劉建群，張國華，余昭芬，王雪梅（江西中醫(yī)藥大學現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室，南昌　330004）

甘草對大鼠體內雷公藤甲素和雷公藤內酯酮代謝物水平的影響Δ

劉建群＊，張國華，余昭芬，王雪梅（江西中醫(yī)藥大學現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室，南昌330004）

目的：研究甘草對大鼠體內雷公藤甲素（TPL）和雷公藤內酯酮（TPN）內源代謝物水平的影響。方法：取160只大鼠ig甘草[30 g（生藥）/kg]2 h后ip TPN（2.8 mg/kg），連續(xù)30 d，收集24 h尿液，合并30 d尿液，采用柱色譜技術和波譜技術分離鑒定其內源代謝物；并采用超高效液相色譜-高分辨飛行時間質譜聯(lián)用法（UPLC-Q-TOF/MS）確定TPL給藥后是否具有共同代謝物。將60只大鼠隨機分為TPL空白組、TPL組、甘草+TPL組、TPN空白組、TPN組、甘草+TPN組，各給藥組大鼠給藥方式及劑量同上，TPL空白組和TPN空白組大鼠分別ip相應溶劑，每天1次，連續(xù)7 d；采用UPLC-Q-TOF/MS法研究甘草對大鼠體內TPL、TPN內源代謝物水平的影響。結果：從TPN給藥大鼠尿液中共分離出5個內源代謝物，分別鑒定為1-甲基海因、4-氨基煙酸甲酯、3，4-二氫-6-羥基-2-喹啉酮、2，6-二羥基喹啉、2-喹啉酮；TPL給藥后大鼠尿液中同樣存在這5種代謝物。TPL組大鼠尿液中1-甲基海因水平較TPL空白組顯著升高（P＜0.05），TPN組大鼠尿液中2，6-二羥基喹啉水平較TPN空白組顯著升高（P＜0.05）；TPL或TPN聯(lián)合甘草用藥后血清中1-甲基海因、2，6-二羥基喹啉水平均降低，較其空白組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論：本實驗首次從TPL和TPN給藥大鼠尿液中分離鑒定出了5個內源代謝物；甘草能回調TPL給藥大鼠尿液中1-甲基海因水平以及TPN給藥后大鼠尿液中2，6-二羥基喹啉水平。

甘草；雷公藤甲素；雷公藤內酯酮；內源代謝物；大鼠

雷公藤（Tripteryginum Wilfordii Hook.F）屬衛(wèi)茅科植物，臨床上常用于治療類風濕性關節(jié)炎、慢性腎炎、紅斑狼瘡等難治性免疫功能亢進疾病，其良好的臨床療效已得到國內外的一致肯定，但是雷公藤也是不良反應報道最多的中草藥之一[1]。雷公藤甲素（Triptolide，TPL）和雷公藤內酯酮（Triptonide，TPN）是雷公藤的主要活性成分，是一類環(huán)氧二萜內酯化合物，具有顯著的免疫抑制、抗炎、抗腫瘤和抗生育等活性；但同時也是其主要毒性成分，具有很強的肝臟、腎、心臟和生殖系統(tǒng)等毒性[1]。雖然其毒副作用制約了雷公藤類藥物的臨床應用，但是從治療類風濕性關節(jié)炎療效來看，目前還沒有其他藥物能夠取代雷公藤類藥物。據(jù)研究報道，甘草對雷公藤類藥物具有確切的減毒作用，但是其減毒作用機制尚不清楚[2]。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)，甘草能顯著降低TPL和TPN的最大血藥濃度和藥時曲線下面積，增加清除率，加速其體內代謝和排泄，降低組織分布濃度[3-4]。甘草具有肝藥酶誘導作用[5]，而體內酶系是藥物代謝變化的本質因素，故甘草還可能通過干預內源性代謝物通路，即干預藥物代謝組學，從而影響TPL和TPN的毒性。因此，在本文中筆者擬從干預內源性代謝物通路的角度來探討甘草對TPL和TPN的減毒機制。

