陳明非

（大連市畜牧總站，遼寧大連　116037）

某池塘魚細(xì)菌感染的暴發(fā)調(diào)查

陳明非

（大連市畜牧總站，遼寧大連116037）

遼寧省大連市某人工池塘養(yǎng)殖的淡水魚苗出現(xiàn)大量死亡。從病死魚體內(nèi)分離到一株致病性嗜水氣單胞菌和一株類志賀鄰單胞菌。對(duì)魚飼料、池塘環(huán)境樣品進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)與優(yōu)勢(shì)菌篩查，發(fā)現(xiàn)池底淤積物和池塘排水管污物中細(xì)菌總數(shù)嚴(yán)重超出限值，優(yōu)勢(shì)菌為致病性嗜水氣單胞菌、類志賀鄰單胞菌和摩氏摩根菌，與病死魚體內(nèi)分離到的細(xì)菌基本一致。由此判斷引起池塘魚感染的細(xì)菌主要來源于池底淤積物和池塘排水管污物。

淡水魚苗；細(xì)菌感染；暴發(fā)調(diào)查；池塘；優(yōu)勢(shì)菌；嗜水氣單胞菌；類志賀鄰單胞菌

池塘養(yǎng)魚是遼寧省的主要淡水魚養(yǎng)殖方式［1］。部分養(yǎng)殖戶為降低成本，不注重清塘、換水工作，盲目增加養(yǎng)殖密度，導(dǎo)致細(xì)菌病頻發(fā)。目前，對(duì)魚細(xì)菌性疾病防治主要采取水質(zhì)消毒及投喂抗生素等措施，這無法從根本上解決問題。而且長(zhǎng)期、大量使用抗生素，不僅會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，也會(huì)引起公眾對(duì)食品安全的擔(dān)憂。

2015年9月遼寧省大連市一處池塘暴發(fā)了魚細(xì)菌性疾病。大連市畜牧總站隨即對(duì)該起疫情進(jìn)行了病原的分離鑒定和感染源的查找，通過溯源性暴發(fā)調(diào)查為池塘魚細(xì)菌性疾病的綜合防控提供依據(jù)。

該池塘占地約8畝，屬于人工挖制的封閉性池塘。池塘四壁用水泥砌成，池底鋪防滲膜。池塘水引自地下井水，池塘水深2 m左右，進(jìn)水口位于池塘高處，排水管有一低一高兩個(gè)。2015年9月初放養(yǎng)體重約150 g的魚苗8 000尾，以鯽魚為主。放養(yǎng)10 d后，魚苗陸續(xù)出現(xiàn)死亡，每天死亡70～100尾，至9月底，鯽魚苗死亡率達(dá)到40%。死亡魚體表充血，肛門紅腫，眼球突出。剖開腹腔發(fā)現(xiàn)有紅色積水；肝、脾呈暗紅色，易碎；腸內(nèi)無食物并有一定程度的糜爛。

1　材料

1.1 樣品

1.1.1 病死魚。體表、眼眶、鰓蓋等處有明顯充血癥狀的瀕死魚。

1.1.2 溯源樣品。采集地下井水、池塘水、池底淤積物、排水管污物、魚飼料。

1.2 試劑與儀器

營(yíng)養(yǎng)瓊脂、血液瓊脂基礎(chǔ)、1%脫脂奶蔗糖胰蛋白胨，購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；脫纖綿羊血，購(gòu)自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；VITEK2細(xì)菌生化鑒定卡，購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司。細(xì)菌鑒定設(shè)備為法國(guó)生物梅里埃公司VITEK2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)。

2　方法

2.1 病死魚檢驗(yàn)

2.1.1 細(xì)菌分離及純化。用酒精消毒病死魚體表，剪開腹部，無菌采集肝、脾、腹水。采用劃線法將病料接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h；挑取多個(gè)獨(dú)立菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)；兩次純化后，對(duì)獲得的菌株進(jìn)行標(biāo)記，并用斜面培養(yǎng)基保存。

