余佳璠

（惠州市惠城區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣東惠州 516001）

關(guān)于納米硅佐劑對新城疫抗原HI效價(jià)影響的研究

余佳璠

（惠州市惠城區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣東惠州 516001）

以硅溶膠為佐劑制備了納米硅佐劑新城疫疫苗。并考察了其與普通新城疫凍干苗，新城疫商品油苗的新城疫抗原HI效價(jià)的比較。結(jié)果表明它的效價(jià)比普通凍干苗的效價(jià)更高，持續(xù)的時(shí)間更長。與油苗相比它的黏度更低，制作成本也更廉價(jià)。本工作為納米硅作為疫苗佐劑提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

新城疫；納米硅佐劑疫苗；普通凍干苗；商品油苗；抗體效價(jià)

新城疫是多種家禽共患的重大動(dòng)物疫病，分布廣泛，傳播快，對養(yǎng)禽業(yè)的危害十分嚴(yán)重［1］。我國目前使用的疫苗主要是滅活油佐劑疫苗和凍干苗（弱毒苗），為有效控制新城疫的流行發(fā)揮了重要的作用。但是和其它獸用油乳劑疫苗一樣，油佐劑疫苗產(chǎn)生抗體速度較慢，而且由于其黏度過高，注射不方便，機(jī)體吸收也比較慢，只能在7日齡后使用，且成本高；而弱毒苗的安全性能差，有潛在散毒風(fēng)險(xiǎn)。因此尋找一種注射方便，穩(wěn)定性好且能長久儲存的新型疫苗，用于新城疫的緊急預(yù)防接種具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

納米粒子一般是指粒徑在1～100 nm范圍內(nèi)的超微粒［2，3］。納米技術(shù)是指在1～100nm的量度范圍內(nèi)研究原子、分子的結(jié)構(gòu)及相互作用并加以應(yīng)用的技術(shù)［4］。納米粒子具有比表面積大、表面活性中心多、反應(yīng)活性高、吸附和催化能力強(qiáng)的特點(diǎn)，因此會產(chǎn)生體積效應(yīng)、表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng)［5］。Kreuter等于1981年首次將納米材料應(yīng)用于疫苗佐劑［6］。納米材料用作疫苗佐劑，使抗原結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定［7］。納米材料用作疫苗佐劑，已受到極大重視［8-11］。納米佐劑是一類新型佐劑，必將成為一種理想的替代常規(guī)佐劑的新型佐劑［12］。

目前用于實(shí)踐的主要納米佐劑為納米鋁佐劑。它的主要優(yōu)點(diǎn)在于它的有效性和安全性，且納米粒子均勻性好［13］。

最近幾年來，納米二氧化硅因其在藥物載體方面的應(yīng)用受到了廣泛關(guān)注。它的優(yōu)點(diǎn)主要體現(xiàn)在：①納米二氧化硅材料無毒，具有較好的生物相容性；②制備簡單，價(jià)格低廉；③載藥納米二氧化硅具有緩慢釋放藥物的特點(diǎn)，可以作為緩釋藥物。

硅溶膠是納米二氧化硅在水中的穩(wěn)定分散體系，具有良好的分散穩(wěn)定性好。因此本文選擇納米硅溶膠作為佐劑制備了新城疫疫苗。該疫苗呈半透明狀，黏度低，并可以長期保存，不易發(fā)生沉淀現(xiàn)象。并考察了其與凍干苗和油苗產(chǎn)生抗體效價(jià)的比較，比較它們在同樣的條件下對動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生免疫力的效果。分別比較它們在單一免疫時(shí)和聯(lián)合免疫后產(chǎn)生的抗體效價(jià)，判斷納米硅佐劑疫苗是否存在它的優(yōu)勢，為納米硅作為疫苗佐劑提供一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

96孔V型反應(yīng)板，25μl的微量移液器，微量振蕩器，恒溫培養(yǎng)箱，離心機(jī)。

1.2 納米硅佐劑疫苗樣1、樣2

樣1用20nm的納米硅佐劑和樣2中所用佐劑為15nm的納米硅佐劑。實(shí)驗(yàn)中保證每一頭份所含抗原量相等。

1.3 新城疫凍干苗

新城疫凍干苗（20120617，青島易邦）由惠城區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供。新城疫油苗（20120617）由青島易邦生物工程有限公司提供。

