付曉平

（廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院，廣東廣州 510430）

食品動物源沙門菌ESBLs和PMQR耐藥基因流行特征分析

付曉平

（廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院，廣東廣州 510430）

本研究對從豬、鴨和鵝分離的31株沙門菌進(jìn)行耐藥性分析，調(diào)查ESBLs基因和PMQR基因在沙門菌的流行分布特征。結(jié)果顯示，31株沙門菌中只檢測到CTX-M型ESBLs，3株攜帶b1aCTX-M-14，3株攜b1aCTX-M-27基因；有13株攜帶b1aOXA型均為窄譜b1aOXA-1，6株攜帶b1aTEM型也為窄譜b1aTEM-1b。b1aSHV、b1aPER、b1aVEB、b1aGES等各型β-內(nèi)酰胺酶基因均未檢出。PMQR基因oqxAB和aac（6′）-Ibcr檢出率最高分別為39%和26%。4株鴨源和1株豬源沙門菌中都檢測到qnrA基因，而qnrD基因僅在一種豬源沙門菌中檢出。qnrB、qnrC、qnrS、qepA等基因均未檢出。研究發(fā)現(xiàn)有19株沙門菌同時攜帶β-內(nèi)酰胺酶和PMQR，其中一株鴨源沙門菌同時攜帶CTX-M-14 ESBLs和CMY-2 AmpC酶；有7株同時攜帶4-5種β-內(nèi)酰胺酶和PMQR基因。

超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）PMQR；沙門氏菌

1 材料與方法

1.1 菌株

本實驗保存的患病動物或送檢動物（包括豬、鴨和鵝）直腸拭子中分離鑒定的31株沙門菌用于調(diào)查ESBLs和PMQR的流行分布。質(zhì)控菌ATCC25922。

1.2 β-內(nèi)酰胺酶基因和PMQR基因的檢測

首先對菌株進(jìn)行復(fù)蘇，然后采用水煮法提取細(xì)菌的總DNA，備用，參考已發(fā)表相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計、合成引物，對所有菌株采用PCR方法擴(kuò)增基因。陽性PCR產(chǎn)物送北京華大公司測序，將測序結(jié)果提呈NCBI進(jìn)行序列比對，確認(rèn)基因及確定受試菌株β-內(nèi)酰胺酶基因的亞型。

2 結(jié)果

對31株臨床分離沙門菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果得到與陽性對照一致大小的DNA片段（見圖1、2、3、4、5、6和7）。31株臨床分離沙門菌中，19株檢出攜帶一種或多種β-內(nèi)酰胺酶基因和PMQR耐藥基因，分別有blaCTX-M-9G（6株）、blaOXA（13株）、blaTEM（6株）、blaCMY-2（1株）、qnrA（5株）、qnrD（1株）、aac（6′）-Ib-cr（8株）和oqxAB（12株）。blaCTX-M型只有2種，分別為3株攜帶blaCTX-M—14（鴨3株），3株blaCTX-M—27（鴨2株，豬1株）。blaOXA型和blaTEM型基因各只有一種，都是窄譜的blaOXA-1和blaTEM-1b，本次研究中，blaSHV、blaPER、blaVEB、blaGES等各型β-內(nèi)酰胺酶基因均未檢出。PMQR基因中，aac（6′）-Ib-cr和oqxAB檢出率最高，豬和鴨中都檢出。在4株鴨源和1株豬源沙門菌中都檢測到qnrA基因，而qnrD基因僅在一種豬源沙門菌中檢出。31株沙門菌都沒有檢測到qnrB、qnrC、qnrS、qepA等基因（表1）。19株β-內(nèi)酰胺酶基因和PMQR陽性菌株中，其中一株鴨源的同時攜帶ESBLs和AmpC酶（blaCTX-M-14和blaCMY-2），而2株blaCTX-M-27陽性菌同時攜帶blaOXA-1。同時攜帶兩種以上PMQR基因沙門菌有8株。同時攜帶β-內(nèi)酰胺酶和PMQR基因的菌株有11株，而且攜帶的基因呈多樣性，其中有7株同時攜帶4-5種β-內(nèi)酰胺酶和PMQR基因。