2.1.2 細(xì)菌理化特征鑒定。將保存的純化菌株分別接種于綿羊血瓊脂平板和1%脫脂奶蔗糖胰蛋白胨平板，28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察溶血現(xiàn)象和溶蛋白現(xiàn)象；對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。根據(jù)鏡檢結(jié)果選擇VITEK2細(xì)菌生化鑒定卡，進(jìn)行細(xì)菌鑒定。

2.2 溯源樣品檢驗(yàn)

2.2.1 樣品稀釋與培養(yǎng)。用滅菌水將每種溯源樣品分別做101～108稀釋，參照飼料中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定方法［2］，將所有稀釋度樣品接種營(yíng)養(yǎng)瓊脂，28 ℃培養(yǎng)48 h。

2.2.2 細(xì)菌計(jì)數(shù)。選擇平均菌落數(shù)在30～300之間的培養(yǎng)皿進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)后，再乘以稀釋倍數(shù)，得出每毫升溯源樣品的細(xì)菌總數(shù)。

2.2.3 優(yōu)勢(shì)菌純化。觀察培養(yǎng)基上細(xì)菌的菌落形態(tài)，配合革蘭氏染色鏡檢，確定優(yōu)勢(shì)菌；對(duì)優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行分離純化。

2.2.4 優(yōu)勢(shì)菌生化鑒定。根據(jù)革蘭氏染色鏡檢結(jié)果，選擇VITEK2細(xì)菌生化鑒定卡對(duì)純化的優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行鑒定。

3　結(jié)果

3.1 細(xì)菌學(xué)試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 細(xì)菌培養(yǎng)特征。從病死魚中分離到2株細(xì)菌。這2株細(xì)菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上的生長(zhǎng)特征十分相似：28℃培養(yǎng)24 h形成圓形、白色半透明、表面光滑、邊緣整齊、直徑1.5 mm左右的菌落。但其中1株菌在綿羊血瓊脂平板上能形成明顯的β-溶血環(huán)，在1%脫脂奶蔗糖胰蛋白胨平板上形成透明的溶蛋白圈，將其命名為HQY-A；另1株菌則無溶血、無溶蛋白現(xiàn)象，將其命名為HQY-B。

3.1.2 分離菌理化特征。 革蘭氏染色鏡檢發(fā)現(xiàn)，HQY-A、HQY-B均為G-、無芽胞的短小桿菌。選擇VITEK2革蘭氏陰性菌生化鑒定卡，按說明書操作，經(jīng)VITEK2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定，HQY-A為嗜水氣單胞菌，HQY-B為類志賀鄰單胞菌。2株菌的生化試驗(yàn)詳情見表1和表2。鑒于HQY-A蛋白酶試驗(yàn)陽(yáng)性，判定其為致病性嗜水氣單胞菌［3］。

表1　HQY-A（嗜水氣單胞菌）生化試驗(yàn)結(jié)果

表2　HQY-B（類志賀鄰單胞菌）生化試驗(yàn)結(jié)果

3.2 溯源樣品細(xì)菌學(xué)試驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 溯源樣品細(xì)菌總數(shù)。地下井水、魚飼料中細(xì)菌總數(shù)很低，池塘水中細(xì)菌總數(shù)也在限值內(nèi)，而池底淤積物、出水管污物中的細(xì)菌總數(shù)大大超出限值［4-5］。樣品中的細(xì)菌總數(shù)見表3。

3.2.2 溯源樣品中的優(yōu)勢(shì)菌。池塘水、池底淤積物、出水管污物培養(yǎng)的優(yōu)勢(shì)菌經(jīng)純化鑒定為嗜水氣單胞菌、類志賀鄰單胞菌和摩氏摩根菌。其中的嗜水氣單胞菌在1%脫脂奶蔗糖胰蛋白胨平板上也能形成透明的溶蛋白圈，判定其為致病性嗜水氣單胞菌。

表3　溯源樣品的細(xì)菌計(jì)數(shù)（CFU/mL）

4　討論

本次試驗(yàn)從病死魚中分離到嗜水氣單胞菌和類志賀鄰單胞菌。這2株菌在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上的形態(tài)特征十分相似，因此在進(jìn)行此類病原菌檢驗(yàn)時(shí)要格外小心，以免漏檢。嗜水氣單胞菌在綿羊血瓊脂平板表現(xiàn)明顯的β-溶血，在脫脂奶蔗糖胰蛋白胨平板上形成透明的溶蛋白圈，充分說明這是一株致病性嗜水氣單胞菌。

