郭藝山，尚紅巖，黃向陽(yáng)，高俊永，高亞飛，蘇江濱，徐日益，梁 磊，3

（1.廣州甘蔗糖業(yè)研究所；2.廣東省甘蔗改良與生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.廣東省生物質(zhì)高值化利用工程實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510316）

一種多孔質(zhì)固定化酵母在糖蜜酒精生產(chǎn)中的應(yīng)用研究

郭藝山1，2，尚紅巖1，2，黃向陽(yáng)1，2，高俊永1，2，高亞飛1，2，蘇江濱1，2，徐日益1，2，梁 磊1，2，3

（1.廣州甘蔗糖業(yè)研究所；2.廣東省甘蔗改良與生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.廣東省生物質(zhì)高值化利用工程實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510316）

文章主要探討一種新的固定化酵母載體制備方法，以多孔鋼渣、硅藻土和珍珠巖等材料為細(xì)胞宿主載體，采用空化制泡工藝制備成多孔質(zhì)固化載體，并應(yīng)用于糖蜜酒精發(fā)酵中。經(jīng)試驗(yàn)結(jié)果表明，該載體具有良好的機(jī)械強(qiáng)度、傳質(zhì)效率以及優(yōu)良的發(fā)酵特性。

多孔質(zhì)；固定化酵母；糖蜜酒精

目前，我國(guó)利用制糖工業(yè)中的副產(chǎn)物糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)酒精工藝過(guò)程，已經(jīng)廣泛采用多孔圓柱體（蜂窩煤狀）固定化酵母載體進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵，同傳統(tǒng)酒精發(fā)酵工藝相比，固定化酵母具有發(fā)酵周期短、設(shè)備利用率高、雜菌感染少、發(fā)酵率高、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)。這種載體一般以聚乙烯醇（PVA）為主要固定基材，PVA經(jīng)過(guò)高溫溶解、冷卻、添加酵母液或酵母泥后冷凍成型、包裝及冷凍保藏，在產(chǎn)品到達(dá)用戶地后還需要經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的解凍、活化環(huán)節(jié)，以喚醒休眠的酵母菌，且由于固定化酵母載體形成致密的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，固定基材內(nèi)的酵母與發(fā)酵液發(fā)生傳質(zhì)的速率大大降低，載體內(nèi)酵母增殖速度慢，嚴(yán)重影響初期發(fā)酵液中酵母菌達(dá)到增值平衡點(diǎn)的速率［1-4］。本文創(chuàng)新的嘗試一種方法制備固定化酵母，該方法主要引入空化制泡制備的工藝特點(diǎn)及以多孔鋼渣、硅藻土、陶土和珍珠巖材料中的一種或兩種以上的混合物作為細(xì)胞宿主載體，以期改善載體內(nèi)部結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)固定化酵母產(chǎn)品性能，提高生產(chǎn)效率。

1 材料與方法

1.1 材料

甘蔗糖蜜：85°Bx，廣東某企業(yè)酒精生產(chǎn)用糖蜜。

菌種：高活性糖蜜酒精酵母粉SIRI08-11（廣州甘蔗糖業(yè)研究所保藏）。

活化培養(yǎng)基：配制16°Bx糖蜜加0.2%尿素，pH 3.2，115℃下滅菌30min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：配制32°Bx糖蜜加0.2%尿素，pH 4.0，115℃下滅菌30min。

1.2 方法

1.2.1 多孔固定化酵母載體制備方法

將10%PVA于80～100℃溶解于水中得到PVA溶液，然后將PVA溶液冷卻至35℃以下，再加入復(fù)合酵母液攪拌混合均勻，得到酵母混合液；然后將酵母混合液在0～30℃進(jìn)行空化制泡、倒入模具中冷凍成型，得到所述多孔固定化酵母。

其中，上述的復(fù)合酵母液包括海藻糖0.1%～1.0%，糖蜜0.5%～2.0%，細(xì)胞宿主載體0.5%～2.5%（漂洗處理后的粒度為500目～10mm多孔鋼渣、硅藻土、陶土和珍珠巖材料中的一種或兩種以上的混合物），酵母干粉5%～10%。空化制泡是指在0.01～0.3MPa壓力下通過(guò)壓縮空氣的微孔制泡系統(tǒng)進(jìn)行空化制泡，或通過(guò)旋轉(zhuǎn)機(jī)械制泡系統(tǒng)進(jìn)行空化制泡。

1.2.2 PVA固定化酵母的制備

方法以固定化酵母載體制備基本工藝，10% PVA為細(xì)胞宿主載體，無(wú)空化制泡工藝流程。

1.2.3 PVA-海藻酸鈉固定化酵母的制備

方法以固定化酵母載體制備基本工藝，10% PVA和1%海藻酸鈉為細(xì)胞宿主載體，無(wú)空化制泡工藝流程。

1.2.4 多孔質(zhì)固定化酵母載體應(yīng)用性能評(píng)價(jià)

