鄭雪芳, 劉 波, 朱育菁, 陳德局

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所, 福建 福州 350003)

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研究論文

青枯雷爾氏菌特征菌株高效離子交換色譜快速分離條件的優(yōu)化

鄭雪芳, 劉 波*, 朱育菁, 陳德局

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所, 福建 福州 350003)

建立了高效離子交換色譜和紫外檢測(cè)系統(tǒng)快速分離青枯雷爾氏菌的細(xì)菌色譜方法。通過比較青枯雷爾氏菌懸浮在哌嗪-HCl緩沖體系和雙蒸水后的菌體數(shù)變化及細(xì)胞形態(tài)變化,分析該緩沖液對(duì)青枯雷爾氏菌生長活性及細(xì)胞表面特性的影響。結(jié)果表明,青枯雷爾氏菌懸浮在平衡緩沖液、洗脫緩沖液和雙蒸水中的菌體數(shù)量無明顯差異,分別為6.467×109、6.267×109和6.233×109cfu/mL。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),3種溶液處理后,青枯雷爾氏菌均保持完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。研究了緩沖液pH值、流速及菌體細(xì)胞濃度對(duì)青枯雷爾氏菌色譜分離效果的影響,確定青枯雷爾氏菌的最佳色譜分離條件為:緩沖液pH值為8.0,流速為2 mL/min,菌體濃度大于1.0×108cfu/mL且小于1.0×1010cfu/mL。該分離條件縮短了分離時(shí)間,提高了分離效率,為快速分離青枯雷爾氏菌提供了一種有效的手段,同時(shí)也為細(xì)菌等微生物的分離提供了新途徑。

高效離子交換色譜;分離;青枯雷爾氏菌;細(xì)胞表面特性

由青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的植物青枯病是一種毀滅性土傳病害,主要發(fā)生在熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]。青枯雷爾氏菌寄主范圍廣,可侵染54個(gè)科450多種植物[2]。危害較重、分布較廣的寄主有番茄、茄子、辣椒、馬鈴薯、花生、生姜等,近年又陸續(xù)報(bào)道在桑樹、桉樹、木麻黃等木本植物及大豆、南瓜、三葉草等草本植物上也發(fā)現(xiàn)了青枯病[3]。青枯病是危害最大、分布最廣、造成損失最重的植物病害之一,一般田塊發(fā)病率為25%～30%,嚴(yán)重時(shí)可達(dá)80%～100%[4]。隨著全球氣候變暖,在世界范圍內(nèi),青枯病發(fā)生危害呈現(xiàn)出越來越重的趨勢(shì)。

青枯雷爾氏菌是極易變異的細(xì)菌,自然狀態(tài)下的致病力分化嚴(yán)重[5],其原因是存在不同致病力菌株混雜的現(xiàn)象[6],經(jīng)繼代培養(yǎng)和回接植株經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)菌株致病力分化現(xiàn)象[7],以往研究者認(rèn)為這是青枯雷爾氏菌變異性高、致病性不穩(wěn)定的原因。傳統(tǒng)的平板劃線、稀釋培養(yǎng)、毛細(xì)管電泳等分離、純化方法很難獲得高純度的青枯雷爾氏菌[8]。根據(jù)青枯雷爾氏菌菌體小((0.5～0.8) μm×(1.3～2.2) μm)的特性及其單細(xì)胞表面化學(xué)組成和所帶電荷的不同,以強(qiáng)陰離子交換樹脂SuperQ-650C(粒徑50～100 μm)為介質(zhì),可以對(duì)不同致病力的青枯雷爾氏菌進(jìn)行色譜分離,很好地解決了培養(yǎng)基無法有效分離、純化的問題[9]。由于該色譜體系分離到的各組分不是化合物而是青枯雷爾氏菌活細(xì)胞,因此簡稱為細(xì)菌色譜[10,11]。以往的研究表明,用細(xì)菌色譜分離一株細(xì)菌約需要1 h。陳昭華等[12]利用離子交換色譜分離、表征對(duì)數(shù)期金黃色葡萄球菌的色譜行為,整個(gè)洗脫過程需要60 min;林娟等[13]以及林營志[14]應(yīng)用高效離子交換色譜分離一株青枯雷爾氏菌需55 min;余謙[10]和Zheng等[11]對(duì)不同致病力青枯雷爾氏菌的色譜分離仍需55 min,未解決分離效率問題。盡管以往的研究解決了細(xì)菌的色譜分離,但是效率很低,影響了該方法的有效應(yīng)用。本研究旨在優(yōu)化高效離子交換色譜分離條件,提高分離效率。

