李　華, 孫書洪, 亓樹艷, 孔令洪, 陳　波, 龍建綱, 孔　宇

(1. 西安交通大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 陜西 西安　710049；2. 西安交通大學(xué) 南洋書院, 陜西 西安　710049)

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毛細(xì)管電泳技術(shù)在氨基酸分離教學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用

李華1, 孫書洪1, 亓樹艷1, 孔令洪1, 陳波2, 龍建綱1, 孔宇1

(1. 西安交通大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 陜西 西安710049；2. 西安交通大學(xué) 南洋書院, 陜西 西安710049)

在本科生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課程中,原氨基酸分離實(shí)驗(yàn)采用傳統(tǒng)的紙層析法分離,該方法存在耗時(shí)長(zhǎng)、試劑毒性大、準(zhǔn)確性差、斑點(diǎn)不清晰等缺點(diǎn)。針對(duì)傳統(tǒng)紙層析法的不足,應(yīng)用毛細(xì)管電泳對(duì)氨基酸進(jìn)行分離,并對(duì)影響分離效果的條件進(jìn)行了優(yōu)化。改進(jìn)后的實(shí)驗(yàn)課程,在更安全有效分離氨基酸的基礎(chǔ)上,極大地提高了學(xué)生實(shí)驗(yàn)的主動(dòng)性和積極性。

毛細(xì)管電泳； 氨基酸； 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)

在生物類專業(yè)本科的基礎(chǔ)課程“生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)”教學(xué)環(huán)節(jié)中引入交叉學(xué)科的新技術(shù)、新手段有利于學(xué)生及時(shí)了解、掌握學(xué)科的前沿,提高學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣和實(shí)驗(yàn)技能,并為后續(xù)的專業(yè)理論和實(shí)踐課程的開設(shè)打下良好的基礎(chǔ)[1-2]。

我校生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院開設(shè)的“生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)”是針對(duì)本校生物工程專業(yè)、生命科學(xué)基礎(chǔ)人才培養(yǎng)基地等專業(yè)學(xué)生開設(shè)的主干實(shí)驗(yàn)課程,為專業(yè)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課。實(shí)驗(yàn)中根據(jù)生物理論課程的安排,對(duì)應(yīng)地將實(shí)驗(yàn)課程安排為糖類、脂肪、核酸、氨基酸、蛋白質(zhì)、酶、酮體和維生素8個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)K,共10個(gè)實(shí)驗(yàn)。

在氨基酸實(shí)驗(yàn)中,為配合學(xué)生在理論課程中學(xué)習(xí)的氨基酸性質(zhì)相關(guān)知識(shí)點(diǎn),開設(shè)了混合氨基酸的分離檢測(cè)這一實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。在原先的教學(xué)計(jì)劃中采用傳統(tǒng)的紙層析分離,該分離方法存在耗時(shí)長(zhǎng)、試劑毒性大(正丁醇、氨水等)、層析斑點(diǎn)有時(shí)存在不清晰或拖尾等缺點(diǎn)[3-5]。同時(shí),學(xué)生在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中也反映,大量使用有機(jī)揮發(fā)類試劑讓有些學(xué)生出現(xiàn)頭暈、胸悶等不適癥狀,而且有的學(xué)生在高中實(shí)驗(yàn)中做過(guò)紙層析色譜的類似實(shí)驗(yàn)，因此設(shè)計(jì)了一種簡(jiǎn)單、快速、試劑毒性低、準(zhǔn)確性高的檢測(cè)方法[6-7]。

1　實(shí)驗(yàn)部分

毛細(xì)管電泳(CE)是近些年發(fā)展迅速的一項(xiàng)微分離技術(shù),具有高效、快速、靈敏、待測(cè)樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)，因此,CE被廣泛地用于多個(gè)領(lǐng)域,例如,臨床醫(yī)學(xué)、手性物質(zhì)分離、生物制藥、蛋白質(zhì)分析等領(lǐng)域。實(shí)驗(yàn)利用毛細(xì)管電泳儀-紫外檢測(cè)聯(lián)用手段,以常見的4種氨基酸[組氨酸(His),精氨酸(Arg),半胱氨酸(Cys),色氨酸(Trp)]為分離物,建立快速、準(zhǔn)確分離分析氨基酸的儀器分析方法,使學(xué)生在快速分離氨基酸的過(guò)程中,學(xué)習(xí)和掌握毛細(xì)管電泳儀的工作原理和操作方法,拓展學(xué)生的思路[8-9]。