嗜水氣單胞菌是一種人畜魚共患病原菌。尤其作為淡水魚類的重要致病菌，因養(yǎng)殖環(huán)境、魚的大小、種類等原因，可引起多種癥狀［6］。臨床上有大量嗜水氣單胞菌引起魚類敗血癥、腹水病等的報(bào)道［7-8］。嗜水氣單胞菌的致病性與相關(guān)毒力因子的關(guān)系密切。這些毒力因子有外毒素、蛋白酶、S層、菌毛、轉(zhuǎn)鐵蛋白和外膜蛋白等［8］。其中蛋白酶常用來鑒別致病性與非致病性嗜水氣單胞菌，凡蛋白酶陽(yáng)性的嗜水氣單胞菌均具有致病性［3］。嗜水氣單胞菌的外毒素是重要的致病因子，具有溶血性、腸毒素毒性和細(xì)胞毒性［9］。

類志賀鄰單胞菌是廣泛分布在淡水環(huán)境中的細(xì)菌，是引起人類胃腸炎的重要病原之一［6］。國(guó)內(nèi)關(guān)于類志賀鄰單胞菌是否引起水生動(dòng)物發(fā)病的報(bào)道不一。從草魚、鱘、溫泉魚等分離到的致病性類志賀鄰單胞菌，有單一致病的，也有和其他致病菌協(xié)同致病的［10-12］。朱越雄等［13］從中華絨鰲蟹中分離到非致病性類志賀鄰單胞菌，同時(shí)還分離到致病性嗜水氣單胞菌；左躍等［14］從暴發(fā)“裂頭病”的黃顙魚中分離到2株非致病性類志賀鄰單胞菌。目前沒有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)來確定類志賀鄰單胞菌的致病性。本次試驗(yàn)沒有進(jìn)行人工感染試驗(yàn)，因此不能確定分離到的類志賀鄰單胞菌是否對(duì)魚具有致病性。但類志賀鄰單胞菌是引起人類胃腸炎的重要病原之一，也能引起水禽、犬、貂等動(dòng)物發(fā)?。?］。因此，對(duì)病死魚及池塘污染水不能隨意丟棄和排放，要進(jìn)行無害化處理，切斷魚與人、畜的傳播途徑。

本次調(diào)查側(cè)重尋找感染源，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水源和魚飼料中的細(xì)菌量很少，不是致病菌來源。養(yǎng)殖戶因定期用漂白粉對(duì)池塘水消毒，所以池塘水的細(xì)菌總數(shù)在限值以下，致病菌濃度也在有效發(fā)病濃度以下。但池底淤泥以及排水管污物中因含有大量魚糞便、腐敗的飼料和魚體，消毒劑根本無法發(fā)揮作用，致病菌的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過發(fā)病濃度。從池塘環(huán)境樣品中分離到的3株優(yōu)勢(shì)菌中，有2株與發(fā)病魚體內(nèi)分離到的菌株相同，分別是致病性嗜水氣單胞菌和類志賀鄰單胞菌，由此判斷引起魚發(fā)病的致病菌主要來源于池底淤泥和排水管污物。另外池塘環(huán)境樣品中還有1株優(yōu)勢(shì)菌為摩氏摩根菌。這是一種腐生菌，廣泛分布于各種水源、土壤中，特別是動(dòng)物蛋白腐爛的地方［6］。摩氏摩根菌是一種條件性致病菌，國(guó)內(nèi)有從患病的水生動(dòng)物中分離到該菌的報(bào)道，如中華鱉、錦鋰等［15-16］。

根據(jù)本次池塘魚細(xì)菌感染的暴發(fā)調(diào)查結(jié)果，建議養(yǎng)殖戶及時(shí)撈出死魚，及時(shí)清除池底表層及排水管中污物，更換部分池塘水，對(duì)池塘全面消毒；建議投喂敏感抗菌藥，同時(shí)配合投喂解毒、增強(qiáng)抵抗力的藥物；在冬季空塘?xí)r，排干池塘水，挖出池底淤泥，使池底在自然條件下晾曬一段時(shí)間，再次養(yǎng)魚前要用藥物徹底消毒池塘的每一個(gè)角落。這樣才能保證徹底消滅病源。

［1］趙永鋒，胡海彥，蔣高中，等. 我國(guó)大宗淡水魚的發(fā)展現(xiàn)狀及趨勢(shì)研究［J］. 中國(guó)漁業(yè)經(jīng)濟(jì)，2012，30（5）：91-99.

