張　娜，謝艷輝，袁俊杰，李家僑，斯?jié)啥?/p>

（湛江出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東湛江　524000）

傳染性皮下及造血器官壞死病毒誘導(dǎo)南美白對(duì)蝦抗白斑綜合征病毒感染的初步研究

張娜，謝艷輝，袁俊杰，李家僑，斯?jié)啥?/p>

（湛江出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東湛江524000）

為進(jìn)一步研究對(duì)蝦抗病毒免疫方法，使用實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物病毒感染死亡率分析，研究傳染性皮下及造血器官壞死病毒（IHHNV）和白斑綜合征病毒（WSSV）在感染南美白對(duì)蝦后的相互作用機(jī)制。結(jié)果顯示，預(yù)感染IHHNV后的對(duì)蝦在進(jìn)行WSSV攻毒后，對(duì)蝦的存活率得到了提高。熒光PCR檢測病毒量的結(jié)果顯示，預(yù)感染IHHNV再用WSSV攻毒，存活蝦體內(nèi)的IHHNV含量比死亡蝦高。研究結(jié)果初步證明，IHHNV和WSSV在對(duì)蝦體內(nèi)存在相互作用機(jī)制，且IHHNV具有抑制WSSV復(fù)制的作用。

南美白對(duì)蝦；傳染性皮下及造血器官壞死病毒；白斑綜合征病毒；相互作用；機(jī)制

南美白對(duì)蝦是當(dāng)今世界養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大蝦類之一。近年來，隨著養(yǎng)殖品種日益增多和養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，各種對(duì)蝦疫病日益增多，嚴(yán)重威脅并制約了對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。對(duì)蝦白斑綜合征病毒（WSSV）和對(duì)蝦傳染性皮下及造血器官壞死病毒（IHHNV）是嚴(yán)重危害對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的兩種病毒。如何對(duì)其預(yù)防和治療，目前仍然是對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)迫切需要解決的課題之一。

許多學(xué)者針對(duì)WSSV抗病毒基因開展了不少研究，使得越來越多的對(duì)蝦免疫相關(guān)基因被發(fā)現(xiàn)［1-2］。如發(fā)現(xiàn)對(duì)蝦在感染W(wǎng)SSV之后，凝集素、鐵蛋白、酚氧化酶原、殼多糖酶、Ranbp、Rho、Rab、GTP結(jié)合蛋白等表達(dá)量都有不同程度的增高。但國內(nèi)外關(guān)于IHHNV和WSSV在感染對(duì)蝦過程中相互作用機(jī)制的研究報(bào)道很少。目前雖有關(guān)于IHHNV對(duì)WSSV感染有抵抗作用的研究［3］，但到目前為止，IHHNV對(duì)WSSV的干擾機(jī)制還不明確。

本研究使用一系列的實(shí)驗(yàn)生物死亡率動(dòng)力學(xué)測定方法，將對(duì)蝦預(yù)感染IHHNV后進(jìn)行WSSV攻毒，然后測定實(shí)驗(yàn)組的存活率和病毒含量，為對(duì)蝦抗病毒免疫方法的進(jìn)一步研究提供思路和研究基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。南美白對(duì)蝦喂養(yǎng)在100 cm長、50 cm高、30 cm寬的水槽中，用不含任何抗病藥物的飼料飼養(yǎng)。蝦在水槽中飼養(yǎng)7 d以上，備用。隨機(jī)挑取3條蝦，用PCR方法進(jìn)行病毒排除檢測。

1.1.2 病毒液處理。將確認(rèn)感染W(wǎng)SSV、IHHNV的南美白對(duì)蝦，去除附肢、甲殼和肝胰腺，取頭胸部組織進(jìn)行口服傳代感染，傳代3次；將人工接種WSSV 死亡的對(duì)蝦，去除附肢、甲殼和肝胰腺，取頭胸部稱重，與0. 01 mol/L的PBS（pH7. 4）1:5（g/L）稀釋；用玻璃勻漿器勻漿，3 000 r/min 離心20 min；將上清液依次用濾紙和0. 45 μm 濾膜過濾除菌；使用對(duì)蝦白斑病毒熒光定量PCR檢測試劑盒和對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒熒光定量PCR檢測試劑盒（上海之江生物公司）分別測定病毒原液中的病毒含量。WSSV病毒懸液約為6.1×1013copies/mL DNA，IHHNV病毒懸液約為4.3×1015copies/mL DNA，- 80 ℃ 凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 主要儀器設(shè)備。冷凍臺(tái)式離心機(jī)（Eppendorf centrifuge 5417R）；紫外可見分光光度計(jì)（Bio-Rad）；空氣浴搖床（THZ，江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；熒光PCR儀（ABI stepone）。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組。試驗(yàn)分為3組，每組設(shè)2個(gè)平行小組，每小組20尾蝦，隨機(jī)分組。淘汰體重過低或過高的蝦，平均體重約（10±0.5）g。各組分別為非感染非攻毒組（陰性對(duì)照組）、非預(yù)感染W(wǎng)SSV攻毒組（陽性對(duì)照組）、預(yù)感染IHHNV后WSSV攻毒組。