1　材料

1.1儀器

AE-240十萬分之一分析天平（瑞士梅特勒公司）；TL-5.0W臺式離心機（上海市離心機械研究所）；Agilent 1260自動超高效液相色譜（UPLC）儀（美國Agilent公司）；Triple TOF 5600+高分辨飛行時間質譜（Q-TOF/MS）儀（美國AB Sciex公司）；2-16K臺式高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；Microfuge 16臺式微量離心機（美國Beckman公司）；Bruker AV-500核磁共振波譜（NMR）儀（瑞士Bruker公司）。

1.2藥材、對照品與試劑

甘草（購自亳州市長生中藥飲片有限公司，批號：130902，經劉建群教授本人鑒定為甘草的干燥根和根莖）；TPL、TPN對照品（鄭州豐耀農業(yè)科技有限公司，批號：FY140320、FY140325，純度：≥99%）；聚氧乙烯氫化蓖麻油（RH40，德國BASF公司）；乙腈（美國ACS公司，色譜純）；2-氯-L-苯丙氨酸（美國阿拉丁公司，批號：C105993，純度：≥98.5%）；甲酸為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.3動物

SD大鼠220只，SPF級，♀♂各半，體質量200～220 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[許可證號：SCXK（湘）2013-0004]。

2　方法與結果

2.1溶液的制備

2.1.1甘草溶液精密稱取甘草藥材800 g，切片，加4倍量水煎煮2次，每次1 h，過濾，合并濾液，減壓蒸干，得甘草浸膏約80 g，用適量蒸餾水將浸膏制備成以生藥量計質量濃度為10 g/ml的甘草溶液，備用。

2.1.2TPL溶液精密稱取TPL對照品2.0 mg，置于10 ml量瓶中，用20%丙二醇生理鹽水溶液溶解并稀釋至刻度，即得質量濃度為0.2mg/ml的TPL溶液，備用。

2.1.3TPN溶液精密稱取TPN對照品3.0 mg，置于10 ml量瓶中，加入無水乙醇1 ml，超聲溶解后，加入1 ml RH40，混勻后，加入生理鹽水溶液至刻度，即得質量濃度為0.3 mg/ml的 TPN溶液，備用。

2.1.4內標溶液稱取2-氯-L-苯丙氨酸50 mg，用甲醇定容于50ml量瓶中，備用。

2.2內源代謝物的提取、分離與鑒定

2.2.1內源代謝物提取與分離取大鼠160只，以30 g（生藥）/kg的劑量ig甘草溶液2 h后ip TPN溶液，放入代謝籠中，自由飲水，連續(xù)給藥30 d。收集24 h尿液，將30 d內收集的尿液合并。尿液減壓濃縮后用甲醇沉淀蛋白，過濾，將濾液減壓濃縮得浸膏；浸膏用水溶解后，依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取，減壓濃縮回收溶劑，得乙酸乙酯部位71 g。將乙酸乙酯部位經MCI色譜柱層析，甲醇-水梯度洗脫（0∶1、1∶9、1∶3、2∶3、11∶9、7∶3、17∶3、1∶0，V/V），得8個流份。將MCI色譜柱甲醇-水（1∶9）流份經ODS色譜柱層析，甲醇-水梯度洗脫（0∶1、3∶7、1∶1、7∶3、1∶0），得甲醇-水（3∶7）流份再經硅膠色譜柱層析，氯仿-甲醇梯度洗脫（50∶1、40∶1、30∶1），氯仿-甲醇（30∶1）流份析出化合物1。將MCI色譜柱甲醇-水（1∶3）流份經ODS色譜柱層析，甲醇-水梯度洗脫（0∶1、3∶7、1∶1、7∶3、1∶0），得甲醇-水（1∶1）流份再經硅膠色譜柱層析，氯仿-甲醇梯度洗脫（1∶0、20∶1、5∶1、1∶1、0∶1），氯仿-甲醇（20∶1）流份析出化合物2。將MCI色譜柱甲醇-水（2∶3）流份經中性氧化鋁色譜柱層析，依次用二氯甲烷、二氯甲烷-乙酸乙酯（1∶1）洗脫，得二氯甲烷-乙酸乙酯（1∶1）流份再經高效液相色譜法制備[Diamonsieuil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速：1 ml/min，柱溫：30℃，檢測波長：218 nm，流動相：乙腈-水，梯度條件：0 min→30 min（12%乙腈）→31 min（100%乙腈）→35 min（100%乙腈）]，收集保留時間為7.2～7.9 min的流份，析出化合物3和化合物4。將MCI色譜柱甲醇-水（11∶9）流份經ODS色譜柱層析，甲醇-水梯度洗脫（0∶1、10∶1、5∶1、1∶1、1∶0），甲醇-水（1∶1）流份析出化合物5?；衔锞捎眉状贾亟Y晶純化。