［2］中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). 飼料中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定：GB/T13093—2006［S］. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2006.

［3］中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). 致病性嗜水氣單胞菌檢驗(yàn)方法：GB/ T18652—2002［S］. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2002.

［4］中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). 飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)：GB 13078—2001［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2001.

［5］中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). 漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)：GB 11607—89［S］. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2005.

［6］東秀珠，蔡妙英. 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)［M］. 北京：科學(xué)出版社，2001.

［7］田甜. 魚源嗜水氣單胞菌的分離鑒定及耐藥性研究［D］.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

［8］王友娟，李榮峰，李華，等. 遼寧地區(qū)養(yǎng)殖淡水魚感染嗜水氣單胞菌的流行病學(xué)調(diào)查［J］. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2012，14（4）：128-134.

［9］楊守明，王民生. 嗜水氣單胞菌及其對(duì)人的致病性［J］. 疾病控制雜志，2006，10（5）：511-514.

［10］胡錢東，林強(qiáng)，石存斌，等. 草魚致病性類志賀鄰單胞菌的分離與鑒定［J］. 微生物學(xué)報(bào)，2014，54（2）：229-235.

［11］余華，何智，嚴(yán)玉寶，等. 溫泉魚致病性類志賀鄰單胞菌和舒氏氣單胞菌的分離鑒定和藥敏試驗(yàn)［J］. 中國(guó)動(dòng)物檢疫，2009，26（7）：37-39.

［12］王小亮，徐立蒲，曹歡，等. 鱘致病性類志賀鄰單胞菌的鑒定和藥物敏感性［J］. 微生物學(xué)報(bào)，2013，53（7）：723-729.

［13］朱越雄，貢成良，薛仁宇，等. 中華絨鰲蟹組織中一株類志賀鄰單胞菌的分離與特性分析［J］. 中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2001，13（5）：263-264.

［14］左躍，易弋，夏杰，等. 2株黃顙魚源類志賀鄰單胞菌的分離與鑒定［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（9）：199-201.

［15］馬有智，舒妙安. 一種中華鱉穿孔病病原菌的分離和特性研究［J］. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2000，26（4）：414-416.

［16］陸小萏，鄒為民，譚愛萍，等. 錦鯉摩氏摩根菌的鑒定及致病性研究［J］. 淡水漁業(yè)，2005，35（2）：3-5.

（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

An Outbreak Investigation on Fish Bacterial Infections in a Pond

Chen Mingfei
（Dalian Animal Husbandry Station，Dalian，Liaoning 116037）

The mass mortality of freshwater fish fries in one artificial pond was found in Dalian city of Liaoning province. In order to find out its causes，the pathogens were isolated and identified. As a result，one strain of pathogenic Aeromonas hydrophila and one strain of Plesiomonas shigelloides were isolated from the fish died from the disease. Then the samples of fi sh feed and pond environment were examined by bacteria counting and predominant bacteria screening. It was found that the total bacteria in pond bottom mud and drain pipe sewage exceeded the limit seriously and the predominant bacteria were pathogenic Aeromonas hydrophila，Plesiomonas shigelloides and Morganella morganii，which were basically identical with the isolates from the mentioned dead fish. Thereby，the reason of bacterial infection of fi sh in this pond could be derived from bacteria existing in pond bottom mud and drain pipe sewage.

freshwater fish fry；bacterial infection；outbreak investigation；pond；predominant bacteria；Aeromonas hydrophila；Plesiomonas shigelloides

動(dòng)物檢疫

S942.2

B

1005-944X（2016）11-0015-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2016.11.005