李 倩，袁倩倩，陳 琛，羅雪婷

(湖北第二師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 武漢 430205)

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微囊藻毒素在大白菜、菜薹、茼蒿中的累積

李 倩，袁倩倩，陳 琛，羅雪婷

(湖北第二師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 武漢 430205)

本文主要介紹水中微囊藻毒素(MC)在含量相同且處于促進(jìn)植物生長的濃度時，在大白菜、菜薹及茼蒿的根、莖、葉中的累積含量的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中選用的微囊藻毒素為MC-RR型，濃度為0.001mg·L-1，由此實(shí)驗(yàn)初步可知，在同種濃度的MC-RR作用下，植物的葉片相對于根和莖更容易表現(xiàn)出中毒現(xiàn)象，而在大白菜，菜薹及茼蒿這3種植物中，菜薹的中毒現(xiàn)象表現(xiàn)得最為明顯，而茼蒿受到MC的影響較小，從生長狀況來看，并沒有明顯的中毒跡象。

微囊藻毒素；茼蒿；菜薹；大白菜；累積規(guī)律

1 引言

水體富營養(yǎng)化的加劇從而引發(fā)有害的藻類水華(HAB,harmful algal bloom)的頻繁發(fā)生已經(jīng)成為國內(nèi)外引起廣泛關(guān)注的環(huán)境問題[1]。微囊藻毒素化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，它耐酸耐熱，易溶于水(甲醇或丙酮)，不揮發(fā)不易分解抗pH，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定使得它在自然條件下難以降解，因此在高溫強(qiáng)酸條件下得以保存，而正常的自來水處理工序不能完全將其去除[2]。世界衛(wèi)生組織推薦水中微囊藻毒素含量為1μg/L[3],我國飲用水標(biāo)準(zhǔn)中將微囊藻毒素作為非常規(guī)檢查指標(biāo)[4]，含量要求與世界衛(wèi)生組織相同。

坐落于武漢的東湖在中國是水域面積最廣的城中湖之一，每年夏季東湖都會發(fā)生一定程度的水華，而菜薹、茼蒿、大白菜等農(nóng)作物是武漢的幾種種植作物，根據(jù)已有的文獻(xiàn)可知，水華所產(chǎn)生的微囊藻毒素會在部分植物體內(nèi)的積累，經(jīng)黃藝等人的研究得到每人日允許的MC攝入量為2.5μg/L,體內(nèi)累積毒素的量在達(dá)到25μg/L以上會使身體發(fā)生病變[5]，因此在武漢用東湖水灌溉植物會在哪些植物體內(nèi)累積，以及在這些植物的哪些部位累積，這些毒素通過在食物鏈中的轉(zhuǎn)移進(jìn)而對人體產(chǎn)生危害成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。

大白菜、菜薹、茼蒿都是是武漢主要種植并經(jīng)常食用的幾種農(nóng)作物，微囊藻毒素澆灌這三種植物后，種子的發(fā)芽狀況，成熟后的該三種植物哪一部分積累的MC最多，且是否適于食用都是本實(shí)驗(yàn)研究的指標(biāo)及目的。

MC-RR對蔬菜種子發(fā)芽率的影響較小，但在濃度低于0.01 mg·L-1時仍然可以表現(xiàn)出輕微的促進(jìn)作用，且蔬菜種子發(fā)芽率一般可以穩(wěn)定在為90%以上，當(dāng)MC-RR的濃度為0.01 mg·L-1時對芽伸長有刺激作用，當(dāng)其濃度大于0.05 mg·L-1時則表現(xiàn)為抑制作用[6]。MC在濃度為10～50μg/L時對青菜的根莖的影響沒明顯現(xiàn)象，在500～5000μg/L之間對根的生長都出現(xiàn)不同程度的抑制，抑制作用隨著濃度的增加而遞增，并且都出現(xiàn)了植株矮化，葉片發(fā)黃的中毒癥狀，葉綠素的含量先上升后下降；微囊藻毒素在油菜體內(nèi)的積累隨著濃度的增加而增加[7]，但這些含量的毒素澆灌的蔬菜已經(jīng)會在生長過程中表現(xiàn)出明顯的中毒跡象，因此中毒的蔬菜會被篩選淘汰，最終無法進(jìn)入市場銷售。雖然MC-RR濃度越大，對植物的制毒性越強(qiáng)，最終的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)會更加明顯，但據(jù)資料顯示，東湖的水體一般在7月到10月是水華發(fā)生的高峰期，且其藻毒素毒的濃度卻并不算特別高，本實(shí)驗(yàn)旨在探究藻毒素在植物體內(nèi)的累積規(guī)律。

選用高效液相色譜法作為測定方法[8,9]。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)原料、藥品、設(shè)備與儀器

