陳作觀，刁永鵬，吳志遠，閆 盛，李擁軍

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院血管外科，北京 100730

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·論 著·

人臍帶血CD34+細胞誘導(dǎo)小鼠缺血肢體血管生成

陳作觀，刁永鵬，吳志遠，閆 盛，李擁軍

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院血管外科，北京 100730

目的 觀察體外增殖的人臍帶血CD34+細胞對缺血肢體血管生成的影響，探討CD34+細胞與血管生成的關(guān)系。方法 采集人臍血細胞并進行CD34+細胞的提取、培養(yǎng)。建立小鼠左后肢缺血模型并隨機分為CD34+細胞增殖組(n=5)、CD34+細胞組(n=5)和空白對照組(n=5)3組。采用DiI標(biāo)記CD34+細胞示蹤顯像和抗人核抗原抗體(HNA)免疫組織化學(xué)方法評估人CD34+細胞向缺血區(qū)域的遷移能力，肢體溫度、CD31免疫組織化學(xué)方法和轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)m RNA表達評估缺血肢體血流改善情況。結(jié)果 DiI標(biāo)記示蹤及HNA顯色可見擴增的CD34+細胞出現(xiàn)在小鼠缺血下肢的肌肉組織中并分布在血管周圍。注射液體后第14天(t=5.421，P=0.001；t=0.616，P=0.000)和第28天(t=10.780，P=0.000；t=12.123，P=0.000)，CD34+細胞增殖組和CD34+細胞組的溫度改變百分比均明顯高于對照組。注射液體后第28天，CD34+細胞增殖組和CD34+細胞組毛細血管密度分別為592.3±24.6(t=26.386，P=0.000)和530.7±25.5(t=21.502，P=0.000)，均明顯高于對照組的219.7±19.9；CD34+細胞增殖組和CD34+細胞組的TGF-β1mRNA表達量分別為(0.578±0.050)(t=12.376，P=0.000)和(0.504±0.080)copies(t=7.098，P=0.000)，均明顯高于對照組的(0.224±0.040)copies。結(jié)論 體外培養(yǎng)的人臍帶血CD34+細胞能向缺血區(qū)富集并誘導(dǎo)血管生成，促進血流復(fù)通，有望成為治療下肢缺血的有效途徑。

血管生成；CD34+細胞；臍帶血干細胞；肢體缺血；動物實驗

ActaAcadMedSin，2016,38(5)：491-496

隨著中國人口迅速老齡化，外周動脈性疾病(peripheral arteries disease，PAD)普遍增多[1]。PAD增加了心肌梗死、缺血性腦卒中發(fā)生率，并可導(dǎo)致功能障礙，影響生活質(zhì)量[2]。盡管新藥物、支架和搭橋技術(shù)迅猛發(fā)展，但對于治療PAD合并慢性基礎(chǔ)疾病的臨床效果并不令人滿意，重度下肢缺血患者截肢率和院內(nèi)死亡率仍然較高[3]。因此人們開始尋求新的治療方式，研究生長因子及干細胞促進血管生成的臨床價值。

早期多種心肌缺血動物模型研究表明，高CD34+表達的內(nèi)皮祖細胞能夠向缺血區(qū)富集并促進新生血管形成，這種富集作用在某種程度上相當(dāng)于向心肌梗死缺血區(qū)域直接注射該細胞[4]。2005年，Yoshioka等[5]在猴子模型中證實CD34+細胞能改善缺血區(qū)域的血流量。2006年，Kawamoto等[6]在小鼠模型中證實CD34+能提高缺血肢體的毛細血管密度。2007年，Zhang等[7]在豬模型中證實CD34+細胞能改善缺血心肌的心臟功能。2013年，Yip等[8]在鼠下肢缺血模型中證實CD34+的內(nèi)皮祖細胞(CD34+)能參與血管生成并促進下肢血流的恢復(fù)。Tepekoylu等[9]研究證實，干細胞治療對缺血性心臟病和下肢疾病都是可行的。此外，Lara-Hernandez等[10]開展了一項納入28位嚴(yán)重下肢缺血患者的臨床研究，結(jié)果顯示CD34+內(nèi)皮祖細胞植入能夠提高組織灌注量并降低截肢率。因此，通過干細胞移植促進血管再生方式對缺血性疾病治療具有巨大前景，而臍帶間充質(zhì)干細胞可以作為基于細胞的生物治療的理想選擇。

