(diào)節(jié)作用[12]；bcl-2可通過影響自擾細胞色素線粒體正常釋放而干擾蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)激活，是最終凋亡調(diào)控點；而survivin可通過直接抑制caspase阻斷細胞凋亡。故化療藥物作用于靶點時，bcl-2與survivin這兩種抗凋亡蛋白可對化療藥物誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡產(chǎn)生抑制作用，從而出現(xiàn)MDR表型[13，14]。

相關(guān)性分析提示原發(fā)灶中的P53、bcl-2、survivin均與化療藥物抑制率無明顯相關(guān)性，而在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中卻與不同化療藥物的抑制率呈負相關(guān)，提示轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶具有MDR異質(zhì)性，主要耐藥相關(guān)因子不同而使化療藥物的抑制率有所差異，這可能與腫瘤細胞對化療藥物的MDR是涉及多種基因/蛋白共同參與、機制復(fù)雜的多環(huán)節(jié)網(wǎng)絡(luò)化調(diào)節(jié)有關(guān)。孫延霞[15]研究指出，腫瘤組織耐藥相關(guān)因子表達與某種化療藥物對腫瘤細胞的抑制率表現(xiàn)出負相關(guān)的關(guān)系，說明該耐藥相關(guān)因子高表達時對某種藥物敏感性下降表現(xiàn)出相對化療耐藥。

綜上所述，消化道腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中P53、bcl-2、survivin的表達情況及化療藥敏性均體現(xiàn)出異質(zhì)性，提示術(shù)后化療應(yīng)盡量避免化療靶目標(biāo)的偏差，以提升癌癥綜合治療的效果。

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（收稿日期：2016-06-22）