在一定的條件下,細(xì)菌在宏觀上是一個(gè)帶電的顆粒,細(xì)菌表面帶有羧基、磷酸基和氨基等較大的基團(tuán),在不同的pH條件下會(huì)發(fā)生電離,從而使細(xì)菌表面帶上不同的電荷[15],與離子交換樹脂的吸附能力也不同,因此可以通過高效離子交換色譜進(jìn)行分離、純化[13]。20世紀(jì)70年代,Daniels[16]利用強(qiáng)陰離子交換色譜、Marquis等[17]利用陽離子交換色譜柱實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同細(xì)菌的分離。但由于受到條件的局限,當(dāng)時(shí)對(duì)細(xì)菌的分離、純化使用的是常壓色譜柱,不但分離時(shí)間過長,而且極易染菌。近些年來,隨著色譜技術(shù)和各種新型分離材料的開發(fā),為應(yīng)用色譜技術(shù)分離細(xì)菌提供了可能,如謝俊斌[18]使用高效液相色譜對(duì)活的細(xì)菌進(jìn)行了分離,成功地對(duì)木糖氧化無色桿菌、普通大腸桿菌、短小芽孢桿菌等不同屬的細(xì)菌進(jìn)行了色譜分離。本課題組[11]在前期研究中,利用高效離子交換色譜快速分離了青枯雷爾氏菌的強(qiáng)致病力和無致病力菌株,并對(duì)一株強(qiáng)致病力菌株FJAT-1925和一株無致病力菌株FJAT-1957進(jìn)行了色譜純化。

青枯雷爾氏菌的高效離子交換色譜分離效果受多種因素的影響,主要有:(1)細(xì)菌自身表面活性。細(xì)菌表面所帶電荷決定其與樹脂之間的吸附能力,同時(shí)細(xì)菌的形態(tài)和大小也影響其分離效果[13]; (2)緩沖液的pH值。緩沖液的pH值決定了細(xì)菌細(xì)胞表面帶電物質(zhì)電離的程度,緩沖液的pH值離細(xì)菌的等電點(diǎn)越近,細(xì)菌細(xì)胞表面所帶的電荷就越少,與樹脂的吸附能力就越小,反之就越大[15]; (3)流速。流速既不能太大也不能太小,流速太小,分析時(shí)間長,影響分離效果;流速太大,影響色譜柱的使用壽命[19]; (4)細(xì)菌濃度。在色譜柱飽和的吸附范圍內(nèi),菌體細(xì)胞樣本不同濃度對(duì)特征峰的峰高、峰寬以及峰面積有一定的影響[10]。

本研究以青枯雷爾氏菌強(qiáng)致病力菌株FJAT-91為試驗(yàn)材料,研究了緩沖液對(duì)青枯雷爾氏菌細(xì)胞表面特性的影響,分析了緩沖液pH值、流速和菌體濃度對(duì)青枯雷爾氏菌色譜分離效果的影響,建立了青枯雷爾氏菌色譜分離的最優(yōu)化條件。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及材料

高效液相色譜儀(Agilent HPLC 1100,美國Agilent公司)、紫外-可見分光光度計(jì)(UV-2550,日本島津公司)、高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf 5418R,德國Eppendorf公司)、超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1F,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)、恒溫培養(yǎng)箱(BI-250AG,施都凱儀器設(shè)備有限公司)、透射電鏡(HT7700,日本日立公司)。

青枯雷爾氏菌強(qiáng)致病力菌株FJAT-91分離自番茄青枯病病株,由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所菌種庫收集并保存。青枯雷爾氏菌鑒別培養(yǎng)基為2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)培養(yǎng)基,成分為:1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)蛋白胨、0.1%水解酪蛋白、0.5%葡萄糖、1.8%瓊脂和0.05% 2,3,5-氯化三苯基四氮唑;液體培養(yǎng)基為SP (sucrose peptone)培養(yǎng)基,成分為2%蔗糖、0.5%蛋白胨、0.05% KH2PO4和0.002 5% MgSO4。青枯雷爾氏菌高效離子交換色譜分離所需平衡緩沖液(A液): 0.02 mol/L哌嗪-HCl;洗脫緩沖液(B液): 0.02 mol/L哌嗪-HCl+1 mol/L NaCl。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)及樣品制備