1.2.2 病毒滅活試驗(yàn)動(dòng)物分組。每個(gè)試驗(yàn)中，每組設(shè)有2個(gè)平行小組。IHHNV滅活試驗(yàn)：預(yù)感染滅活的IHHNV后WSSV攻毒組、非預(yù)感染滅活的IHHNV后WSSV攻毒組；WSSV滅活試驗(yàn)：預(yù)感染滅活的IHHNV后滅活WSSV攻毒組、非預(yù)感染IHHNV后滅活WSSV攻毒組；IHHNV和WSSV滅活試驗(yàn)：預(yù)感染滅活的IHHNV后滅活WSSV攻毒組。

1.2.3 試驗(yàn)組進(jìn)行IHHNV預(yù)感染。將保存的IHHNV病毒懸液稀釋100倍，濃度約為1011copies/mL DNA。感染前使蝦停食1 d。每小組分2次口服IHHNV懸浮液，每次口服100 μL。然后，飼喂顆粒飼料，每天2次，飼喂3周。3周后，取3條蝦進(jìn)行IHHNV感染檢測，進(jìn)行PCR分析。如果被檢測出IHHNV陽性，就立即分為2個(gè)平行小組，進(jìn)行后續(xù)攻毒試驗(yàn)。

1.2.4 WSSV口服攻毒。攻毒前，停食1 d。每天2次飼喂WSSV懸液（濃度約為109copies/mL DNA），每次口服100 μL。然后，飼喂顆粒飼料，每天2次。在此期間，收集瀕死的蝦，用RT-PCR方法分析IHHNV和WSSV感染情況。生物測定持續(xù)到攻毒后第10天。對(duì)存活的蝦，同樣檢測IHHNV和WSSV感染情況。對(duì)預(yù)感染IHHNV的蝦和未感染IHHNV蝦的進(jìn)行存活率統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 病毒滅活處理。分別取1.2.3和1.2.4中的病毒懸液1 mL，在0.5%的福爾馬林中25 ℃孵育10 min，然后用TN 緩沖液洗滌，去除福爾馬林。4℃ 20 000 r/min，離心30 min，重復(fù)洗滌2次。最后，使病毒顆粒懸浮在TN緩沖液中，保持病毒懸液的體積不變。

1.2.6 病毒滅活試驗(yàn)分組。IHHNV滅活試驗(yàn)：預(yù)感染滅活的IHHNV后WSSV攻毒組、非預(yù)感染滅活的IHHNV后WSSV攻毒組；WSSV滅活試驗(yàn)：預(yù)感染滅活的IHHNV后滅活WSSV攻毒組、非預(yù)感染IHHNV后滅活WSSV攻毒組；IHHNV和WSSV滅活試驗(yàn)：預(yù)感染滅活的IHHNV后滅活WSSV攻毒組。每組預(yù)感染和攻毒的時(shí)間和方法同1.2.3和1.2.4。

1.2.7 RT-PCR方法檢測病毒。使用對(duì)蝦白斑病毒熒光定量PCR檢測試劑盒和對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒熒光定量PCR檢測試劑盒測定WSSV、IHHNV的濃度。取瀕死的蝦、死蝦、存活的蝦、陰性的活蝦、陽性的死蝦作為樣品，用RT-PCR方法進(jìn)行IHHNV和WSSV病毒量對(duì)比。

2　結(jié)果

2.1 IHHNV預(yù)感染W(wǎng)SSV攻毒試驗(yàn)組死亡率分析

IHHNV預(yù)感染后分設(shè)了2個(gè)平行小組進(jìn)行后續(xù)攻毒試驗(yàn)。

第一組，在IHHNV預(yù)感染3周后，通過PCR可以在蝦體內(nèi)檢測到IHHNV感染。進(jìn)行WSSV攻毒后，每天可觀察到死亡情況。陰性對(duì)照組無死亡，說明對(duì)蝦無其他疫病感染。WSSV陽性對(duì)照組中，在WSSV攻毒3 d后開始死亡，7 d后所有蝦死亡，說明WSSV攻毒成功。在預(yù)感染IHHNV試驗(yàn)組中，在WSSV攻毒4 d后開始死亡。在攻毒后5～7 d內(nèi)死亡率較低，攻毒后第8天死亡數(shù)量開始大量增加，攻毒10 d后，死亡對(duì)蝦11條，存活率為35%（圖1）。

