王康康，沙濤，楊智，普春龍，孫趙龍

（云南大學(xué)省生物資源保護與利用重點實驗室，云南昆明650091）

兩株不同地區(qū)干巴菌菌絲體培養(yǎng)基的優(yōu)化*

王康康，沙濤**，楊智，普春龍，孫趙龍

（云南大學(xué)省生物資源保護與利用重點實驗室，云南昆明650091）

對分離自云南省玉溪市大營街鎮(zhèn)平壩村及昆明市小哨鄉(xiāng)的干巴菌菌絲體的最適營養(yǎng)條件及最適pH條件進行探究。通過單因子試驗和正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)基。結(jié)果表明，小哨菌種最適培養(yǎng)基為葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、酵母粉2 g，磷酸二氫鉀0.5 g、硫酸鎂0.5 g，初始pH5.5，H2O 1 L。玉溪菌種最適培養(yǎng)基為葡萄糖20 g、硫酸銨4 g、酵母粉2 g，磷酸二氫鉀0.5 g、硫酸鎂0.5 g，初始pH5.5，H2O 1 L。

干巴菌；菌絲；培養(yǎng)基；優(yōu)化

干巴菌（Thelephora ganbajun）又名干巴革菌，為革菌屬（Thelephora）的可食用真菌，同時也是一種外生菌根真菌，尚不能進行人工栽培［1］。外生菌根是菌根真菌菌絲體侵染宿主植物尚未木栓化的營養(yǎng)根形成的，其主要特征是菌絲在植物營養(yǎng)幼根表面形成菌套，同時侵入到根的皮層組織細胞間隙中形成哈蒂氏網(wǎng)，但不侵入細胞內(nèi)部，是自然界中普遍存在的一種共生現(xiàn)象［2］。干巴菌主要產(chǎn)于云南省，生長于亞熱帶云南松林或針闊混交林下，營養(yǎng)豐富且具有濃郁的牛肉干香味，具有很高的營養(yǎng)保健和經(jīng)濟價值［3］。由于干巴菌是云南特有的食用菌，與其它外生菌根真菌相比，目前國內(nèi)對干巴菌的研究還比較少，僅有一些關(guān)于干巴菌生長的營養(yǎng)條件及成分分析的研究，也還不夠系統(tǒng)、完善［4-10］。此外，沙濤等（2008）研究了云南省9個地區(qū)23個采樣地156個樣本的ITS序列差異，分析確定了34個ITS單倍型，具有較高的多樣性。本文通過對2個不同地區(qū)的干巴菌菌絲體純培養(yǎng)條件的探究，擬為下一步人工菌根合成及干巴菌資源開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

干巴菌的2個菌種46號菌種和P2菌種分別從采自云南省昆明市小哨鄉(xiāng)和云南省玉溪市平壩村的野生干巴菌中分離獲得。菌種經(jīng)過ITS序列測序鑒定為干巴菌（Thelephora ganbajun）［11-12］。

1.2方法

1.2.1不同pH對干巴菌菌絲生長的影響

干巴菌發(fā)生的土壤在整體上為山原紅壤，少量為黃沙壤；母巖常為紫色沙巖或玄武巖。土壤中性偏酸［13］，故以pH6為中心設(shè)置梯度：pH值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，分別用1 mol·L-1NaOH及HCl調(diào)節(jié)pH，每個梯度設(shè)3個重復(fù)。在無菌操作臺上取5個搖瓶中、生長2個月的菌種過濾，并轉(zhuǎn)移到滅過菌的三角瓶中，加入200 mL無菌水后打碎，每次取4 mL接種于150 mL PDA培養(yǎng)基中，置于28℃恒溫暗培養(yǎng)。2個月后過濾，并用無菌水沖洗至洗出液無色，然后抽干菌絲體，在60℃烘箱烘干2 h，稱重并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.2單因子試驗篩選出2個菌種適合的氮源、碳源