早期研究表明，當(dāng)擴增的CD34+細胞被移植到亞致死照射的NOD/SCID老鼠體內(nèi)，這些細胞可轉(zhuǎn)移至骨髓中并分化成CD19+B細胞、CD33+髓樣細胞、CD34+干/祖細胞、CD14+單核細胞和CD42+巨核細胞系，且擴增的細胞具有長期移植的潛能[11]。此外，當(dāng)在NOD/SCID老鼠皮下植入附有擴增的臍帶血CD34+細胞的多孔聚合板，可以發(fā)現(xiàn)CD34+在聚合板中啟動了新生血管的形成[12]。本研究采用一種新的無血清體外培養(yǎng)臍帶血細胞(umbilical cord blood，UCB)的方法，擴增后的細胞群以高量表達CD34+為特征并含有更多的原始干/祖細胞，觀察了體外增殖的人臍帶血CD34+細胞對缺血肢體血管生成的影響，探討了CD34+細胞與血管生成的關(guān)系。

材料和方法

實驗動物及分組 雌性ICR 小鼠15 只(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)，SPF 級，6 周齡，體質(zhì)量25～30 g。按隨機數(shù)字表法分為CD34+細胞增殖組、CD34+細胞組和空白對照組，每組5只。標(biāo)準(zhǔn)飼料分籠飼養(yǎng)，自由飲食，室溫(22±2) ℃，相對濕度50%～ 70%，12 h 光照交替(光照:8:00～20:00；黑暗:20:00～次日8:00)。實驗動物許可證號：SCXK (京) 2009- 0015。動物實驗經(jīng)北京協(xié)和醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

UCB采集 北京協(xié)和醫(yī)院行傳染性疾病常規(guī)篩查(包括人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等)確認為健康的產(chǎn)婦，簽署知情同意書后，在行剖宮產(chǎn)的過程中，采用標(biāo)準(zhǔn)臍帶血采集盒經(jīng)臍靜脈收集UCB，標(biāo)本在采集后2 h內(nèi)處理。

CD34+細胞分離 UCB處理過程主要參照Rubinstein等[13]方法并做簡單調(diào)整，具體為：通過加入質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)6%羥乙基淀粉將紅細胞移除后室溫下培育45～60 min；收集富含白細胞的血漿成分，3000 r/min(r=10 cm)離心10 min后移除血漿上清液；在剩余細胞顆粒加入5～10 ml的裂解液，室溫下放置8～10 min，然后用PBS和2%牛胎兒血清進行洗滌，剩下富含白細胞顆粒物將用于CD34+細胞分離。最后采用免疫磁珠法富集CD34+細胞。

CD34+細胞擴增 以StemlineTMStem Cell Expansion Medium作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入干細胞因子、血小板生成因子和粒細胞集落刺激因子3種低濃度細胞因子(均為100 ng/ml)。無血清造血干細胞(hematopoietic stem cell，HSC)擴增培養(yǎng)基均在制備好1周內(nèi)使用。加入CD34+細胞培育前，HSC需要在37 ℃、5% CO2條件下溫育30 min。將新鮮富集的CD34+細胞(>75% CD34+)[14]用于CD34+細胞組模型建立。

將包含50萬個CD34+細胞的13 ml無血清基質(zhì)加入到T- 25組織培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2的環(huán)境下培育7 d，隨后采用細胞計數(shù)器計算CD34+細胞倍增數(shù)量，并配置于PBS+0.1%BSA的溶液中，CD34+細胞濃度以6.67×105個/0.1 ml為宜。

CD34+擴增細胞性能評價

DiI標(biāo)記示蹤：將培養(yǎng)擴增CD34+細胞進行DiI標(biāo)記，采用顯微鏡檢測DiI分布評估CD34+細胞遷移情況。

免疫組織化學(xué)檢測：冰凍切片組織中加入單克隆小鼠抗人核抗原抗體(antihuman nuclear antigen antibody，HNA)并進行培育。經(jīng)緩沖液封閉后，放置于第一抗體中，4 ℃下過夜保存。第2天，加入堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗鼠IgG免疫球蛋白二抗體，孵育后再用DAPI染細胞核。采用熒光顯微鏡觀察DAPI染色情況，對于無DAPI顯示區(qū)域用Leica共聚焦顯微鏡分析。