圖1　IHHNV預(yù)感染后WSSV攻毒對(duì)蝦的存活率（第一組）

第二組，陰性對(duì)照組無死亡率，陽性對(duì)照組在WSSV攻毒4 d后開始死亡，7 d后所有蝦死亡。在預(yù)感染IHHNV試驗(yàn)組中，在WSSV攻毒3 d后開始死亡，而在攻毒后4～6 d內(nèi)死亡率較低，攻毒后第7天死亡數(shù)量開始大量增加，攻毒10 d后，死亡對(duì)蝦12條，存活率為30%（圖2）。

2.2 病毒滅活試驗(yàn)組死亡率分析

圖2　IHHNV預(yù)感染后WSSV攻毒對(duì)蝦的存活率（第二組）

2.2.1 IHHNV滅活試驗(yàn)組。非預(yù)感染滅活I(lǐng)HHNV后攻毒組（陽性對(duì)照組）在WSSV攻毒2 d后開始出現(xiàn)死亡，7 d后所有蝦死亡，說明攻毒成功。預(yù)感染滅活I(lǐng)HHNV后攻毒組的2個(gè)平行組，在WSSV攻毒2 d后開始出現(xiàn)死亡，8 d后所有蝦死亡，說明滅活I(lǐng)HHNV預(yù)感染后不會(huì)出現(xiàn)蝦的感染，不會(huì)產(chǎn)生保護(hù)性。

2.2.2 WSSV滅活試驗(yàn)組。預(yù)感染滅活I(lǐng)HHNV后滅活WSSV攻毒組：無死亡。非預(yù)感染IHHNV后滅活WSSV攻毒組：無死亡。預(yù)感染滅活I(lǐng)HHNV后滅活WSSV攻毒組：無死亡。結(jié)果說明滅活WSSV不會(huì)出現(xiàn)感染蝦的情況。

2.3 感染蝦的病毒量比對(duì)結(jié)果

陰性對(duì)照組IHHNV和WSSV的RT-PCR檢測為陰性。同樣，福爾馬林滅活的WSSV浸泡感染組IHHNV和WSSV檢測均為陰性。預(yù)感染IHHNV的活蝦、瀕死蝦、死蝦中的IHHNV病毒量RT-PCR檢測結(jié)果見表1。

從結(jié)果看出，兩組平行對(duì)照組、非感染非攻毒組中（陰性對(duì)照組）兩種病毒都沒有檢出。非預(yù)感染W(wǎng)SSV攻毒組（陽性對(duì)照組）中沒有檢出IHHNV，WSSV病毒量為1.2×109，說明對(duì)照結(jié)果成立。

在預(yù)感染IHHNV的對(duì)蝦實(shí)驗(yàn)組中，存活的蝦體內(nèi)IHHNV含量明顯高于瀕死蝦和死亡蝦，平行對(duì)照結(jié)果達(dá)到7.9×108和8.8×108copies/mL DNA，相反存活的蝦體內(nèi)WSSV含量明顯低于瀕死蝦和死亡蝦，平行對(duì)照結(jié)果為5.2×102和2.2×102copies/mL DNA，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期一致。在滅活I(lǐng)HHNV預(yù)感染組中，2個(gè)平行組沒有檢出IHHNV，說明滅活的IHHNV沒有感染性，同樣沒有誘導(dǎo)抗感染性。