1.2.4.1 多孔質(zhì)固定化酵母載體的機(jī)械強(qiáng)度評(píng)定［5］

采用按壓法：以載體所能承受的最大壓力來(lái)表征機(jī)載體的械強(qiáng)度。在自制正方形小盒內(nèi)均勻分布隨機(jī)選取3顆固定化載體顆粒，用輕的玻璃片蓋在上面，將50g法碼壓在輕玻璃片上，計(jì)時(shí)60s，施壓前后分別用0～150mm游標(biāo)卡尺測(cè)量載體顆粒的直徑D和d，計(jì)算出兩者差值△d。則可得單個(gè)載體顆粒的機(jī)械強(qiáng)度為：Pi=50·△d-2，其中△d三次測(cè)定平均值。載體顆粒的平均機(jī)械強(qiáng)度為測(cè)量組的平均值P（g·mm-2）為測(cè)量3組平均值。

1.2.4.2 多孔質(zhì)固定化載體酵母的傳質(zhì)效率評(píng)定

無(wú)菌條件下，在三角瓶?jī)?nèi)裝入100mL濃度為1mol/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，并隨機(jī)取30粒載體顆粒裝入三角瓶中浸泡，將三角瓶置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中保存24h，在波長(zhǎng)為540nm條件下，浸泡前后用DNS法測(cè)定葡萄糖溶液濃度，該固定化載體的傳質(zhì)性能可由浸泡前后葡萄糖溶液濃度差來(lái)表征。濃度差值越大表明載體顆粒的傳質(zhì)性能越優(yōu)良。為消除背景干擾，對(duì)照組以同樣的方法處理空白載體顆粒過(guò)濾液。

1.2.4.3 多孔質(zhì)固化酵母載體發(fā)酵特性的評(píng)定［6-7］

第一，起種活化時(shí)間的測(cè)定，稱取解凍后的3g不同類型載體接入150mL糖蜜活化培養(yǎng)基，置于30℃恒溫培養(yǎng)并開(kāi)始培養(yǎng)計(jì)時(shí)，待活化液錘度降至10°Bx時(shí)，記錄為起種活化時(shí)間。

第二，糖蜜酒精發(fā)酵，按一定的接種量將固定化酵母置于糖蜜活化培養(yǎng)基中，并在30℃條件下?lián)u床培養(yǎng)20h，然后取出固定化酵母洗凈后轉(zhuǎn)入裝有糖蜜發(fā)酵培養(yǎng)基帶有發(fā)酵栓的三角瓶中，32℃條件下靜態(tài)發(fā)酵，間隔一定時(shí)間稱重，測(cè)CO2累積生產(chǎn)量，即失重，通過(guò)CO2生成的速率（g·h-1）反映發(fā)酵的快慢。待發(fā)酵終止，測(cè)定成熟醪酒份與殘?zhí)呛俊?/p>

以此綜合評(píng)定載體的發(fā)酵特性。

1.2.5 多孔質(zhì)固化酵母載體空化制泡方式對(duì)發(fā)酵特性的影響

分別制備對(duì)不同空化制泡工藝制備的固化酵母載體進(jìn)行對(duì)比發(fā)酵試驗(yàn)，以發(fā)酵過(guò)程CO2生成效率來(lái)評(píng)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 多孔質(zhì)固化酵母載體的物理性能

通過(guò)測(cè)定多孔質(zhì)固化酵母，PVA-海藻酸鈉固化酵母及PVA固化酵母三類載體的物理性能，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同載體固化酵母物理性能對(duì)比

由表1可見(jiàn)，機(jī)械強(qiáng)度大小分別為：PVA-海藻酸鈉固化載體（下文由②表示）＞多孔質(zhì)固化載體（下文由①表示）＞PVA固化載體（下文由③表示）；傳質(zhì)系數(shù)大小分別為：①＞②＞③。在糖蜜酒精連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，固化載體的機(jī)械強(qiáng)度是決定其能否承受在長(zhǎng)期連續(xù)發(fā)酵過(guò)程的流體沖擊力，一般而言為滿足連續(xù)發(fā)酵的需求，載體的機(jī)械強(qiáng)度越高越好，但是增減載體的機(jī)械強(qiáng)度時(shí)往往會(huì)降低載體的傳質(zhì)性能，而酵母的生長(zhǎng)代謝受載體的傳質(zhì)性能影響較大，因此在制備固化酵母載體時(shí)需綜合比較載體的機(jī)械強(qiáng)度和傳質(zhì)性能，綜上所述，結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果得出，多孔質(zhì)固化酵母載體物理性能優(yōu)于其他兩種載體。

2.2 多孔質(zhì)固化酵母載體的發(fā)酵特性

通過(guò)對(duì)三類固化酵母載體的活化培養(yǎng)及發(fā)酵培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2和圖1。