動物模型及分組 全麻下將 BALB/C小鼠左后肢股動脈進行結(jié)扎，右側(cè)肢體血管不做處理。根據(jù)以往建模經(jīng)驗[15]，術(shù)后7 d注射相應(yīng)液體。實驗分以下3組：(1)對照組：注入PBS+0.1%BSA混懸液0.1 ml，兩側(cè)后肢各0.05 ml。(2)CD34+細胞組：注入未經(jīng)增殖的CD34+細胞懸液0.1 ml，約含72 610個CD34+細胞，兩側(cè)后肢各0.05 ml。(3)CD34+細胞增殖組：往小鼠后肢腓腸肌內(nèi)注入增殖后的CD34+細胞懸液0.1 ml，約含6.67×105個CD34+細胞，兩側(cè)后肢各0.05 ml。因小鼠對缺血耐受有個體差異，本研究將小鼠數(shù)量增加至每組5只。本研究所有動物實驗過程均按照醫(yī)院動物管理委員會的要求進行。

小鼠肢體溫度檢測 采用紅外線熱像儀分別檢測注射液體后第3、7、14及28天小鼠缺血側(cè)與非缺血側(cè)下肢溫度變化情況，記錄溫度改變百分?jǐn)?shù)，即缺血性肢體溫度/非缺血肢體溫度。

CD31免疫組織化學(xué)染色 注射液體后第28天后處死所有裸鼠，取下肢缺血的肌肉標(biāo)本，標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定24 h后包埋于石蠟中并切成4 μm薄片。采用小鼠抗小鼠的CD31抗體(1∶200 稀釋)著色。在每個缺血肌肉標(biāo)本中隨機選擇10個區(qū)域，200倍光學(xué)顯微鏡下對毛細血管進行計數(shù)。

RT-PCR檢測 采用RT-PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1) mRNA表達水平，具體為：從各組中采集標(biāo)本后分別用RNA試劑盒分離(Qiagen)提取mRNA，采用TaqMan反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，美國伯樂170- 9780IQ5PCR檢測系統(tǒng)測定TGF-β1和β-actin mRNA的表達水平。25 μl反應(yīng)混合物中包含：(1)12.5 μl PCRSYBR Green 染料；(2)10ngcDNA模板；(3)小鼠β肌動蛋白表達的正向5’-CGTCTTCCCCTCCATCG- 3’和反向5’-CTCGTTAATGTCACGCAC- 3’引物，小鼠TGF-β1 mRNA表達的正向5’-GCAACAATTCCTGGCGTTA- 3’和反向5’-GCCCTGTATTCCGTCTCCTT- 3’引物；以Ct值來進行測定。

統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

臍血CD34+細胞體外擴增效率 富含CD34+的UCB在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后，采用細胞計數(shù)器法評估有核細胞擴增效率，結(jié)果顯示平均倍增 7.430±0.31(n=3)。

CD34+擴增細胞性能評價結(jié)果 注射液體后第28天，DiI分布檢測結(jié)果顯示，在缺血下肢的腓腸肌束和毛細血管周圍可見DiI顯影(圖1)。HNA染色結(jié)果顯示，在注射經(jīng)擴增的CD34+細胞液體后28天，缺血性后肢腓腸肌束和毛細血管周圍能發(fā)現(xiàn)HNA陽性細胞，且部分HNA陽性細胞融合在血管壁內(nèi)(圖2)。

血流復(fù)通結(jié)果 建模后3組小鼠缺血側(cè)肢體溫度均明顯下降，3組間肢體溫度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。注射液體后隨時間推移，3組小鼠缺血后肢溫度逐漸上升，溫度改變百分比逐步升高，以CD34+增殖組最明顯，對照組最慢；注射后第14天(t=5.421，P=0.001；t=0.616，P=0.000)和第28天(t=10.780，P=0.000；t=12.123，P=0.000)，CD34+細胞增殖組和CD34+細胞組溫度改變百分比均明顯高于對照組；CD34+細胞增殖組與CD34+細胞組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.000，P=1.000；t=0.660，P=0.528)(圖3、4)。

紅點為DiI標(biāo)記的CD34+細胞(箭)，藍點表示肌束和毛細血管

Red dots indicate expanded CD 34+cells labelled with DiI dye (arrow) and blue dots indicate muscle bundle and capillary vessels

圖 1 DiI標(biāo)記的CD34+細胞示蹤(×200)

Fig 1 CD34+cells traced by DiI dye(×200)

HNA:抗人核抗原抗體;血管周圍HNA+細胞(箭頭)，融合在血管壁內(nèi)的HNA+細胞(箭)

HNA:antihuman unclear antigen antibody；HNA+cells in the vicinity of the blood vessel and within infarcted muscle (arrowhead)； HNA+cells incorporated in the endothelial lining of a small blood vessel (arrow)

圖 2 HNA免疫組織化學(xué)分析(×200)

Fig 2 HNA immunohistochemical staining (×200)