青枯雷爾氏菌FJAT-91經(jīng)TTC培養(yǎng)基活化后,轉(zhuǎn)接于SP液體培養(yǎng)基中,于30 ℃以170 r/min的速度在搖床上培養(yǎng)24 h,吸取1 mL菌液,以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心2 min,沉淀物分別懸浮于A液、B液和雙蒸水中,重復(fù)試驗(yàn)3次,4 h后將不同溶液懸浮的青枯雷爾氏菌經(jīng)系列梯度稀釋,涂布于TTC平板上,置于30 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)48 h,觀察菌落形態(tài),統(tǒng)計(jì)菌落個(gè)數(shù),利用DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)方差分析。

另外,分別取2 μL不同溶液懸浮的青枯雷爾氏菌樣本至銅網(wǎng),靜置2 min,濾紙吸干,滴適量2%磷鎢酸染色30 s,自然晾干,于透射電鏡下觀察菌體形態(tài)并拍照。

圖 1 青枯雷爾氏菌FJAT-91在平衡緩沖液、洗脫緩沖液及雙蒸水中懸浮4 h后的菌體形態(tài)Fig. 1 Cell morphologies of Ralstonia solanacearum strain FJAT-91 suspended in (a) balance buffer, (b) elution buffer and (c) double distilled water for 4 h Balance buffer： 0.02 mol/L piperazine-hydrochloric acid, elution buffer： 0.02 mol/L piperazine-hydrochloric acid+1 mol/L NaCl.

1.2.2 色譜條件

按1.2.1節(jié)方法所述,將培養(yǎng)好的菌液以8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,沉淀物用雙蒸水洗滌2次后加200 μL雙蒸水溶解,于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

在本試驗(yàn)中,需要從色譜系統(tǒng)中收集分離表征后的菌體做進(jìn)一步培養(yǎng),要保證整個(gè)色譜系統(tǒng)無菌,因此在進(jìn)樣之前,整個(gè)色譜系統(tǒng)先用75%(體積分?jǐn)?shù))的酒精沖洗15 min,然后用無菌水沖洗15 min,最后用無菌的緩沖液平衡整個(gè)色譜系統(tǒng)。所有器皿都需經(jīng)過高溫高壓滅菌處理,緩沖液用雙蒸水配制,使用前用0.22 μm的醋酸纖維素膜過濾。上樣樣品的前處理也嚴(yán)格按照無菌操作進(jìn)行,以保證整個(gè)分離表征過程處于嚴(yán)格的無雜菌環(huán)境。

色譜填充材料采用的是強(qiáng)陰離子交換樹脂,色譜柱規(guī)格為200 mm×4.6 mm,流速為2 mL/min,柱溫為23～28 ℃。色譜分離方法:樣品上樣后,在0～3 min時(shí),用A液進(jìn)行平衡,使進(jìn)樣的青枯雷爾氏菌充分吸附到強(qiáng)陰離子交換樹脂上;在3～8 min時(shí),進(jìn)行線性梯度洗脫,洗脫梯度為0～75%的B液;在8～12 min時(shí),完全轉(zhuǎn)換為洗脫緩沖液,以達(dá)到洗出吸附在樹脂上的殘余青枯雷爾氏菌的目的;在12～15 min時(shí),轉(zhuǎn)換為平衡緩沖液以平衡系統(tǒng),從而為下一次的試驗(yàn)做準(zhǔn)備。采用紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)波長為260 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 緩沖液對(duì)青枯雷爾氏菌活性的影響