由表2和圖1可見(jiàn)，固化酵母載體經(jīng)冷凍保藏后首次啟用，活化用時(shí)多孔質(zhì)載體耗時(shí)最短為30h，相比較于PVA-海藻酸鈉酵母載體及PVA酵母載體的耗時(shí)分別縮短了14.3%與23.1%；發(fā)酵成熟醪液的酒度和殘?zhí)呛拷Y(jié)果顯示，三種載體中多孔質(zhì)固化酵母載體發(fā)酵性能最優(yōu)，所得酒份含量最高，殘?zhí)呛孔畹?。綜合載體首次活化耗時(shí)及發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)果表明，多孔質(zhì)固化酵母載體具有優(yōu)異的發(fā)酵性能。分析其優(yōu)異發(fā)酵性能的主要原因，可能是由于多孔質(zhì)固化酵母載體制備過(guò)程中采用海藻糖和稀糖蜜做酵母細(xì)胞的保護(hù)劑，減少了酵母細(xì)胞在凍融過(guò)程中的損傷，能夠有效保護(hù)酵母細(xì)胞的存活基數(shù)；同時(shí)，空化制泡工藝提高的酵母細(xì)胞宿主載體內(nèi)部空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，豐富酵母細(xì)胞在載體中生殖代謝的通道，增強(qiáng)發(fā)酵過(guò)程的傳質(zhì)效率，有效提高發(fā)酵效率。

2.3 多孔質(zhì)固化酵母載體空化制泡方式對(duì)發(fā)酵特性的影響

通過(guò)壓縮空氣的微孔制泡系統(tǒng)和旋轉(zhuǎn)機(jī)械制泡系統(tǒng)進(jìn)行空化制泡所得兩種多孔質(zhì)固化酵母載體，與傳統(tǒng)固化酵母進(jìn)行發(fā)酵對(duì)比試驗(yàn)，測(cè)定其發(fā)酵過(guò)程的CO2生成速率，結(jié)果見(jiàn)圖2。

表2 不同載體固化酵母發(fā)酵特性對(duì)比

圖1 不同固化酵母載體發(fā)酵過(guò)程中CO2失重對(duì)比

圖2 不同空化制泡固化酵母載體發(fā)酵過(guò)程中CO2生成速率對(duì)比

從圖2可見(jiàn)，發(fā)酵過(guò)程CO2生成率微孔制泡方式和機(jī)械制泡方式均高與傳統(tǒng)固化酵母，微孔制泡方式最佳。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了，空化制泡方式能夠有效的豐富載體內(nèi)部孔隙，有效增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在載體內(nèi)部的傳遞，使得酵母細(xì)胞能夠更好的生長(zhǎng)代謝。同時(shí)也表明了微孔制泡方式相比較機(jī)械制泡方式能夠更有效的增加在單位體積載體中獲得更多的氣泡孔隙，獲得更好傳質(zhì)性能。

3 小結(jié)

通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證了該多孔質(zhì)固化酵母載體具有較好的機(jī)械強(qiáng)度與傳質(zhì)系數(shù)等物理性能，同時(shí)采用海藻糖和稀糖蜜作為酵母細(xì)胞保護(hù)劑，提高冷凍后載體內(nèi)部酵母細(xì)胞的存活基數(shù)；通過(guò)添加細(xì)胞宿主載體和空化制泡技術(shù)，有效提高固化酵母載體中的空間網(wǎng)絡(luò)孔隙占比率和產(chǎn)品的活化性能，豐富酵母在載體中生長(zhǎng)代謝的傳質(zhì)通道，增大發(fā)酵過(guò)程的傳質(zhì)效率，提高發(fā)酵效率，提高原料利用效率等特點(diǎn)，可滿足糖蜜酒精連續(xù)生產(chǎn)的需求。

［1］ 李起斌.固定化活酵母連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)糖蜜酒精［J］.甘蔗糖業(yè)，1994，（3）：48-50.

［2］ 張書祥.固定化酵母連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)酒精工業(yè)應(yīng)用的研究［J］.生物學(xué)雜志，1999（3）：27-28.

［3］ 何延青.微生物固定化技術(shù)與載體結(jié)構(gòu)的研究［J］.環(huán)境科學(xué)，2004，25（2）：101-104.

［4］ 鄧元修.固定化酵母酒精發(fā)酵［J］.華中理工大學(xué)學(xué)報(bào)，1993，21（2）：176-180.

［5］ 劉樹(shù)文，李華，等.微生物固定化粒子機(jī)械強(qiáng)度的研究［J］.微生物學(xué)雜志，2005，25（4）：32-34.

［6］ 梁秉華，程群卿，等.編寫.甘蔗糖蜜酒精生產(chǎn)檢驗(yàn)方法［M］.輕工業(yè)部甘蔗糖業(yè)研究所，1986：4547.

［7］ 梁磊，張遠(yuǎn)平，朱明軍，等.甘蔗塊固定化酵母的制備及其在蔗汁燃料乙醇生產(chǎn)中的應(yīng)用［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35（2）：76-79.

TS249.3

B

2095-820X（2016）04-04

2016-06-24

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013B010102002）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014A010107017）；廣東省省級(jí)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2016B070701005）；廣東省科學(xué)院科研平臺(tái)環(huán)境與能力建設(shè)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2016GDASPT-0208）。

郭藝山（1984—），男，福建漳州人，工學(xué)碩士，工程師，研究方向：制糖綜合利用與工業(yè)微生物代謝與調(diào)控，E-mail：279589449@qq.com。