各組小鼠CD31染色結(jié)果比較 注射液體后第28天，血管密度定性分析結(jié)果顯示，CD34+細胞增殖組和CD34+細胞組缺血性后肢腓腸肌的毛細血管密度均高于對照組(圖5)。在200倍顯微鏡下根據(jù)CD31染色情況進行毛細血管數(shù)量計數(shù)，結(jié)果顯示，CD34+細胞增殖組和CD34+細胞組毛細血管密度分別為592.3±24.6(t=26.386，P=0.000)和530.7±25.5(t=21.502，P=0.000)，均明顯高于對照組的219.7±19.9；CD34+細胞增殖組和CD34+細胞組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.704，P=0.067)。非缺血側(cè)肢體未見組間CD31染色差異。

TGF-β1mRNA的表達 CD34+細胞增殖組和CD34+細胞組TGF-β1mRNA表達量分別為(0.578±0.050)(t=12.376，P=0.000)和(0.504±0.080)copies(t=7.098，P=0.000)，均明顯高于對照組的(0.224±0.040)copies。CD34+細胞增殖組和CD34+細胞組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.697，P=0.128)。

討 論

郝牧等[16]研究結(jié)果顯示，UCB的內(nèi)皮組細胞在促進缺血性肢體新生血管的形成及治療缺血性疾病中有一定價值。大規(guī)模動物研究和臨床試驗證據(jù)也表明，UCB內(nèi)皮祖細胞的各類細胞成分中以CD34+細胞為主，其誘導(dǎo)缺血組織新生血管生成的能力主要是通過CD34+細胞來實現(xiàn)的[17]。由于CD34+細胞來源并不豐富，因此人們嘗試了不同的細胞擴增培養(yǎng)方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同培養(yǎng)方法的CD34+細胞倍增數(shù)從3.4至10.61不等[12]。本研究采用了一種新的無血清體外培養(yǎng)基對CD34+細胞進行培養(yǎng)擴增，結(jié)果顯示，CD34+細胞平均倍增數(shù)為7.430±0.31，且在該培養(yǎng)基下擴增的細胞并未加速衰老，說明該培養(yǎng)基擴增效率和質(zhì)量的有效性，也保證了CD34+細胞用于后續(xù)模型研究的可行性。

有研究表明，當(dāng)每只小鼠注射的CD34+細胞數(shù)量級達到105時，對促進缺血性肢體新生血管生成的意義較大[18]。因此在本研究中，CD34+細胞增殖組中每只小鼠注射6.68×105個擴增的CD34+細胞，CD34+細胞組中每只小鼠注射104數(shù)量級的CD34+，對照組未注射相應(yīng)的細胞。本研究首先通過示蹤DiI標(biāo)記的擴增CD34+細胞發(fā)現(xiàn)，CD34+細胞主要分布于血管和肌肉束周圍，而非隨機分布于肢體缺血區(qū)域。隨后的CD34+細胞增殖組缺血組織標(biāo)本HNA免疫組織化學(xué)染色陽性結(jié)果表明，在小鼠體內(nèi)出現(xiàn)了人的細胞，且主要分布于血管周圍，甚至部分參與了血管壁的形成。因此，通過DiI示蹤及HNA免疫組織化學(xué)結(jié)果均表明，CD34+細胞注射進入BALB/C裸鼠體內(nèi)后具有向缺血區(qū)遷移并可能參與了新生血管生成的能力。此外，通過對3組間的缺血肢體溫度改變和CD31免疫組化染色的比較可以發(fā)現(xiàn)，CD34+細胞數(shù)量越多，其肢體溫度恢復(fù)越快，血管密度也越豐富，在一定程度上支持了CD34細胞有促進缺血肢體血流復(fù)通的作用，結(jié)果也證實了該105數(shù)量級的CD34+細胞對促進缺血肢體血流恢復(fù)的有效性。但對于人體CD34+細胞與小鼠體內(nèi)自身干細胞之間的作用關(guān)系，及其對于缺血肢體血流復(fù)通的具體機制及影響因素并不清楚，當(dāng)然也可能通過其他作用方式促進新生血管的生成，相關(guān)問題仍有待進一步研究闡明。

左側(cè)為缺血肢體，不同顏色表示不同溫度，紅色表示最高溫度，深藍色表示最低溫度

Left is ischemic limb,different perfusion values are presented in different color，with maximum perfusion values presented in red and minimum in deep blue

