劉晉津佘靜偉吳 騰郝志明

（1.天津市南開(kāi)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室，天津 300100；2.天津市西青區(qū)畜牧水產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，天津 300380；3.天津農(nóng)學(xué)院，天津 300384）

溫度對(duì)犬精液冷凍保存的研究

劉晉津1佘靜偉2吳 騰1郝志明3*

（1.天津市南開(kāi)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室，天津 300100；2.天津市西青區(qū)畜牧水產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，天津 300380；3.天津農(nóng)學(xué)院，天津 300384）

本實(shí)驗(yàn)在以往研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究了冷凍起始溫度（始凍溫度）、解凍溫度對(duì)精子活率的影響.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:始凍溫度為-70℃時(shí)凍后精液質(zhì)量最好，凍后鏡子活率達(dá)0.6284±0.0408，優(yōu)于-65℃和-75℃時(shí)的凍后精子活率；解凍溫度為70℃時(shí)對(duì)解凍后精液質(zhì)量最好，達(dá)0.6810±0.0324，明顯優(yōu)于60℃和65℃的精子活率。

冷凍；精子；始凍溫度；解凍溫度

由于畜牧業(yè)的發(fā)展需要，牛的凍精在市場(chǎng)上比較常見(jiàn)。隨著生物技術(shù)、動(dòng)物學(xué)、繁殖學(xué)的不斷發(fā)展，尤其是體外受精技術(shù)的不斷完善使犬精液的冷凍保存越來(lái)越受到關(guān)注。犬作為人類(lèi)最親密的朋友，為人類(lèi)的科研發(fā)展以及寵物飼養(yǎng)做出了巨大的貢獻(xiàn)，犬精液的冷凍保存在選種、基因改良、遺傳病研究，提高公犬利用率等諸多方面都有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

1780年，意大利生理學(xué)家SpMlanzani第一次進(jìn)行了犬的人工授精實(shí)驗(yàn)。此后，Seager，Olar TT、Yu I、Cardoso RDS等人在這方面做了諸多工作。美國(guó)早在二十世紀(jì)七十年代就投入了大量精力研究犬精液的冷凍保存。

相較于國(guó)外，國(guó)內(nèi)研究起步相對(duì)較晚，目前并沒(méi)有形成一套成熟的方法。張志光、郝志明、潘壽文等人對(duì)影響犬精液冷凍保存的諸多因素做了研究，取得了一定的進(jìn)展。

本實(shí)驗(yàn)在以往的經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以Tris-葡糖糖為稀釋液，液氮面上2cm處熏蒸，對(duì)始凍溫度和解凍溫度進(jìn)行更為細(xì)化的研究，以便找到更為合適的犬精液保存方法。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性大丹犬，3歲，身體健康，精液品質(zhì)良好。

1.2 實(shí)驗(yàn)器械和試劑

1.2.1 實(shí)驗(yàn)器械

離心機(jī)：型號(hào)DT5-1，北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；

顯微鏡：型號(hào)36XL，上光精密光學(xué)檢測(cè)儀器銷(xiāo)售有限公司；電子天平：型號(hào)T500，常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；集精杯：玻璃漏斗插入量筒，以棉塞封口制成；

1.2.2 稀釋液

用雙蒸水配置基礎(chǔ)稀釋液（Tris3%，檸檬酸1.9%，葡萄糖1.5%）。用等體積的75%的基礎(chǔ)稀釋液加入25%的卵黃配置成稀釋一液，再將等體積的85%稀釋一液加入15%的甘油，配置成稀釋二液。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 人工按摩采精

綁定實(shí)驗(yàn)犬，手握法采集精液。我們將射精分為三段，第一段為剛剛射精階段，第二部分為射精中段，第三部分為射精尾段（射精即將結(jié)束），采精時(shí)注意收集精液的中間部分，觀察精液色澤、氣味，顯微鏡下估算精子活率。

1.3.2 鮮精處理及保存

調(diào)試離心機(jī)，使剛剛采集的鮮精在2000rpm下離心5分鐘。棄掉上清液，向管中加入等溫的稀釋一液并混勻，封口。放入盛有500ml，30℃熱水的燒杯中，將燒杯放入4℃冰箱保存。18個(gè)小時(shí)后，將已預(yù)冷至4℃等體積的稀釋二液緩慢加入精液中，混勻后再次放回4℃冰箱保存4h。

1.3.3 冷凍前準(zhǔn)備

（1）測(cè)量液氮面高度：將液氮罐提桶試探性插入罐內(nèi)，當(dāng)聽(tīng)到斯拉聲時(shí)，停止插入，用刻度尺量出插入的深度，此深度即為液氮面高度。

（2）精液裝管：將精液吸入細(xì)管，使精液距細(xì)管口大約為1.0cm，封口。

1.3.4 冷凍

將裝有精液的細(xì)管插入已預(yù)冷至-65℃、-70℃、-75℃的細(xì)管插座內(nèi)，立即放入液氮罐內(nèi)液面上方2cm處進(jìn)行熏蒸，10min后，取出細(xì)管，立即投入液氮內(nèi)。

1.3.5 解凍和凍后精子活率的檢查

從液氮罐中取出細(xì)管，放入65℃的水中解凍5s。在400倍鏡下測(cè)定精子活率。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)按單因子試驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 始凍溫度對(duì)凍后精子活率的影響從表 1 可以看出，凍后精子活率隨始凍溫度的不同而變化。始凍溫度為-70℃時(shí)凍后精子的活率顯著高于始凍溫度為-65℃和-75℃時(shí)的活率（P〈0.05），為0.6284±0.0408。但始凍溫度為-65℃時(shí)和-75℃時(shí)的活率間則沒(méi)有明顯的差異（P＞0.05）。