1.1儀器裝置與試劑

毛細(xì)管電泳儀系統(tǒng):Beckman-MDQ毛細(xì)管電泳系統(tǒng)(Beckman,Fullerton,CA,USA,帶紫外檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器和溫度控制器,儀器控制和數(shù)據(jù)分析軟件為Beckman 32 Karat 8.0)、熔硅毛細(xì)管(河北永年光纖廠)、pH計(jì)(MettlerTolrdo,PE30,USA)、離心機(jī)(Eppendorf AG,Eppendorf 5417R,Hamburg,Germany)、超純水儀(Millipore,Mili-Q,New Bedford,MA,USA)。

試劑：組氨酸、精氨酸、半胱氨酸、色氨酸(阿拉丁,中國(guó))；磷酸一氫鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、鹽酸(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)總公司化學(xué)試劑有限公司)。

1.2溶液的配制

(1) 1.0 mmol/L組氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置:精確稱取1.5 mg于15 mL離心管中,用移液器向離心管中加入10.0 mL 蒸餾水,渦旋混勻儀充分混勻,放入4 ℃保存,備用。

(2) 4.0 mmol/L精氨酸、4.0 mmol/L半胱氨酸、1.0 mmol/L色氨酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制方法同上。

(3) 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:將分別配制的1.0 mmol/L組氨酸、4.0 mmol/L精氨酸、4.0 mmol/L半胱氨酸各吸取500 μL和1.0 mmol/L,色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液吸取250μL,加入2.0 mL試管中,渦旋混勻儀充分混勻,放入4.0 ℃保存,備用。

(4) 1.0 mol/L氫氧化鈉溶液的配制:精確稱取4.0 g 氫氧化鈉,溶解于50 mL燒杯中,轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶,定容。

(5) 磷酸緩沖溶液配制:根據(jù)配制磷酸緩沖液的濃度分別計(jì)算二水合磷酸二氫鈉和十二水合磷酸氫二鈉的用量,并分別用50 mL燒杯溶解,再用100 mL容量瓶定容。再利用公式(1),計(jì)算2種溶液混合比例,使配置的磷酸緩沖溶液pH分別為5.0、6.0、7.0和8.0。

(1)

式中:pH,緩沖溶液pH；pKa,磷酸解離常數(shù)的負(fù)對(duì)數(shù)；Cb,磷酸二氫鈉在溶液中的濃度(mmol/L)；Ca,磷酸氫二鈉在溶液中的濃度(mol/L)。

1.3毛細(xì)管處理

(1) 截取一段已知長(zhǎng)度的毛細(xì)管(48 cm×75 μm I.D,有效長(zhǎng)度37 cm),在相應(yīng)位置燒制長(zhǎng)度1 mm左右的檢測(cè)窗口,小心裝入毛細(xì)管卡套中,固定好檢測(cè)窗口。首次使用的毛細(xì)管,用1.0 mol/L的氫氧化鈉沖洗10 min并放置過(guò)夜。隔天,用雙蒸水和電泳緩沖溶液各沖洗10 min(沖洗壓力20 p.s.i)。

(2) 在每2次運(yùn)行之間分別用水、1.0 mmol/L氫氧化鈉、水、緩沖液各沖洗5 min,以保證峰型和保留時(shí)間具有良好的重現(xiàn)性。為了保證學(xué)生在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過(guò)程中有良好的操作性和簡(jiǎn)便性,并且更加深入地了解毛細(xì)管電泳的工作原理,實(shí)驗(yàn)中,選了經(jīng)典的毛細(xì)管電泳分離模式——毛細(xì)管區(qū)帶電泳對(duì)4種不同的氨基酸進(jìn)行分離。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

傳統(tǒng)利用紙層析分離氨基酸的方法中,實(shí)驗(yàn)結(jié)果不太理想,主要包括氨基酸層析斑點(diǎn)不清晰(甚至沒有層析斑點(diǎn)出現(xiàn))、色斑拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重、實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)。針對(duì)這些情況,采用毛細(xì)管電泳方法對(duì)4種氨基酸的分離進(jìn)行了探索[10]。

2.1緩沖溶液pH對(duì)分離效果的影響

電泳緩沖溶液pH值是影響分離的一個(gè)重要因素,它通過(guò)影響電滲流、分析物質(zhì)的帶電情況,最終影響分離度和分離效果。實(shí)驗(yàn)中選用最常用的磷酸鹽緩沖溶液對(duì)pH值進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化,考慮到磷酸鹽緩沖液的最大緩沖能力在7.2附近,因此分別研究了pH為5.0、6.0、7.0和8.0時(shí),4種氨基酸之間的分離度(resolution,Rs),并以Rs值為pH優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)，見表1。