2.2.2內源代謝物結構的鑒定化合物1，無色方晶（甲醇）。ESI-MS m/z：[M+H]+115、[M+Na]+137、[M-H]－113，HR-TOF/ MS m/z：[M+H]+115.050 9，分子式為C4H6N2O2。1H-NMR（300 MHz，CD3OD）δH：3.96（2H，s，H-5）、2.91（3H，s，CH3）。13C-NMR（75 MHz，CD3OD）δ：157.0（C-2）、173.8（C-4）、53.9（C-5）、29.2（CH3）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[6]報道基本一致，并進一步通過單晶X衍射圖譜確定化合物1為1-甲基海因。晶體參數(shù)如下：C4H6N2O2，M＝114.11，T＝293（2）K，l＝0.710 73 ?，單斜晶系，P21/C，a＝5.6170（11），b＝12.173（2），c＝8.096 0（16）?，V＝533.02（18）?3，z＝4，Dc＝1.422 mg/m3，（Mo Ka）＝0.074 mm－1，F(xiàn)（000）＝240?；衔?單晶X衍射結構圖見圖1。

圖1　化合物1單晶X衍射結構圖Fig 1　X-ray crystal structure of compound 1

化合物2，白色針狀結晶（甲醇）。ESI-MS m/z：[M+H]+153、[M+Na]+175、[M+Cl]－187，HR-TOF/MS m/z：[M+H]+153.066 4，分子式為C7H8N2O2。1H-NMR（500 MHz，CD3OD）δH：8.55（1H，d，J＝2.4 Hz，H-2）、6.52（1H，d，J＝7.4 Hz，H-5）、7.72（1H，dd，J＝7.4、2.4 Hz，H-6）、3.81（3H，s，H-CH3）；13C-NMR（125 MHz，CD3OD）δ：147.7（C-2）、119.7（C-3）、168.3（C-4）、121.3（C-5）、143.7（C-6）、178.8（C＝O）、44.8（CH3）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[7]報道基本一致，故確定化合物2為4-氨基煙酸甲酯。

化合物3，白色針狀結晶（甲醇）。ESI-MS m/z：[M+H]+164、[M+Na]+186、[M+Cl]－198，HR-TOF/MS m/z：[M+H]+164.071 0，分子式為C9H9NO2。1H-NMR（300 MHz，CD3OD）δH：2.51（2H，t，J＝7.7 Hz，H-3）、2.86（2H，t，J＝7.7 Hz，H-4）、6.57（1H，d，J＝2.4 Hz，H-5）、6.62（1H，dd，J＝8.4，2.4 Hz，H-7）、6.69（1H，d，J＝8.4 Hz，H-8）。13C-NMR（75 MHz，CD3OD）δ：173.6（C-2）、31.5（C-3）、26.4（C-4）、115.7（C-5）、154.5（C-6）、114.8（C-7）、117.5（C-8）、126.6（C-9）、131.2（C-10）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[8]報道基本一致，故確定化合物3為3，4-二氫-6-羥基-2-喹啉酮。

