李士杏

摘 要 針對(duì)“果汁中的果膠和果膠酶”教學(xué)中常見的一些問(wèn)題進(jìn)行了歸納，對(duì)果膠和果膠酶的相關(guān)背景知識(shí)進(jìn)行了適度的補(bǔ)充和拓展，對(duì)于實(shí)驗(yàn)過(guò)程出現(xiàn)的問(wèn)題進(jìn)行了分析討論，并給出了對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行改進(jìn)的一些建議。

關(guān)鍵詞 果膠 果膠酶 實(shí)驗(yàn)教學(xué)

中圖分類號(hào) G633.91 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 B

“果汁中的果膠和果膠酶”是浙科版高中生物學(xué)選修1《生物技術(shù)實(shí)踐》模塊中的實(shí)驗(yàn)。教材中雖然簡(jiǎn)單地介紹了果膠和果膠酶的背景知識(shí)，但是在解題時(shí)，學(xué)生如果遇到更深入的問(wèn)題，比如膠的化學(xué)本質(zhì)、組成成分、理化性質(zhì)、來(lái)源等問(wèn)題以及果膠酶和果膠甲酯酶的關(guān)系等問(wèn)題，學(xué)生就顯得比較茫然。該實(shí)驗(yàn)操作看似簡(jiǎn)單，其實(shí)影響因素較多，因此學(xué)生常反映實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象不夠明顯，重現(xiàn)性差。筆者下面補(bǔ)充了一些關(guān)于果膠和果膠酶的相關(guān)知識(shí)，討論了實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的常見問(wèn)題，并給出了實(shí)驗(yàn)改進(jìn)的一些建議，為該實(shí)驗(yàn)的教學(xué)提供參考。

1 果膠的化學(xué)本質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)

果膠是一種天然的植物多糖，相對(duì)分子量介于50～300 kD之間。果膠分子不僅僅是由半乳糖醛酸以α-1，4糖苷鍵聚合而成的多糖鏈，其實(shí)還含有鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、海藻糖和芹菜糖等組成的側(cè)鏈以及少量的單糖，其中半乳糖醛酸中的C6可被甲酯化或酰胺化。果膠分子的結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，且隨著植物的種類、組織部位、生長(zhǎng)條件等的不同而不同。大致可分為同型半乳糖醛酸聚糖（HGA）、鼠李半乳糖醛酸聚糖-Ⅱ（RG-Ⅱ）、木糖半乳糖醛酸聚糖（XG）和鼠李半乳糖醛酸聚糖-Ⅰ（RG-Ⅰ）四個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域（圖1）。

2 果膠的水溶性及提取和純化果膠的方法

果膠的溶解性由果膠的聚合度及甲氧基的含量和分布決定。一般來(lái)說(shuō)，果膠的相對(duì)分子量越小，酯化度越高，其溶解性越好。果膠顆粒溶解時(shí)是先溶脹再溶解。

果膠在植物細(xì)胞壁中的含量最高，主要存在于初生細(xì)胞壁和中間片層。山楂中果膠含量高于其他水果，約為6.4%。但實(shí)際生產(chǎn)中考慮到原料的成本較高，常從柑橘皮和蘋果皮渣中提取果膠。有研究表明柚子皮、向日葵盤以及臍橙皮中果膠含量也很高。

果膠的提取過(guò)程是一個(gè)將不溶性果膠轉(zhuǎn)化為可溶性果膠，可溶性果膠向液相轉(zhuǎn)移過(guò)程。果膠的提取方法有多種，應(yīng)用最廣泛的傳統(tǒng)的方法是用稀酸進(jìn)行提取。純化果膠的方法也有多種，普遍使用的是醇沉法，利用了果膠不溶于乙醇的特點(diǎn)。

3 果膠酶和果膠甲酯酶的區(qū)別

果膠酶是指能分解果膠物質(zhì)的多種酶的總稱。果膠酶大致可分為果膠水解酶、果膠裂解酶（PL）、果膠酯酶（PE）和原果膠酶等。果膠水解酶又有多種，如聚半乳糖醛酸酶（PG）、聚半乳糖醛酸甲酯水解酶（PMG）、聚鼠李半乳糖醛酸酶（RHG）等。由于人們對(duì)PG的認(rèn)識(shí)最早，早先常被稱為果膠酶。所以，果膠酶是一類酶的統(tǒng)稱還是特指半乳糖醛酸酶（PG）還需根據(jù)上下文進(jìn)行理解。

聚半乳糖醛酸酶（PG）可以水解切斷果膠分子的α-1，4糖苷鍵，但對(duì)于酯化程度較高的果膠來(lái)說(shuō)水解速度較低。果膠甲酯酶（PME）的作用位點(diǎn)是果膠分子的還原性末端或鄰近的游離羧基，能水解果膠中甲氧基與半乳糖醛酸之間的酯鍵，形成甲醇和果膠酸。再經(jīng)過(guò)PG作用可形成半乳糖醛酸（圖2）。在果實(shí)軟化過(guò)程中，PME的作用是PG發(fā)揮作用的必要前提。