表1　不同pH條件下的Rs值

注:當(dāng)pH值為5和6時(shí),半胱氨酸和色氨酸峰型完全重合,因此無(wú)法計(jì)算半胱氨酸和色氨酸、組氨酸和色氨酸的Rs值。

從表1中可以得出:pH值在為5.0、6.0時(shí),總有2種或3種不同的氨基酸無(wú)法得到分離。在pH值為7.0時(shí),可以看到4種氨基酸都能夠得到較好的分離(Rs值均大于1.5,見圖1),而在pH值為8.0時(shí),主要是組氨酸和色氨酸的分離度Rs小于1.5(Rs=1.28)。但從Rs值的角度可以看到,改變一些實(shí)驗(yàn)條件,例如繼續(xù)提高pH值或是增加毛細(xì)管長(zhǎng)度等,也能夠?qū)?種氨基酸進(jìn)行分離。這些實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的分析能夠很好地培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)思維能力,體會(huì)完成一個(gè)實(shí)驗(yàn)的方法并不是一成不變,進(jìn)而讓學(xué)生的思維更加活躍。

圖1　4種混合氨基酸在pH 7條件下的電泳分離圖

在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中,選擇pH值為7.0的磷酸鹽緩沖液作為電泳緩沖液進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化。

2.2緩沖溶液濃度對(duì)分離效果的影響

電泳緩沖液濃度與雙電層厚度、電滲流大小、焦耳熱產(chǎn)生量及緩沖液黏度等因素有著密切的關(guān)系。因此本次實(shí)驗(yàn)中對(duì)緩沖液濃度(20.0～ 60.0 mmol/L)進(jìn)行了優(yōu)化。當(dāng)緩沖溶液濃度較高時(shí),緩沖溶液電阻較小,雙電層厚度較薄,電滲流較小,從而使分離的氨基酸在毛細(xì)管中的停留時(shí)間較長(zhǎng),有利于分離。當(dāng)緩沖溶液濃度小于40.0 mmol/L時(shí),4種氨基酸分離度較差(Rs<1.5)。然而當(dāng)溶液濃度達(dá)到60.0 mmol/L時(shí),4種氨基酸之間的Rs值會(huì)增加,但當(dāng)分離電壓20.0 kV時(shí),整個(gè)體系中的電流達(dá)到120.4 μA,電流較高會(huì)損傷儀器,縮短儀器壽命?？紤]到以上的因素,最終選擇了40.0 mmol/L為緩沖液的濃度。

2.3分離電壓和溫度對(duì)分離效果的影響

實(shí)驗(yàn)中還探索了分離電壓和溫度對(duì)氨基酸分離效果的影響,發(fā)現(xiàn)在低電壓情況下(15.0 kV)氨基酸遷移速度比較慢,色譜峰展寬比較嚴(yán)重,影響分離效果。因此,在電泳緩沖液濃度選擇為40.0 mmol/L的條件下,盡量提升分離電壓,分離電壓為20.0 kV的時(shí)候,4種氨基酸能夠得到較好的分離效果,同時(shí),系統(tǒng)中的電流為68.5 μA,分離時(shí)間小于6 min。

實(shí)驗(yàn)中將毛細(xì)管的溫度設(shè)定為20 ℃或25 ℃,發(fā)現(xiàn)溫度的改變對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本上沒有影響。因此,只要在實(shí)驗(yàn)中保證毛細(xì)管溫度在20 ℃左右即可。

綜上所述,優(yōu)化分離4種氨基酸實(shí)驗(yàn)條件為:利用非涂層毛細(xì)管,有效長(zhǎng)度37 cm；電泳緩沖液選取40.0 mmol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)；以0.5 p.s.i壓力進(jìn)樣0.5 s,分離電壓+20.0 kV。實(shí)際4種氨基酸的結(jié)果分離圖,如圖1所示。

3　實(shí)踐與成效

3.1提高學(xué)生的實(shí)驗(yàn)積極性

利用毛細(xì)管電泳儀分離氨基酸,學(xué)生不僅能在課堂上親手操作大型儀器,同時(shí)還需要根據(jù)提供的氨基酸信息配制相應(yīng)的緩沖溶液。學(xué)生根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和學(xué)習(xí)到的相關(guān)知識(shí),分析產(chǎn)生結(jié)果的原因,提出合理的優(yōu)化條件,在提出優(yōu)化條件后,再次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。與原方法相比,毛細(xì)管電泳方法極大地增強(qiáng)了課堂上學(xué)生的參與度和積極性,提高了對(duì)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)的興趣。

3.2有利于高層次人才培養(yǎng)