化合物4，淡黃色粉末（甲醇）。ESI-MS m/z：[M+H]+162、[2M+H]+323、[M+Na]+184、[M+Cl]－196，HR-TOF/MS m/z：[M+H]+162.055 4，分子式C9H7NO2。1H-NMR（300 MHz，CD3OD）δH：6.60（1H，d，J＝9.6 Hz，H-3）、7.86（1H，d，J＝9.6 Hz，H-4）、7.03（1H，d，J＝2.0 Hz，H-5）、7.10（1H，dd，J＝9.0、2.0 Hz，H-7）、7.25（1H，d，J＝9.0 Hz，H-8）。13CNMR（75 MHz，CD3OD）δ：164.8（C-2）、121.8（C-3）、142.3（C-4）、112.6（C-5）、154.4（C-6）、121.6（C-7）、117.8（C-8）、122.4（C-9）、133.3（C-10）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[9]報道基本一致，故確定化合物4為2，6-二羥基喹啉。

化合物5，白色粉末（甲醇）。ESI-MS m/z：[M+H]+146、[M+Na]+168，HR-TOF/MS m/z：[M+H]+146.060 6，分子式為C9H7NO。1H-NMR（300 MHz，CD3OD）δH：6.61（1H，d，J＝9.5 Hz，H-3）、7.96（1H，d，J＝9.5 Hz，H-4）、7.67（1H，d，J＝7.8 Hz，H-5）、7.26（1H，dd，J＝7.8、7.6 Hz，H-6）、7.55（1H，dd，J＝8.2、7.6 Hz，H-6）、7.36（1H，d，J＝8.2 Hz，H-8）。13CNMR（75 MHz，CD3OD）δ：161.9（C-2）、121.8（C-3）、142.8（C-4）、129.2（C-5）、124.0（C-6）、132.0（C-7）、116.7（C-8）、138.8（C-9）、119.0（C-10）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[10]報道基本一致，故確定化合物5為2-喹啉酮。

因TPL與TPN具有相似的結構和毒性機制，筆者推測TPL在大鼠體內可能產生與TPN相似的內源代謝物，經UPLC-QTOF/MS測定發(fā)現(xiàn)TPL給藥組同樣具有化合物1～5的內源代謝物（具體檢測條件見“2.3.2”項下）。

2.3內源代謝物檢測

2.3.1大鼠分組、給藥及樣品處理 （1）分組與給藥。SD大鼠60只，隨機分為TPL空白組、TPL組、TPL+甘草組、TPN空白組、TPN組和TPN+甘草組，每組10只。TPL空白組大鼠ip 20%丙二醇生理鹽水溶液；TPL組大鼠按0.7 mg/kg的劑量ip TPL溶液；TPN空白組大鼠ip 10%乙醇+10%RH40生理鹽水溶液：TPN組大鼠按2.8 mg/kg的劑量ip TPN溶液；聯(lián)合給藥組大鼠在ip TPL或TPN溶液之前2 h以30 g（生藥）/kg的劑量ig甘草溶液。TPL和TPN的給藥劑量均約為其半數(shù)致死量，以造成急性毒性模型。各組大鼠均在每天早上固定時間給藥，連續(xù)給藥7d。

（2）尿樣采集。采用大鼠代謝籠法收集6組大鼠每天10：30到16：30的尿液。給藥及收集尿液期間大鼠自由飲水，但每天從22：30到第2天16：30禁食。

（3）樣品處理。將“2.3.2”項下收集的各組大鼠尿液以4 300× g離心10 min，取上清液1 ml，加入1 ml甲醇，混勻，靜置，然后再次在4℃、21 920×g條件下離心10 min。取上清液1.5 ml，加入0.1 ml 2-氯-L-苯丙氨酸內標參比溶液，混勻，置－20℃冰箱保存，用于UPLC-Q-TOF/MS分析。