1.4 試驗(yàn)用雞

購自金種種雞場1日齡spf雞苗240只，試驗(yàn)時(shí)間2012年8月2號至2012年10月2號

1.5 試驗(yàn)用雞的處理情況

試驗(yàn)用雞分別分為七組每組60只。第一組為空白對照組，3日齡時(shí)每只在頸背部皮膚注射生理鹽水0.5 ml/只；第二組為基礎(chǔ)免疫組，3日齡時(shí)每只在頸背部皮膚注射新城疫凍干苗0.5 ml/只；第三組為納米硅佐劑疫苗樣1組，3日齡時(shí)每只在頸背部皮膚注射樣1溶液0.5 ml/只；第四組為納米硅佐劑疫苗樣2組，3日齡時(shí)每只在頸背部皮膚注射樣2溶液0.75 ml/只；第五組為基礎(chǔ)免疫與樣1的聯(lián)合免疫組，3日齡時(shí)每只在頸背部皮膚注射新城疫凍干苗0.5 ml/只，在7日齡時(shí)再每只在頸背部皮膚注射樣1溶液0.5 ml/只；第六組為基礎(chǔ)免疫與樣2的聯(lián)合免疫組，3日齡時(shí)每只在頸背部皮膚注射新城疫凍干苗0.5 ml/只，在7日齡時(shí)再每只在頸背部皮膚注射樣2溶液0.75 ml/只；第七組為基礎(chǔ)免疫與油苗的聯(lián)合免疫組，3日齡時(shí)每只在頸背部皮膚注射新城疫凍干苗0.5 ml/只，在7日齡時(shí)再每只在頸背部皮膚注射新城疫油苗0.5 ml/只。在7日齡時(shí)從前四組每組中抽取5只雞進(jìn)行采血，分離血清，用血凝抑制（HI）實(shí)驗(yàn)測其抗體水平，取平均值記錄即為其抗體效價(jià)。以后每隔4天從每組中抽取5只雞進(jìn)行采血（測一個(gè)半月時(shí)間），分離血清，用血凝抑制（HI）實(shí)驗(yàn)測其抗體水平，取平均值記錄即其抗體效價(jià)。在對試驗(yàn)動(dòng)物注射疫苗后的兩天內(nèi)，應(yīng)觀察試驗(yàn)動(dòng)物是否有應(yīng)激或過敏反應(yīng)，是否正常采食，并稱重觀察其是否正常生長。稱重時(shí)每天在同一時(shí)間從每組取三只試驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行稱重，取平均值記錄。

1.6 4 個(gè)血凝單位病毒的制備

采用微量血凝試驗(yàn)測出病毒液的血凝價(jià)，再算出 4 個(gè)血凝單位病毒的稀釋倍數(shù)。

操作方法：用定量稀釋器于V 型微量凝集板的每孔中加入PBS液 25μL，共加 4 排孔。用稀釋器分別取病毒液 25 μL至第一排和第三排的第一孔，混勻后，依次作倍比稀釋至第二排和第四排的第四孔，最后棄去 25μL，第五孔作對照用。用稀釋器吸取1% 雞紅細(xì)胞懸浮液依次加入各孔，每孔25μL. 振蕩搖勻后，靜置溫箱（37℃）內(nèi)反應(yīng)15 min 后，以出現(xiàn)完全凝集的病毒最大稀釋度為該病毒液的血凝價(jià)。3 次重復(fù)，取其平均值即為其血凝效價(jià)。若血凝價(jià)為n，則下次測抗體時(shí)該抗原所需稀釋的倍數(shù)為2的n次方除以4。

1.7 1 %紅細(xì)胞懸液的制備

采取健康青年公雞的血液加于盛有抗凝劑的離心管內(nèi)，用 20倍量的 PBS 液洗滌血球，反復(fù)洗滌 3～4次，每次以2000 rpm 離心 5 min后棄去上清液，最后一次離心 10 min。吸取壓積紅血球用PBS 液配制成1 %的紅細(xì)胞懸液。

1.8 血凝抑制（H I）試驗(yàn)

采用常規(guī) B2微量法，在 96 孔V 型微量凝集板上進(jìn)行，用定量稀釋器加樣和稀釋。先用稀釋器取PBS液 25 μL加入每排各孔，第十二孔加50 μL，再取待檢血清 25 μL加入第一列孔，依次作倍比稀釋至第十列孔，最后棄去25 μL。然后取4單位病毒液加入每排各孔25 μL至第十一孔（第十二列孔不加），第十一列孔為 4 單位病毒液對照（陰性對照孔）。第十二列孔為PBS液對照（陽性對照孔）。振蕩搖勻，置 37℃溫箱中反應(yīng)15 min。再取1% 雞紅細(xì)胞懸浮液 25 μL 于各孔中，振蕩搖勻后，置 37℃溫箱中反應(yīng) 15～20 min 后觀察判定結(jié)果。