碳源試驗的2種基本培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基1：硝酸鈣2 g、磷酸二氫鉀0.5 g、硫酸鎂0.5 g、瓊脂15 g、水1 000 mL；PDA培養(yǎng)基。選取的碳源為葡萄糖、蔗糖和麥芽粉。分別在2種基礎(chǔ)培養(yǎng)基上按15 g·L-1的濃度加入不同碳源。

每個處理設(shè)置3個重復(fù)，用塑料平板培養(yǎng)，在生長2個月的2種干巴菌菌落邊緣取長5 mm的正方形菌塊分別接入培養(yǎng)皿中央，置于28℃恒溫暗培養(yǎng)。接種2個月后，用十字交叉法測量菌落半徑，同時觀察菌絲長勢。

氮源實驗2種基本培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基2：葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀0.5 g、硫酸鎂0.5 g、瓊脂15 g、水1 000 mL；PDA培養(yǎng)基。

選取的氮源為硝酸鈉、蛋白胨、酵母粉、硫酸銨。分別在2種基礎(chǔ)培養(yǎng)基上按2 g·L-1的濃度加入不同氮源。

其它測定方法、內(nèi)容同上。

1.2.3馬鈴薯汁對干巴菌菌絲生長的影響

分別對2個菌種在不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長的試驗數(shù)據(jù)作獨立樣本t檢驗。利用t檢驗判斷兩總體均值是否存在顯著差異。

1.2.4正交試驗

選用L25（53）正交表，以最佳碳源A、最佳氮源B、C為直接因素進行正交試驗，以便篩選各因素之間的最佳組合。培養(yǎng)基pH調(diào)節(jié)為5.5，無機鹽磷酸二氫鉀0.5 g·L-1，硫酸鎂0.5 g·L-1。用SPSS軟件對數(shù)據(jù)作方差分析，其他測定方法同單因子試驗［14］（表1、表2）。

表1　干巴菌46號菌種L25（53）正交試驗因素與水平Tab.1Orthogonal test factors and levels of Thelephora ganbajun 46 strain

表2　干巴菌P2菌種L25（53）正交試驗因素與水平Tab.2Orthogonal test factors and levels of Thelephora ganbajun P2 strain

2　結(jié)果與分析

2.1不同pH對干巴菌菌絲生長的影響

不同pH對干巴菌菌絲生長的影響見圖1。由圖1可知，46號菌種和P2菌種的最適pH均為5.5。

圖1　不同pH值對干巴菌46號、P2菌種菌絲生長的影響Fig.1Effect of different pH on mycelia growth of Thelephora ganbajun 46 strain and P2 strain

2.2不同碳氮源對干巴菌菌絲生長的影響

不同碳氮源對干巴菌菌絲生長的影響，見圖2、圖3。

圖2　不同碳源和氮源對干巴菌46號菌種菌絲生長的影響Fig.2Effect of different carbon and nitrogen sources on mycelia growth of Thelephora ganbajun 46 strain

圖3　不同碳源和氮源對干巴菌P2號菌種菌絲生長的影響Fig.3Effect of different carbon and nitrogen sources on mycelia growth of Thelephora ganbajun P2 strain

由圖2、圖3可知，46號菌種和P2菌種的最適碳源都為葡萄糖；46號菌種最適氮源為蛋白胨，P2菌種最適氮源為硫酸銨。

2.3馬鈴薯汁對干巴菌菌絲生長的影響

對46號菌種在2種不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長的試驗數(shù)據(jù)作獨立樣本t檢驗，方差齊性檢驗認(rèn)為方差齊性，故取方差齊次結(jié)果P=0.775＞0.05，所以2組數(shù)據(jù)無明顯差異，即對46號菌種而言，培養(yǎng)基成分中有無馬鈴薯汁均可。

對P2號菌種在2種不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長的試驗數(shù)據(jù)作獨立樣本t檢驗，方差齊性檢驗認(rèn)為方差齊性，故取方差齊次結(jié)果P=0.795＞0.05，所以兩組數(shù)據(jù)無明顯差異，即對P2號菌種而言培養(yǎng)基成分中有無馬鈴薯汁均可。