（4）5個內源代謝物混合對照品溶液制備。精密稱取各對照品，用甲醇制備成質量濃度為0.1mg/ml的混合對照品溶液。2.3.2UPLC-Q-TOF/MS測定 （1）色譜條件。色譜柱：Thermo C18（100 mm×2.1 mm，2.2 μm）；流動相A：0.1%甲酸水溶液，B：乙腈（梯度洗脫：0～4 min，5%→5%B；4～19 min，5%→21%B；19～25 min，21%→100%B；25～30 min，100%B；30～30.1 min，100%→5%B；30.1～35 min，5%B）；流速：0.3 ml/ min；柱溫：30℃；進樣量：2μl。

（2）質譜條件。正離子源噴霧電壓：5 500V；離子源溫度：600℃；裂解電壓（DP）：100 V；碰撞能量（CE）：55 eV；碰撞能量擴展（CES）：20 eV；霧化氣體：氮氣，輔助氣（GS）1、2均為60 Psi，氣簾氣（CUR）為35 Psi；一級質譜母離子掃描范圍為50～500，信息關聯(lián)數(shù)據(jù)采集（IDA），設置響應值超過10 cps的6個最高峰進行二次質譜掃描，子離子掃描范圍為50～500。

（3）數(shù)據(jù)處理。計算各組5個內源代謝物分子離子峰（[M+H]+）面積與內標峰面積的相對比值，以表示各內源代謝物的水平。采用SPSS 11.5軟件進行統(tǒng)計分析，組間差異比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2.3.3UPLC-Q-TOF/MS分析結果隨著給藥天數(shù)的增加，TPL組大鼠尿液中1-甲基海因水平呈上升趨勢，到給藥第5、6天達到最高水平，與TPL空白組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而TPL與甘草聯(lián)合給藥后，大鼠尿液中1-甲基海因的水平回落，與TPL空白組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。隨著給藥天數(shù)的增加，TPN組大鼠尿液中2，6-二羥基喹啉的水平升高，與TPN空白組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而TPN與甘草聯(lián)合給藥后，大鼠尿液中2，6-二羥基喹啉的水平回落，與TPN空白組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。以上結果提示，1-甲基海因和2，6-二羥基喹啉可能分別為TPL和TPN的毒性生物標志物，預先給予甘草溶液后這2個內源代謝物水平得到回調。然而各組中其余內源代謝物的水平差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），這提示這些未有變化的內源代謝物可能與TPL或TPN的毒性無關，故其圖略。TPL 3個組大鼠尿液中1-甲基海因隨給藥天數(shù)變化的趨勢見圖2，TPN 3個組大鼠尿液中2，6-二羥基喹啉隨給藥天數(shù)變化的趨勢見圖3。

3　討論

采用柱色譜和核磁共振等技術從大鼠尿液中分離鑒定了5個內源代謝物，這5個內源代謝物均為首次從大鼠尿液中分得。通過對空白組與TPL或TPN單獨給藥組組間大鼠尿液中內源代謝物的差異性分析，發(fā)現(xiàn)1-甲基海因和2，6-二羥基喹啉可能分別為TPL和TPN毒性生物標記物。與空白組相比，TPL組或TPN組大鼠尿液中這2個毒性生物標記物的水平均上調，預先給予甘草后這2個內源代謝物水平又得到回調。

其中，1-甲基海因具有良好的平喘鎮(zhèn)咳和抗抑郁等活性[11-12]。1-甲基海因是肌酐的體內代謝物，對人腎小管上皮細胞具有一定的細胞毒和誘導凋亡作用，其是肌酐降解成甘氨酸的中間產物[13]。1-甲基海因還涉及精氨酸、脯氨酸、脲循環(huán)等代謝途徑[14]。肌酐是腎損傷的重要生化指標之一。TPL具有較強腎毒性，能導致肌酐顯著升高[15]，從而可能導致其中間代謝物1-甲基海因水平的上調，因此1-甲基海因可能為TPL的腎毒性生物標志物。甘草能回調1-甲基海因，說明甘草對TPL造成的腎損傷具有一定的保護作用。2，6-二羥基喹啉即6-羥基-2（1H）-喹啉酮及其衍生物具有抗菌和正性肌力活性，是合成強心、降壓、治療糖尿病、促進腦循環(huán)、抗哮喘和抗?jié)兯幬锏闹匾虚g體，是細菌降解喹啉的中間代謝物之一，也是動物體內喹啉和色氨酸的代謝物[16]，由于體內的色氨酸95%以上由肝細胞代謝，肝功能障礙可明顯影響色氨酸在體內的代謝狀態(tài)[17]。研究結果表明，TPN能誘導2，6-二羥基喹啉上調，甘草能起回調作用。TPN的毒性以及甘草的解毒作用可能與色氨酸代謝有關。