學(xué)生在本科階段課程的學(xué)習(xí)中會(huì)接觸到許多大型儀器的知識(shí),如毛細(xì)管電泳儀、氣象色譜、液相色譜等,但由于條件所限,通常的理論教學(xué)內(nèi)容把重點(diǎn)放在了大型儀器的原理上,純數(shù)學(xué)的理論公式或大量的敘述僅讓學(xué)生從認(rèn)知體系上了解儀器的特點(diǎn),無(wú)法加深學(xué)生對(duì)課程所學(xué)知識(shí)的透徹理解,忽略了基本技能的培訓(xùn)。在新的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,學(xué)生首先需要將學(xué)習(xí)到的氨基酸基礎(chǔ)知識(shí)和毛細(xì)管的分離原理相結(jié)合,選擇出一個(gè)合適的緩沖溶液pH值,以達(dá)到4種不同氨基酸分離的效果,并且預(yù)測(cè)出4種氨基酸出峰順序,將預(yù)測(cè)結(jié)果和原因?qū)懺陔S堂實(shí)驗(yàn)報(bào)告表上。隨后結(jié)合分析化學(xué)的知識(shí),自己計(jì)算出2種磷酸鹽緩沖溶液的混合比例,配制相應(yīng)pH值的緩沖溶液。因此,通過(guò)利用毛細(xì)管電泳分離檢測(cè)氨基酸,不僅能夠使學(xué)生更加深入理解氨基酸兩性化合物的性質(zhì)和毛細(xì)管電泳儀內(nèi)部結(jié)構(gòu)、工作原理,而且能夠?qū)旧辖榻B儀器的基礎(chǔ)知識(shí)和實(shí)際應(yīng)用很好地結(jié)合在一起[11]。

通過(guò)在本科階段讓學(xué)生簡(jiǎn)單地操作一些大型分析類儀器,可以打破學(xué)生“進(jìn)口儀器不敢使用”的心理障礙[12]。同時(shí),大型儀器在本科教學(xué)中的使用,可以開闊學(xué)生的眼界,利于學(xué)生使用更多的大型儀器設(shè)備[13],例如氣、液相色譜,激光共聚焦掃描顯微鏡等。

4　結(jié)語(yǔ)

實(shí)驗(yàn)中,系統(tǒng)優(yōu)化了緩沖溶液的pH值、濃度、分離電壓等重要條件,使整個(gè)分離實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛟? min內(nèi)完成,實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較滿意。在本科實(shí)驗(yàn)中利用毛細(xì)管電泳的方法代替?zhèn)鹘y(tǒng)紙層析分離實(shí)驗(yàn)方法,不僅提高了分離效率、減少了有毒有害試劑的使用,同時(shí),調(diào)動(dòng)了學(xué)生的實(shí)驗(yàn)積極性和主動(dòng)性。與此同時(shí),讓學(xué)生體會(huì)到實(shí)驗(yàn)方法的選擇是多種多樣的,可以根據(jù)所學(xué)習(xí)的理論知識(shí)聯(lián)系實(shí)驗(yàn)實(shí)際情況,逐漸摸索將方法不斷優(yōu)化,最終得到滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

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Study on separation of amino acids with capillary electrophoresis and its application in teaching experiment

Li Hua1, Sun Shuhong1, Qi Shuyan1, Kong Linghong1, Chen Bo2, Long Jiangang1, Kong Yu1

(1. School of Life Science and Technology,Xi’an Jiaotong University,Xi’an 710049, China;2. Nanyang College,Xi’an Jiaotong University,Xi’an 710049, China)

In traditional biochemical experiments,amino acids were separated with paper chromatography,which possesses several disadvantages such as time-consuming,poisonous reagents,low sensitivity and so on. In view of the above shortcomings,the capillary zone electrophoresis method was applied for separation of amino acids. Separation conditions were also systematically optimized.The whole separation procedure was more safely and effectively with capillary electrophoresis. In addition,students’ enthusiasm and initiative were also enhanced.

capillary electrophoresis; amino acid; biochemical experiments

10.16791/j.cnki.sjg.2016.09.042

2016-03-14修改日期：2016-05-04

陜西省教改項(xiàng)目“生物工程專業(yè)貫通式創(chuàng)新人才培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)區(qū)建設(shè)”；西安交通大學(xué)教改項(xiàng)目“生物工程綜合開放實(shí)驗(yàn)課程建設(shè)與實(shí)踐”

李華(1987—),男,山西夏縣,碩士,助理工程師,主要研究方向?yàn)樯锕こ虒I(yè)教學(xué)與管理工作

E-mail：huali2014@mail.xjtu.edu.cn

孔宇(1976—),男,陜西南鄭,博士,副教授,主要研究方向?yàn)樯锕こ虒I(yè)教學(xué)管理工作和綜合開放實(shí)驗(yàn)教學(xué)工作.

E-mail：yukong@mail.xjtu.edu.cn

G642.423

A

1002-4956(2016)9-0163-03