利用高效離子交換色譜對(duì)青枯雷爾氏菌進(jìn)行分離時(shí),如何保持細(xì)菌細(xì)胞表面的原有特性不受平衡緩沖液和洗脫緩沖液的影響是研究的關(guān)鍵。Armstrong等[20]報(bào)道,在毛細(xì)管電泳分析細(xì)菌的研究中采用雙蒸水洗滌和懸浮細(xì)菌,不會(huì)對(duì)細(xì)菌的色譜行為造成影響。林娟等[13]的研究表明,高效離子交換色譜分析中采用平衡緩沖液哌嗪-HCL作為緩沖體系對(duì)青枯菌的生理活性無明顯的副作用。本研究比較了A液、B液以及雙蒸水對(duì)青枯雷爾氏菌FJAT-91活性的影響,結(jié)果表明,青枯雷爾氏菌FJAT-91在A液、B液和雙蒸水中懸浮4 h后,菌體個(gè)數(shù)分別為6.467×109、6.267×109和6.233×109cfu/mL,差異不顯著。此外透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),A液和B液不會(huì)破壞菌株FJAT-91的菌體細(xì)胞,細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、無破裂(見圖1)。上述結(jié)果表明,本研究選用的色譜平衡緩沖液(0.02 mol/L哌嗪-HCL)和洗脫緩沖液(0.02 mol/L哌嗪-HCl+1 mol/L NaCl)體系對(duì)青枯雷爾氏菌的細(xì)胞活性沒有明顯的影響。

2.2 緩沖液pH值對(duì)色譜分離效果的影響

將高效離子交換色譜平衡緩沖液和洗脫緩沖液的pH值均設(shè)為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0,考察緩沖液pH值對(duì)色譜分離的影響,試驗(yàn)重復(fù)3次。青枯雷爾氏菌FJAT-91在不同pH值緩沖液中的色譜分離效果不同。如表1和圖2所示,青枯雷爾氏菌FJAT-91經(jīng)高效離子交換色譜分離主峰的出峰時(shí)間為6 min左右。在pH值為5.0、6.0、7.0和8.0的緩沖液中,青枯雷爾氏菌FJAT-91均只出現(xiàn)單一色譜峰;在pH值為9.0的緩沖液中,青枯雷爾氏菌FJAT-91分別在6.02和8.05 min出現(xiàn)兩個(gè)色譜峰;在pH值為10.0的緩沖液中,青枯雷爾氏菌FJAT-91分別在0.59、6.04和7.89 min出現(xiàn)3個(gè)色譜峰。在pH值為8.0的緩沖液中,青枯雷爾氏菌FJAT-91的色譜峰高及峰面積均最大,峰形較好,且此pH值與青枯雷爾氏菌的最適生長pH值7.5較接近。張洋等[21]的研究結(jié)果表明,緩沖液的pH值離細(xì)菌的等電點(diǎn)越近,細(xì)菌細(xì)胞表面所帶的電荷就越少,與樹脂的吸附能力就越小,反之就越大。故本研究選擇青枯雷爾氏菌的高效離子交換色譜分離緩沖液pH值為8.0。

表 1 不同緩沖液pH條件下青枯雷爾氏菌FJAT-91的色譜峰行為

圖 2 不同緩沖液pH條件下青枯雷爾氏菌FJAT-91的高效離子交換色譜圖Fig. 2 High performance ion-exchange chromatograms of Ralstonia solanacearum strain FJAT-91 with different pH buffers

2.3 流速對(duì)色譜分離效果的影響

張國城[22]報(bào)道濃度型檢測(cè)器(如熱導(dǎo)池檢測(cè)器、電子捕獲檢測(cè)器、液相色譜法中的紫外-可見光檢測(cè)器等)在進(jìn)樣量一定時(shí),積分響應(yīng)值(峰面積)與流速成反比,而瞬間響應(yīng)值(峰高)也受流速影響,但非成比例變化。本研究考察了流速為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL/min時(shí)對(duì)色譜分離的影響。在不同流速下,青枯雷爾氏菌FJAT-91的出峰時(shí)間、峰面積、峰高等均不同。結(jié)果如表2和圖3所示,流速越快,主峰的出峰時(shí)間越早;而峰面積和峰高隨流速增大而減小,如與流速為0.5 mL/min相比,流速在5 mL/min時(shí),主峰出峰時(shí)間為4.96 min,提早了6.14 min,峰面積減少了85.81%,峰高減少了83.49%。流速為1、2和3 mL/min時(shí),青枯雷爾氏菌FJAT-91均分離出單一峰,其中流速為2 mL/min時(shí)的出峰時(shí)間比流速為1 mL/min時(shí)提早了1.68 min,而比流速為3 mL/min時(shí)推遲0.57 min。由于流速過快會(huì)影響色譜柱的使用壽命,流速低會(huì)影響試驗(yàn)效率,綜合上述研究結(jié)果,將青枯雷爾氏菌FJAT-91色譜分離的流速確定為2 mL/min。