表1 始凍溫度對(duì)凍后精子活率的影響

2.2 解凍溫度對(duì)凍后精子活率的影響

表2 解凍溫度對(duì)凍后精子活率的影響

從表1的研究結(jié)果看-70℃的始凍溫度效果最好。我們將-70℃設(shè)為始凍溫度來(lái)研究解凍溫度。從表2可以看出，精子的活率隨解凍溫度的升高而提高。解凍溫度為65℃和70℃時(shí)凍后精子活率為0.6110±0.0742和0.6810±0.0324，極顯著高于解凍溫度為60℃時(shí)的活率（P〈0.01）。解凍溫度為70℃時(shí)的凍后精子活率顯著高于解凍溫度為65℃時(shí)的活率（P〈0.05），為0.6810±0.0324。

3 討論

3.1 精液采集

采精環(huán)節(jié)是本實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)。采精方法有很多種，例如假陰道法、按摩采精法、電刺激法等等。相較于其他方法，人工按摩采精法簡(jiǎn)單可靠，只要實(shí)驗(yàn)人員細(xì)心，就可以很好的將射精的三個(gè)階段分開(kāi)，收集精液最為良好的部分。

3.2 始凍溫度的探討

當(dāng)精液的溫度由0℃緩慢降到-60℃時(shí)，精液中的水分由液態(tài)變?yōu)楣虘B(tài)，對(duì)精細(xì)胞的細(xì)胞器造成巨大的破壞。因此，研究人員的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)表明0℃--60℃是精子的破壞區(qū)域。但是，在保護(hù)劑的參與下，精液溫度快速降到-60℃以下，固態(tài)精液呈現(xiàn)玻璃態(tài)，不會(huì)對(duì)細(xì)胞器造成破壞。潘壽文等人在二十世紀(jì)八十年代就對(duì)犬精液低溫保存進(jìn)行過(guò)研究，結(jié)果表明-80℃時(shí)效果最為理想（0.4500±0.0447），郝志明等人研究發(fā)現(xiàn)-113℃則精子死亡率上升（0.1250±0.0612）。本實(shí)驗(yàn)在以往的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)始凍溫度為-70℃時(shí)效果更為理想，為0.6284±0.0408。而-75℃時(shí)則精子活率降低。綜合來(lái)看，溫度的變化（-65℃、-70℃、-75℃、-80℃、-113℃）并沒(méi)有一條理想的曲線(xiàn)表明精子的活率是隨著溫度曲線(xiàn)的變化而有規(guī)律的升高或者降低。其中的規(guī)律還需要進(jìn)一步研究。

3.3 解凍溫度的探討

研究表明，精子在低溫狀態(tài)下代謝幾乎停止，使其能夠保存。一旦升溫，精子又能復(fù)蘇。Olar TT等人對(duì)解凍溫度做過(guò)系統(tǒng)的研究，結(jié)果表明高溫快速解凍效果更好。熊前等人研究發(fā)現(xiàn)采用高溫水浴快速解凍方法，犬精子的活力最佳。郝志明等人研究發(fā)現(xiàn)65℃解凍5s效果理想，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)70℃解凍5s要比65℃更好，為0.6810±0.0324?？梢?jiàn)高溫快速解凍更適于精子的成活。那么快速的使精子通過(guò)不適宜生存的低溫區(qū)是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。市場(chǎng)上牛的體外受精比較常見(jiàn)，原因在于牛凍精的成活率高，市場(chǎng)比較成熟。本實(shí)驗(yàn)表明始凍溫度為-70℃，解凍溫度70℃時(shí)，精子成活率在0.6810±0.0324，在配套設(shè)施完善的條件下完全有理由應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。

［1］ Seager SJW. Successful pregnancies utilizing frozen dog Semen［J］. A. I. Digest，1969，（17）：6-16.

［2］ Olar TT，Bowen RA and Pickett BW.Influence of extender，cryopreservative and seminal processing procedures on postthaw motility of canine spermatozoa frozen in straws［J］.Theriogenology，1989，31（2）：451-461.

［3］ Cardoso RDS et al Cryopreservation of canine semen using a coconut water extender with eggyolk and three different glycerolconcentrations［J］.Therio-genology，2003，59（3-4）：743-751.

［4］ 張志光，劉清神，劉運(yùn)忠.不同稀釋液對(duì)Beagle犬精液保存效果的比較［J］.廣東畜牧獸醫(yī)科技，2013，（6）：37-40.

［5］ 郝志明，王偉峰，潘敏.犬精液低溫保存稀釋液的研究［J］.甘肅畜牧獸醫(yī)，2005，（6）：16-19.

［6］ 潘壽文，劉湖，馬大君.犬的精液冷凍技術(shù)［J］.畜牧與獸醫(yī)，1986，（3）：105-106.

［7］ 熊前，葉俊華，吳衍，等.犬精液冷凍與解凍方法的研究報(bào)告［J］.當(dāng)代畜牧，2008，（4）：39-40.

［8］ 郝志明，姚金宇，王章龍，等.犬精液冷凍解凍技術(shù)研究［J］.甘肅畜牧獸醫(yī)，2005，35（5）：9-12.

劉晉津（1984—），男，助理獸醫(yī)師，主要從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的管理、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、畜牧獸醫(yī)后勤保障，遺傳育種研究等。

郝志明（1963—），男，教授，工作于天津農(nóng)學(xué)院，研究方向?yàn)閯?dòng)物生殖生理和生殖技術(shù)。