表1　對(duì)蝦體內(nèi)IHHNV和WSSV病毒量RT-PCR檢測結(jié)果對(duì)比

3　討論

在IHHNV和WSSV干擾機(jī)制方面，國外研究鮮有報(bào)道，國內(nèi)未見報(bào)道。Melena等［4］將凡納濱對(duì)蝦幼體、后期幼體預(yù)先感染IHHNV，養(yǎng)殖一段時(shí)間后在PL45 期感染W(wǎng)SSV。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在PL35 期預(yù)感染滅活WSSV和在無節(jié)幼體5期、幼蟲l 期、PL22 期預(yù)感染3 次IHHNV 的個(gè)體，在感染W(wǎng)SSV 10 d后并未完全死亡，而是分別保持了較低的存活率（4.7%和4%），沒有預(yù)感染IHHNV 和滅活WSSV 的對(duì)照組在感染W(wǎng)SSV 9 d后全部死亡。因此，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測，預(yù)先感染IHHNV 的對(duì)蝦在感染W(wǎng)SSV后抑制了WSSV的復(fù)制速度，從而降低了死亡率，這也表明IHHNV可以干擾WSSV在宿主中的復(fù)制作用。Tang 等［3］對(duì)細(xì)角濱對(duì)蝦預(yù)先感染IHHNV后再感染W(wǎng)SSV，檢測其病毒拷貝數(shù)，也得到類似結(jié)果。Molthathong等［5］分別用IHHNV感染性毒株和IHHNV非感染性毒株預(yù)感染斑節(jié)對(duì)蝦，用WSSV進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用IHHNV感染性毒株預(yù)感染的斑節(jié)對(duì)蝦比IHHNV非感染性毒株預(yù)感染的斑節(jié)對(duì)蝦存活率高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)IHHNV預(yù)感染后的斑節(jié)對(duì)蝦WSSV病毒量少于感染W(wǎng)SSV的對(duì)照組。

本研究針對(duì)預(yù)感染IHNNV的對(duì)蝦再進(jìn)行WSSV攻毒感染后的研究結(jié)果與國外學(xué)者的研究結(jié)果一致。同時(shí)本研究利用RT-PCR檢測滅活I(lǐng)HHNV和滅活WSSV感染后的對(duì)蝦，結(jié)果均為陰性，說明滅活的病毒在對(duì)蝦體內(nèi)不能進(jìn)行復(fù)制，同時(shí)預(yù)感染滅活I(lǐng)HHNV試驗(yàn)組，WSSV攻毒后對(duì)蝦全部死亡，說明滅活的IHHNV并不具備抑制WSSV感染的保護(hù)性。

用RT-PCR定量方法對(duì)實(shí)驗(yàn)組的死蝦、瀕死蝦和活蝦的體內(nèi)病毒量進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果證明，在預(yù)感染后存活的蝦體內(nèi)IHHNV病毒量最高，而死亡蝦的IHHNV病毒量最低，與動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果一致，表明在南美白對(duì)蝦體內(nèi)，IHHNV具有抗WSSV感染的作用。

［1］ Tassanakajon A，Klinbunga S，Paunglarp N，et al. Penaeus monodon gene discovery project：The generation of an EST collection and establishment of a database［J］. Gene，2006，384：104-112.

［2］ Gross P S，Bartlett T C，Browdy C L，et al. Immune gene discovery by expressed sequence tag analysis of hemocytes and hepatopancreas in the Pacific White Shrimp，Litopenaeus vannamei，and the Atlantic White Shrimp，L.setiferus［J］. Dev Comp Immunol，2001，25：565-577.

［3］ Tang K F J，Durand S V，White B L，et al. Induced resistance to white spot syndrome virus infection in Penaeus stylirostris through pre-infection with infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus a preliminary study［J］. Aquaculture，2003（216）：19-29.

［4］ Melena J，Bayot B，Betancourt L，et al. Pre-exposure to infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus or to inactivated white spot syndrome virus（WSSV）confers protection against WSSV in Penaeus vannamei（Boone）postlarvae［J］. Journal of Fish Diseases，2006（29）：589-600.

［5］ Molthathong S，Jitrakorn S，Joyjinda Y，et al. Persistence of penaeus stylirostris densovirus delays mortality caused by white spot syndrome virus infection in black tiger shrimp（Penaeus monodon）［J］. Veterinary Research，2013，9（1）：33.

（責(zé)任編輯：朱迪國）

A Preliminary Study on Induced Resistance to White Spot Syndrome Virus Infection in Penaeus vannamei through Pre-infection with Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus

Zhang Na，Xie Yanhui，Yuan Junjie，Li Jiaqiao，Si Ze'en
（Zhanjiang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhanjiang，Guangdong 524000）

In order to study the antiviral immune response of Penaeus vannamei，after being infected by infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus（IHHNV）and white spot syndrome virus（WSSV），the interaction mechanism was explored by analyzing the morbidity and mortality rates of experimental animals. It was found that when Penaeus vannamei were inoculated with IHHNV in advance，followed by the infection of WSSV，survival rate was increased. Further real-time PCR assay results showed that the viral load of IHHNV was higher in live prawns than in dead ones. Through this study，an interaction between IHHNV and WSSV in the prawns was preliminarily confi rmed during coinfection of the two viruses，and the replication of WSSV could be inhibited by IHHNV.

Penaeus vannamei；IHHNV；WSSV；interaction；mechanism

S945

B

1005-944X（2016）11-0094-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.11.025

廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015GDK 04）