2.4 菌體濃度對(duì)色譜分離效果的影響

為考察菌體濃度對(duì)色譜分離的影響,設(shè)置青枯雷爾氏菌FJAT-91的菌體濃度為1.0×107、1.0×108、1.0×109和1.0×1010cfu/mL。不同菌體濃度下,青枯雷爾氏菌菌株FJAT-91的分離效果不同,峰高和峰面積不同,如表3和圖4所示。菌體濃度越高,色譜峰的峰高越高,峰面積也越大;菌體濃度低,色譜分離效果不好,會(huì)出現(xiàn)特征峰外的其他色譜峰,如菌體濃度為1.0×107cfu/mL時(shí),分離出兩個(gè)色譜峰,且峰面積和峰高均最小;而菌體濃度太大(超過1.0×1010cfu/mL)會(huì)堵塞色譜柱,因此菌體濃度應(yīng)大于1.0×108且小于1.0×1010cfu/mL。峰面積(y)與菌體濃度(x, cfu/mL)為冪指數(shù)關(guān)系,方程為y=23.025x0.292(R2=0.965),其相關(guān)范圍為1.0×108～1.0×1010cfu/mL。

表 2 不同流速下青枯雷爾氏菌FJAT-91的色譜峰行為

圖 3 不同流速下青枯雷爾氏菌FJAT-91的高效離子交換色譜圖Fig. 3 High performance ion-exchange chromatograms of Ralstonia solanacearum strain FJAT-91 with different flow velocities

表 3 不同菌體濃度條件下青枯雷爾氏菌FJAT-91的色譜行為

圖 4 不同菌體濃度的青枯雷爾氏菌FJAT-91的高效離子交換色譜圖Fig. 4 High performance ion-exchange chromatograms of Ralstonia solanacearum strain FJAT-91 with different bacterial concentrations

3 結(jié)論

本研究優(yōu)化了青枯雷爾氏菌的高效離子交換色譜分離條件,確定最佳分離條件為:緩沖液pH值為8.0,流速為2 mL/min,菌體濃度要大于108cfu/mL且小于1011cfu/mL。該分離條件縮短了反應(yīng)時(shí)間,提高了反應(yīng)效率,為快速分離青枯雷爾氏菌提供一種有效的手段,同時(shí)也為細(xì)菌等微生物的分離提供了一個(gè)新途徑。

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Optimization of rapid separation conditions ofRalstoniasolanacearumusing high performance ion-exchange chromatography

ZHENG Xuefang, LIU Bo*, ZHU Yujing, CHEN Deju

(Agricultural Bio-Resources Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, China)

Rapid separation ofRalstoniasolanacearumwith intact cell using high performance ion-exchange chromatography equipped with a UV detector was described. The bacterial growth abilities and cell morphologies in different suspension buffers were compared. The results showed that the bacterial numbers in the balance buffer (0.02 mol/L piperazine-hydrochloric acid), elution buffer (0.02 mol/L piperazine-hydrochloric acid+1 mol/L NaCl) and double distilled water were 6.467×109, 6.267×109and 6.233×109cfu/mL, respectively, exhibiting no significant difference. Moreover, the cell morphologies were observed under a transmission electron microscope which showed that the bacterial cells could remain intact. Effects of buffer pH, flow velocity and bacterial cell concentration on the separation efficiency were analyzed. The results showed that the optimum chromatographic separation parameters were as follows: the buffer pH was 8, the flow velocity was 2 mL/min and the bacterial cell concentration was from 1.0×108cfu/mL to 1.0×1010cfu/mL. Under the chromatographic separation conditions, the separation time was shortened and the separation efficiency was improved. Therefore, the chromatographic method developed here may be a promising tool for the rapid separation ofRalstoniasolanacearumand other bacteria.

high performance ion-exchange chromatography; separation;Ralstoniasolanacearum; cell surface properties

10.3724/SP.J.1123.2016.06044

2016-06-27

國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)基金(201303015);福建省自然科學(xué)基金(2015J01103);福建省公益類科研院所專項(xiàng)基金(2014R1018-8).

O658

A

1000-8713(2016)11-1091-06

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