2.1.1 實(shí)驗(yàn)原料

大白菜種子(優(yōu)選晉菜三號F1，出自聚豐種業(yè))，菜薹種子(銀田紅60，出自長沙市銀田蔬菜種子實(shí)業(yè)有限公司)，大葉茼蒿種子(油青大葉茼蒿608，出自豐農(nóng)種業(yè))，土壤(取自武漢東湖花木城農(nóng)林植林土)，微囊藻毒素(0.001mg·L-1MC-RR溶液)。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

實(shí)驗(yàn)藥品見表1

表1 實(shí)驗(yàn)藥品

2.1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與儀器

實(shí)驗(yàn)設(shè)備與儀器見表2

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與儀器

2.2 分析方法

2.2.1 測定條件

高效液相色譜分析條件[10]：

流動相：V(乙腈)∶V(含0.1%甲酸的純水)=35 ∶65

流速：1.0ml/min

紫外檢測波長238nm

2.2.2 計算方法

用微囊藻的儲備溶液配置不同濃度梯度的微囊藻毒素溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線法方程。實(shí)驗(yàn)過程中用高效液相色譜法測量得到的峰面積帶入方程中計算：

w=100%·y/z

c=x·v/m

a=lx-l0/l0

其中w表示種子的發(fā)芽率；y表示發(fā)芽的種子數(shù)目；z表示每個培養(yǎng)皿中參與實(shí)驗(yàn)的種子數(shù)目；c表示植株體內(nèi)毒素含量(μg/kg)，x表示處理植物后的溶液中微囊藻毒素的含量(mg/L)，v表示處理植物后得到的溶液的體積(ml)，m表示參與測量植株的質(zhì)量(g)。a為促進(jìn)率或抑制率(lx-l0為正則為促進(jìn)，lx-l0為負(fù)則為抑制率)，lx為測量植株株高，l0為空白植株株高。

2.3 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

2.3.1 試劑配置

營養(yǎng)液的配置[11]如表3

表3 營養(yǎng)液的配置

鐵溶液的配置：

稱取EDTA·Na23.77g加熱新煮沸并冷卻的溫?zé)岬恼麴s水中，攪拌溶解，定容至100ml容量瓶密閉避光保存。

稱取FeSO4·7H2O 2.78g 用新煮沸冷卻的蒸餾水溶解，定容至100ml；將上述配置的EDTA·Na2溶液和FeSO4·7H2O溶液等量混合，密閉避光保存。

微囊藻毒素儲備液配置：

用取液槍取50μL甲醇溶解50μg的標(biāo)準(zhǔn)樣品中，再加入4950μL的超純水，混勻，得到10μg/ml的儲備液，放在-20℃存儲備用。

取0.2ml儲備液稀釋至2000ml，配成濃度為0.001mg/L微囊藻毒液用于澆灌。

2.3.2 種子的發(fā)芽實(shí)驗(yàn)

將大白菜、菜薹、茼蒿種子用10%的H2O2消毒30min，后將種子用蒸餾水清洗干凈，取直徑為9cm玻璃培養(yǎng)皿3個，每個鋪上3層濾紙，取三種圓潤飽滿的種子，每種50顆分別放入3個培養(yǎng)皿中，讓每顆種子保持一定的距離，再向培養(yǎng)皿中加入含有微囊藻毒素為0.001mg/L的毒液2ml，以及配置好的營養(yǎng)液3ml。將種子至于室溫(約20℃)和自然光照條件下發(fā)芽生長，保持培養(yǎng)皿的濾紙濕潤(不能使其干涸)，每日更換濾紙并加入同等量的溶液，以保持溶液的濃度不變[12]。

2.3.3 土培實(shí)驗(yàn)

將三種蔬菜在培養(yǎng)皿上培養(yǎng)7天，三種蔬菜的根長基本已經(jīng)超過2cm，再將蔬菜移植至裝有土壤的塑料碗中(直徑是12cm使每個塑料碗中的土壤質(zhì)量和土質(zhì)相同)，每個碗中的植株數(shù)目為5株，保持植株間間距為2cm，移植后每天向塑料碗中加入10ml毒液以及50ml營養(yǎng)液澆灌[6]，培養(yǎng)至第21天，三種植物基本進(jìn)入成熟期。

待用微囊藻毒素土培植物21天后，取大白菜、菜薹、茼蒿植株各5株，將其分為葉部、莖部以及根部，將其至于滅菌鍋中殺菌，在65℃的烘箱中烘干至恒重，再將烘干的植株碾碎，加入2ml的甲醇后，在超聲波破碎儀里破碎細(xì)胞1小時，在4℃的冰箱沉淀24h，沉淀完畢再在離心機(jī)中以4000r/min的轉(zhuǎn)速離心半個小時，吸取上清液過濾存儲于樣品瓶中，保存以檢測，同樣保存于4℃的條件下[7]。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