2.4正交試驗結(jié)果

正交試驗結(jié)果見表3和表4。

由表3可知，46號菌種最適碳、氮源配比為A3B1C1，即葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、酵母粉2 g。極差分析表明3種營養(yǎng)物質(zhì)中蛋白胨對46號菌種生長影響最大。由表4可知P2菌種最適碳氮源配比為A3B2C1，即葡萄糖20 g、硫酸銨4 g、酵母粉2 g。但B1B2值差距不大，從開發(fā)應(yīng)用的角度考慮也可以取A3B1C1，即葡萄糖20 g、硫酸銨2 g、酵母粉2 g。極差分析表明3種營養(yǎng)物質(zhì)中硫酸銨對P2菌種生長影響最大。

表3　干巴菌46號菌種正交試驗結(jié)果Tab.3Orthogonal test results for Thelephora ganbajun 46 strain

3　討論

本研究初步完成了2個干巴菌菌種的培養(yǎng)基篩選，研究結(jié)果顯示2個菌種的適宜pH都是5.5，這也與干巴菌的生長土壤pH相吻合。最適碳源都為葡萄糖20 g，但最適氮源有所不同，46號為蛋白胨2 g和酵母粉2 g；P2為硫酸銨4 g和酵母粉2 g。2個菌種在葡萄糖濃度高于20 g·L-1且后氣生菌絲明顯較低濃度時發(fā)達，菌落越厚，但菌落面積也明顯縮小。P2菌種對無機氮源硫酸銨的吸收利用能力明顯優(yōu)于46號菌種，另外P2菌種的生長速度明顯較46號菌種緩慢。但P2與46號菌種在ITS序列上一致，還需進一步分析其遺傳分化程度。2個菌種在營養(yǎng)吸收上的差異，可能是由于環(huán)境差異導(dǎo)致的適應(yīng)性進化，2個菌種自然生長環(huán)境及其子實體在其它有效成分含量上是否也存在差異，有待作進一步理化分析。

由于外生菌根真菌需要與其宿主植物共生才能完成其生長發(fā)育，如果要得到干巴菌子實體，必然要先合成菌根或進行人工促繁，而篩選優(yōu)良外生菌根真菌菌種，研究不同基因型菌種之間，以及菌種與宿主植物之間的關(guān)系是建立菌根化技術(shù)的重要前提，目前已得到大量的2種不同基因型菌絲體，使半人工栽培干巴菌成為可能。

表4　干巴菌P2菌種正交試驗結(jié)果Tab.4Orthogonal test results for Thelephora ganbajun P2 strain

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Optimized Mycelium Culture Medium of Two Strains Thelephora ganbajun from Different Regions in Yunnan

WANG Kang-kang，SHA Tao，YANG Zhi，PU Chun-long，SUN Zhao-long
（Laboratory for Conservation and Utilization of Bio-resources Yunnan University，Kunming 650091，China）

The optimal culture medium and pH of two strains Thelephora ganbajun Zang from town Xiaoshao and Daying in Yunnan province were studied.The single factor and the orthogonal array method used for optimal culture medium.The results of these experiments showed that the components of the medium for Xiaoshao strains comprised with glucose at 20 g·L-1，peptone 2 g·L-1，yeast extract 2 g·L-1，KH2PO40.5 g·L-1，MgSO40.5 g·L-1and initial pH 5.5，for Yuxi strains the medium comprised with glucose at 20 g·L-1，yeast extract 2 g·L-1，（NH4）2SO42 g·L-1，KH2PO40.5 g·L-1，MgSO40.5 g·L-1and initial pH 5.5.

Thelephora ganbajun；strain；culture medium；optimal

S646.9

A

1003-8310（2016）03-0033-04

10.13629/j.cnki.53-1054.2016.03.007

國家自然科學(xué)基金項目（No.31260006）；云南省高?？萍紕?chuàng)新團隊。

王康康（1990-），女，在讀碩士研究生，研究方向為食用菌的栽培。E-mail：wkkwyf1990@foxmail.com

**通信作者：沙濤（1965-），男，本科，主要從事大型真菌的生理、遺傳方面的研究。E-mail：shatao@ynu.edu.cn

2016-03-06