3 討論

圖1 b1aCTX-M-9G基因的PCR電泳圖M為DL2000 markers，1～6為樣品PCR產(chǎn)物，7為陰性對照，8為陽性對照

圖2 b1aTEM基因的PCR電泳圖M為DL2000 markers，1～6為樣品PCR產(chǎn)物，7為陰性對照，8為陽性對照

圖3 b1aOXA基因的PCR電泳圖M為DL2000 markers；1～7為樣品PCR產(chǎn)物；8為陰性對照；9為陽性對照

圖4 qnrA基因的PCR電泳圖M為DL2000 markers；1～4為樣品PCR產(chǎn)物；5為陰性對照；6為陽性對照

圖5 aac（6′）-Ib-cr基因的PCR電泳圖M為DL2000 markers，1～6為樣品PCR產(chǎn)物，7為陰性對照，8為陽性對照

圖6 oqxA基因的PCR電泳圖M為DL2000 markers，1～7為樣品PCR產(chǎn)物，8為陰性對照，9為陽性對照

圖7 oqxB基因的PCR電泳圖M為DL2000 markers，1～12為樣品PCR產(chǎn)物，8:陰性對照，9:陽性對照

越來越多研究表明（引用其他研究結(jié)果），無論是人還是動物分離的革蘭氏陰性菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥主要是產(chǎn)生了ESBLs。產(chǎn)ESBLs細(xì)菌呈世界流行，各個國家和地區(qū)流行特征各不相同。近幾年國內(nèi)外大量研究報道了在食品動物源細(xì)菌中檢測到ESBLs，食品動物可作為耐藥基因儲存庫，選取更多的ESBLs成員，最終轉(zhuǎn)移給人類，加大了人類和動物間ESBLs相互轉(zhuǎn)移的擔(dān)憂。

本研究對31株沙門菌調(diào)查結(jié)果顯示，blaCTX-M型ESBLs只有2種，分別blaCTX-M—14和blaCTX-M—27，都是印第安納血清型，可以看出沙門菌攜帶ESBLs的數(shù)量和種類遠(yuǎn)不如大腸桿菌的復(fù)雜和多。本研究中3株產(chǎn)blaCTX-M-14和2株產(chǎn)blaCTX-M-27沙門菌都是從鴨分離，而豬源沙門菌只檢測到1株產(chǎn)blaCTX-M-27沙門菌。2009年本實驗室調(diào)查食品動物源大腸桿菌的結(jié)果，鴨源產(chǎn)blaCTX-M-14大腸桿菌的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過豬源大腸桿菌。鴨是水禽，與水環(huán)境接觸密切，而blaCTX-M-14是首次在我國醫(yī)院分離大腸桿菌和肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)，目前是我國最流行的blaCTX-M型ESBLs。本研究中僅鴨源沙門菌檢測到blaCTX-M-14，可以推測blaCTX-M-14在我國動物、人、環(huán)境已廣泛流行分布，并通過水環(huán)境加速其傳播。

本研究從一株鴨源印第安納沙門菌中檢測到blaCMY-2，值得注意的是，該菌同時攜帶blaCTX-M-14。醫(yī)院病人分離的沙門菌blaCMY-2與其他ESBLs共同存在于一株沙門菌上，組合方式有blaCMY-7+blaSHV-9+blaOXA-30，blaCMY-2-+blaSHV-2+blaTEM-1，blaCMY-2+blaCTX-M-37+blaTEM-63，blaCMY-2+blaTEM-63，目前還鮮有研究報道動物源沙門菌blaCMY-2與ESBLs共同存在于一株菌上。有研究報道，blaCMY-2細(xì)菌的出現(xiàn)于食品動物中使用第三代頭孢菌素頭孢噻呋有關(guān)。和ESBLs不同，質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶具有更加廣泛的耐藥譜，其水解底物范圍更廣，耐藥質(zhì)粒往往同時攜帶氨基糖苷類、氟喹諾酮類、氯霉素、四環(huán)素等抗菌藥耐藥基因，造成嚴(yán)重的多重耐藥性。在本研究blaCMY-2和blaCTX-M-14共同存在于一株印第安納沙門菌中，使用其他抗生素也可能篩選出blaCTX-M-14陽性菌并促進(jìn)其擴(kuò)散傳播，提示在食品動物要慎用動物專用頭孢噻呋。

本研究首次在沙門菌中檢測到oqxAB基因，31株沙門菌中有12株攜帶OqxAB基因，檢出率為39%。

本研究31株沙門菌中，有11株菌同時攜帶β-內(nèi)酰胺酶和PMQR基因的菌株，而且攜帶的基因呈多樣性，其中有7株同時攜帶4-5種β-內(nèi)酰胺酶和PMQR基因，blaCTX-M-14和blaCTX-M-27分別和三種PMQR基因（qnrA+aac（6'）-Ib-cr+oqxAB_）共同存在一株菌中，對頭孢噻肟和環(huán)丙沙星都表現(xiàn)高水平耐藥。2005年我國香港報道4株對環(huán)丙沙星和頭孢噻肟耐藥的沙門菌同時攜帶qnrA和blaCTX-M-14基因，有幾個研究都指出ESBLs基因與PMQR基因之間可能存在一定的聯(lián)系。這些同時檢測到PMQR和ESBLs相關(guān)基因的菌株不僅對第三代頭孢菌素高度耐藥，對氟喹諾酮類等抗菌藥物的耐藥性也明顯高于其他菌株，呈現(xiàn)多重耐藥。

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