將配置好的微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成濃度為0.5μg/L、1.0μg/L、1.5μg/L、2.0μg/L、2.5μg/L、3μg/L的MC-RR標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.22μm的微孔濾膜過濾以后進(jìn)樣于高效液相色譜儀，得到毒素含量與峰面積的關(guān)系，所得數(shù)據(jù)用orgin6.0處理后其線性曲線關(guān)系如圖1，由圖可知標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=812.29143x+757.84，R=0.9947，擬合程度較好，具有可信度。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 毒素對種子發(fā)芽率的影響

圖2 發(fā)芽率與發(fā)芽天數(shù)的關(guān)系

如圖2所示，種子發(fā)芽率是隨著發(fā)芽天數(shù)的增加而增大，第5天時種子發(fā)芽率趨于平穩(wěn)，我們可以觀察到，大白菜、菜薹、茼蒿這三種植物在同種濃度的藻毒素作用下，MC-RR對大白菜和菜薹的出芽有明顯的促進(jìn)作用，而茼蒿受藻毒素影響不大甚至基本沒有什么影響。

3.3 微囊藻毒素對大白菜、菜薹、茼蒿生長的影響

根據(jù)培養(yǎng)皿中植株總的生長趨勢可知：在0.001mg/L微囊藻毒素的培養(yǎng)下，初始三種植物的長勢迅猛，且基本毫無中毒跡象,而三種植物中，起初大白菜長勢最為迅猛，從第3天開始菜薹長勢超過大白菜，一直到第7天，菜薹的葉片出現(xiàn)了明顯發(fā)黃的跡象，且菜薹和大白菜基本已經(jīng)長到3cm的長度，而茼蒿一直生長緩慢，到第7天準(zhǔn)備移土栽培時，最高的長度也只有2.1cm。因此從培養(yǎng)皿中的長勢來看，在植物幼苗期，微囊藻毒素在菜薹上作用最為明顯，才僅僅7天葉片的邊緣位置已經(jīng)出現(xiàn)明顯的變黃的跡象(如圖3)，而在大白菜和茼蒿上沒有明顯的變化。

圖3 培養(yǎng)皿中第七天菜薹幼苗情況

3.4 微囊藻毒素在大白菜、菜薹、茼蒿中的積累規(guī)律

圖4 同種濃度下三種植物的根的累積情況

圖5 同種濃度下三種植物的莖的累積情況

圖6 同種濃度下三種植物的葉的累積情況

大白菜、菜薹、茼蒿生長至第21天，分別測量三種植物的根部、莖部、葉部的MC積累量；由數(shù)據(jù)可知對MC的積累量最大是菜薹的葉部，由圖三可知在用0.001mg/L藻毒素處理下菜薹的葉部累積的毒素已經(jīng)達(dá)到了2.91μg/L是三種植物地上部分中含量最多的，而人體每日允許的MC攝入量為2.5μg/L[5],菜薹葉片已經(jīng)不適宜食用，同時在三種植物中高于該指標(biāo)的植物部位還有大白菜的葉片。同時綜合三種植物的分析來看，毒素一般在植物的根與葉中累積的最多，莖中累積的量明顯少于根和葉。

4 結(jié)論

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)研究可知微囊藻毒素對大白菜、菜薹種子的發(fā)芽有明顯的影響，水中MC-RR含量在0.1mg/L以下，種子的發(fā)芽率均在85%以上，毒素對發(fā)芽的有促進(jìn)作用。但這種促進(jìn)作用在茼蒿種子上并沒有明顯表現(xiàn)。

表4 大白菜、菜薹、茼蒿各部位的毒素濃度

同種濃度下，葉部的根、莖部位更易累積毒素。菜苔中毒現(xiàn)象最為明顯，茼蒿受影響較小。

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The Accumulation of Microcystin in Chinese Cabbage, Purple Flowering Stalks and Garden Chrysanthemum

LI Qian, YUAN Qian-qian, CHEN Chen, LUO Xue-ting

(School of Chemistry and Life Science, Hubei University of Education, Wuhan 430205, China)

The frequent occurrence of harmful algal blooms (HAB, algal bloom harmful) induced by eutrophication has become an environmental problem which has aroused widespread concern across the world.[1]This paper mainly introduces the experiment of microcystins’ (MCs) accumulation content in roots, stems and leaves of Chinese cabbage, purple flowering stalks and garden chrysanthemum when microcystin contents in the water are at the same level and promoting plant growth. The MC in the experiment is MC-RR with the concentration of 0.001mg/L. The experiment shows that by the action of same concentration of MC-RR, leaves are more likely to be poisoned than roots and stems. Furthermore, signs of poisoning are most distinct on purple flowering stalks among those three vegetables, while garden chrysanthemum is less affected by MC-RR without any obvious signs of poisoning.

microcystin; garden chrysanthemum; purple flowering stalks; accumulation

2016-07-10

2015年湖北省教育廳指導(dǎo)項(xiàng)目(B2015023)；2015年湖北省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計劃項(xiàng)目

李 倩(1984-)，女，湖北武漢人，博士，研究方向?yàn)橘Y源與環(huán)境綜合利用。

X592

A

1674-344X(2016)08-0032-05