圖2　TPL空白組、TPL組、TPL+甘草組大鼠尿液中1-甲基海因隨給藥天數(shù)變化的趨勢Fig 2　Trend of 1-methylhydantoin in urine of rats in TPL blank group，TPL group，TPL+G.uralensis group with the days of administration

圖3　TPN空白組、TPN組、TPN素+甘草組大鼠尿液中2，6-二羥基喹啉隨給藥天數(shù)變化的趨勢Fig 3　Trend of 2，6-quinolinediol in urine of rats in TPN blank group，TPN group，TPN+G.uralensis group with the days of administration

綜上所述，TPL和TPN的毒性以及甘草的解毒作用可能與其干擾了肌酐、精氨酸、脯氨酸、脲循環(huán)以及色氨酸等代謝途徑有關。

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（編輯：林靜）

Effects of Glycyrrhiza uralensis on Metabolites Levels of Triptolide and Triptonide in Rats

LIU Jianqun，ZHANG Guohua，YU Zhaofen，WANG Xuemei（Key Lab of Modern Preparation of TCM，Ministry of Education，Jiangxi University of TCM，Nanchang 330004，China）

OBJECTIVE：To study the effects of Glycyrrhiza uralensis on endogenous metabolites levels of triptolide（TPL）and triptonide（TPN）in rats.METHODS：160 rats were given G.uralensis[30 g（crude drug）/kg]intragastrically，2 h later given TPN（2.8 mg/kg）intraperitoneally for consecutive 30 d.24 h urine were collected for 30 days，and then endogenous metabolites were separated and identified by column chromatograph and spectrum technology.UPLC-Q-TOF/MS was used to determine the common metabolites after giving TPL.60 rats were randomly divided into TPL blank group，TPL group，G.uralensis+TPL group，TPN blank group，TPN group，G.uralensis+TPN group.Route of administration and dosage of treatment groups were same as above groups.TPL blank group and TPN blank group were given corresponding solvent，once a day，for consecutive 7 d.UPLC-QTOF/MS was used to determine the endogenous metabolites of TPL and TPN in rats.RESULTS：Five endogenous metabolites were isolated and identified from urine of rats after given TPN，as 1-methylhydantoin，methyl 4-aminonicotinate，3，4-dihydro-6-hydroxy-2（1H）-quinolinone，2，6-quinolinediol，2-quinolone，respectively.Those five metabolites were also found in urine of rats after giving TPN.1-methylhydantoin in TPL group and 2，6-quinolinediol in TPN group were significantly increased，compared with TPL blank group or TPN blank group（P＜0.05）；while urine levels of 1-methylhydantoin and 2，6-quinolinediol decreased after TPL or TPN combining with G.uralensis，compared with TPL/TPN blank group，with no significant difference（P＞0.05）.CONCLUSIONS：The above five endogenous metabolites were isolated from rat urine after given TPL or TPN for the first time.The levels of 1-methylhydantoin after giving TPL and 2，6-quinolinediol in urine after giving TPN can be recovered by G.uralensis.

Glycyrrhiza uralensis；Triptolide；Triptonide；Endogenous metabolite；Rats

R917

A

1001-0408（2016）28-3914-04

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.28.08

國家自然科學基金資助項目（No.81160541）；江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研計劃項目（No.2011A143）

＊教授，博士。研究方向：中藥藥效物質基礎及質量評價。電話：0791-87119027。E-mail：liu5308@sina.com

（2016-02-02

2016-05-31）