圖 3 紅外線熱像儀檢測小鼠下肢肢體溫度

Fig 3 Infrared thermograph to detect the temperature of ischemic limb of mouse

與對照組比較，at=5.421，P=0.001；bt=0.616，P=0.000；ct=10.780，P=0.000；dt=12.123，P=0.000at=5.421，P=0.001；bt=0.616，P=0.000；ct=10.780，P=0.000；dt=12.123，P=0.000 compared with control group

圖 4 缺血肢體溫度與非缺血肢體溫度的比值變化(n=5)

Fig 4 The ratio change of ischemic limb temperature to normal limb(n=5)

TGF-β1的表達是重要復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，其通過Smad蛋白將信息從細胞表面?zhèn)魉偷郊毎藘?nèi)，并控制著各類細胞的分子表達過程[19]。Veit等[20]在不同細胞模型中已經(jīng)證實，細胞的遷移與TGF-β1信號通路的激活有關(guān)。Bai等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在TGF-β1信號通路激活的情況下，SDF- 1可介導(dǎo)CD34+細胞的趨化作用并誘導(dǎo)CD34+細胞在缺血區(qū)的黏附應(yīng)答。本研究結(jié)果顯示，CD34+細胞增殖組的TGF-β1表達增加，CD34+細胞明顯向缺血組織遷移，并顯著增加血流的復(fù)通；而對照組，非注射CD34+細胞的缺血組織中TGF-β1mRNA表達并不顯著，由此推測在局部缺血的肢體組織中，TGF-β1mRNA表達與CD34+細胞之間可能存在復(fù)雜的相互作用關(guān)系。

A.CD34+細胞增殖組；B.CD34+細胞組；C.對照組

A.expanded CD34+cells group； B.fresh CD34+cells group； C.control group

圖 5 CD31免疫組織化學(xué)染色檢測毛細血管密度(×200)

Fig 5 Capillary density revealed by CD31 staining(×200)

綜上，本研究結(jié)果顯示，無血清培養(yǎng)基體外擴增人臍血細胞能向缺血區(qū)富集并誘導(dǎo)血管生成，恢復(fù)血流再通，有望成為治療下肢缺血性疾病的潛在方式。

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Human Umbilical Cord Blood CD34+Cells Induced Angiogenesis in Ischemic Limb of Mice

CHEN Zuo-guan，DIAO Yong-peng，WU Zhi-yuan，YAN Sheng，LI Yong-jun

Department of Vascular Surgery，PUMC Hospital，CAMS and PUMC，Beijing 100730，China

LI Yong-jun Tel：010- 69152500，E-mail：yongj_93@hotmail.com

Objective To observe the effect of the expanded human umbilical cord blood CD34+cells in ischemic limb of mice and analyse the relationship between the CD34+cells and angiogenesis. Methods Human umbilical cord blood was collected and CD34+cells were separated for expanding. Mice limbs ischemia models were established (n=15) and randomly divided into three groups：expanded CD34+cells group (n=5)，fresh CD34+cells group (n=5)，and control group(n=5). CD34+cells were detected by DiI dye tracing and antihuman nuclear antigen antibody(HNA) immunohistochemical staining. The improvement of blood reperfusion was evaluated by indicators including limb temperature，CD31 staining，and transforming growth factor-β1 (TGF-β1) mRNA expression. Results On days 14 (t=5.421，P=0.001；t=0.616，P=0.000) and 28(t=10.780，P=0.000；t=12.123，P=0.000)，both expanded CD34+cells group and fresh CD34+cells group enjoyed better temperature improvement. Days 28 later，the vascular densities in the expanded CD34+cells group and the fresh CD34+cells group were 592.3±24.6 (t=26.386，P=0.000) and 530.7±25.5 (t=21.502，P=0.000)，which were significantly higher than that in control group 219.7±19.9. The TGF-β1 mRNA expression in the expanded CD34+cells group and the fresh CD34+cells group were (0.578±0.050) copies (t=12.376，P=0.000) and (0.504±0.080) copies (t=7.098，P=0.000)，both over control group [(0.224±0.040)copies]. ConclusionsInvitroculture of cord blood CD34+cells can emigrate to ischemic zone and induce angiogenesis to alleviate ischemia. Thus，it may provide a treatment option for lower limb ischemia.

angiogenesis； CD34+cells； umbilical cord blood stem cell； limb ischemia； animal experiment

國家自然科學(xué)基金(81270399)Supported by the National Natural Sciences Fundation of China(81270399)

李擁軍 電話：010- 69152500，電子郵件：yongj_93@hotmail.com

R654.4

A

1000- 503X(2016)05- 0491- 06

10.3881/j.issn.1000- 503X.2016.05.001

2016- 04- 18)