判定標(biāo)準(zhǔn)：在對照管出現(xiàn)正確結(jié)果時(shí)，陰性對照孔為凝集現(xiàn)象，陽性對照孔為沉淀現(xiàn)象。則能使 4 單位病毒液凝集紅細(xì)胞作用完全受到抑制的血清最高稀釋倍數(shù)作為該血清的血凝抑制價(jià)，即抗體效價(jià)。

1.9 納米硅佐劑疫苗和油佐劑疫苗黏度對比實(shí)驗(yàn)

在同樣的條件下，分別比較在1 ml的滴管內(nèi)滴完1 ml納米硅佐劑疫苗樣1，1 ml納米硅佐劑疫苗樣2，以及1 ml油苗所需要的時(shí)間。分別測三次取平均值記錄。

2 結(jié)果與討論

2.1 硅溶膠的電子顯微鏡照片

圖1 硅溶膠的電子顯微鏡照片

圖1硅溶膠的投射電子顯微鏡照片（本實(shí)驗(yàn)室電子顯微鏡拍攝）。從該圖可以看出，硅溶膠顆粒為類球形，尺寸在15～20 nm之間，單分散性好，且無團(tuán)聚現(xiàn)象。

2.2 納米硅佐劑疫苗和油苗的黏度比

表1 納米硅佐劑疫苗樣1、納米硅佐劑疫苗樣2和油苗的黏度比

黏度值即1ml溶液滴完所需要的時(shí)間，時(shí)間越短，說明黏度越低，時(shí)間越長，黏度越高。由表1可以看出油苗的黏度要比納米硅佐劑的黏度高，樣2又比樣1的黏度高，而黏度過高會影響到疫苗的注射和吸收，因此在黏度上納米硅佐劑更有優(yōu)勢。而且免疫油苗的試驗(yàn)動(dòng)物每頭份成本要7分錢，而納米硅佐劑的成本只需0.2分錢。說明納米硅佐劑的成本更低。

表3 納米硅佐劑疫苗和凍干苗、油苗的 HI效價(jià)對比

2.3 納米硅佐劑疫苗和凍干苗、油苗的HI效價(jià)對比

表3為納米硅佐劑疫苗和凍干苗、油苗的HI效價(jià)對比。在7日齡初次測得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明基礎(chǔ)免疫的效價(jià)為6log2，納米硅佐劑疫苗樣1的效價(jià)也為6log2，而納米硅佐劑疫苗樣2在此時(shí)就達(dá)到了效價(jià)為8 log2。說明佐劑疫苗比例不同會產(chǎn)生不同的效價(jià)，因此可以調(diào)整納米硅佐劑疫苗的濃度比例，使動(dòng)物機(jī)體在短時(shí)間內(nèi)迅速產(chǎn)生較高的抗體效價(jià)，從而具有更好的免疫保護(hù)力。在23日齡時(shí)，基礎(chǔ)免疫組的效價(jià)為5 log2，納米硅佐劑疫苗樣1的效價(jià)為6.5 log2，納米硅佐劑疫苗樣2的效價(jià)為7 log2。說明在此時(shí)納米硅佐劑疫苗比凍干苗產(chǎn)生的抗體水平高。在43日齡時(shí)，基礎(chǔ)免疫組的效價(jià)為5log2，而納米硅佐劑疫苗的效價(jià)都為6 log2，比基礎(chǔ)免疫組高出1個(gè)單位的效價(jià)，充分說明在同樣的情況下納米硅佐劑疫苗能產(chǎn)生更高抗體的效價(jià)，這也說明了納米硅佐劑具有緩釋作用，能使抗原逐漸的釋放，使動(dòng)物機(jī)體在較長的時(shí)間內(nèi)保持有效的抗體效價(jià)。在進(jìn)行聯(lián)合免疫后，這主要體現(xiàn)在23日齡后，動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生的抗體效價(jià)更高，說明納米硅佐劑疫苗與凍干苗起到了很好的協(xié)同作用。

雖然與油苗相比沒有油苗的效價(jià)高，但從表1可以知道納米硅佐劑黏度更低，成本也更低，所以還是具有一定的優(yōu)勢。

3 結(jié)論

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，納米硅佐劑疫苗的主要優(yōu)點(diǎn)為：

（1）吸收快，能使動(dòng)物機(jī)體在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生有效的抗體效價(jià)。

（2）具有非常好的緩釋效果，能使動(dòng)物機(jī)體在長時(shí)間內(nèi)保持有效的抗體效價(jià)。

因此，納米硅佐劑疫苗可以作為一種新型疫苗來開發(fā)利用。

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