4 獲取果膠酶的方法

除了曲霉和青霉外，還有一些毛霉、根霉等也能產(chǎn)生果膠酶。由于黑曲霉屬于公認(rèn)的代謝產(chǎn)物安全的菌種，所以市售的食品級(jí)果膠酶主要來(lái)源于黑曲霉。一些細(xì)菌，如浸麻芽孢桿菌、節(jié)桿菌、假單胞桿菌也都能生產(chǎn)果膠酶。某些放線菌和酵母菌也可以產(chǎn)生果膠酶。研究者們常通過(guò)物理和化學(xué)誘變方式選育出高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的果膠酶菌株。

如果微生物所產(chǎn)的果膠酶是胞外酶，通過(guò)過(guò)濾、離心獲得的培養(yǎng)基上清液即是粗酶液。如果產(chǎn)生的果膠酶是胞內(nèi)酶，則需要通過(guò)超聲波、酶解以及研磨破碎等方法使酶釋放出來(lái)。制得的粗酶液先經(jīng)過(guò)硫酸銨鹽析和有機(jī)溶劑沉淀進(jìn)行初步分離，再通過(guò)層析法進(jìn)行提純。

5 在“果汁中的果膠和果膠酶”實(shí)驗(yàn)中難以觀察到明顯的果汁澄清現(xiàn)象的原因

在課堂教學(xué)中，很多學(xué)生反映此實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與預(yù)期不符。比如發(fā)現(xiàn)未添加果膠酶的試管中澄清現(xiàn)象比添加了果膠酶的試管更明顯，或者觀察不到明顯的果汁澄清現(xiàn)象，有時(shí)還會(huì)在試管上部發(fā)現(xiàn)一些懸浮物。這些問(wèn)題的產(chǎn)生可能是由以下原因?qū)е碌摹?/p>

蘋果勻漿為果汁和果泥的不均勻混合物，在分裝到試管中時(shí)難以保證各試管中反應(yīng)物的一致性，由此影響試管中果汁澄清的實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察。如果采用紗布或者濾紙將蘋果勻漿進(jìn)行過(guò)濾，得到均一的果汁濾液，分裝時(shí)才能大大減少誤差，實(shí)驗(yàn)結(jié)果才能可靠。

果膠酶使果汁澄清分層的時(shí)間是比較長(zhǎng)的，往往要幾十分鐘甚至幾個(gè)小時(shí)才有明顯的現(xiàn)象。學(xué)生實(shí)驗(yàn)的時(shí)間有限，可以采用不斷攪拌的方法促進(jìn)酶和底物的接觸，也可以采取提高反應(yīng)溫度的方法加快反應(yīng)速率。比如將試管放在45～50℃的水浴鍋中10～20 min，就能有明顯的結(jié)果出現(xiàn)。

沉淀物在試管上部懸浮的現(xiàn)象可能是由于機(jī)械榨汁過(guò)程中果汁中混入大量氣泡導(dǎo)致的。用研磨過(guò)濾器制取的果汁進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)可以有效避免這個(gè)顯現(xiàn)，使果汁澄清更加明顯。

6 “果汁中的果膠和果膠酶”實(shí)驗(yàn)中將試管沸水浴加熱的作用

很多學(xué)生把這一步驟誤以為是驗(yàn)證酶在高溫下失活，催化作用喪失。其實(shí)在沸水浴之前，果膠酶和果汁已經(jīng)混合，酶促反應(yīng)已經(jīng)發(fā)生，果膠已經(jīng)分解。此處的加熱步驟不是用來(lái)證明高溫會(huì)破壞酶活性，而是一種果汁生產(chǎn)中常用的熱凝澄清工藝。果汁溫度上升到55℃以上時(shí)，某些酶蛋白發(fā)生變性失活，導(dǎo)致果汁中的可溶性固形物含量增加，從而達(dá)到澄清的效果。

7 使用乙醇檢驗(yàn)果汁中果膠的分解程度的方法

由于果膠不溶于乙醇，因此在果汁中加入乙醇如果觀察到絮狀物現(xiàn)象這說(shuō)明果汁中仍有果膠，絮狀物的形成速度和數(shù)量可反映果膠的含量。但是當(dāng)試管中的果汁澄清效果不佳時(shí)，果膠沉淀絮狀物的觀察就受到影響。此時(shí)，可以吸取少量果汁上清液到點(diǎn)樣板中，加入體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇，就可看到明顯的絮狀沉淀產(chǎn)生。另外，也有文獻(xiàn)提到采用96%乙醇與1%濃鹽酸的按比例為99∶1配制成乙醇溶液，取一份果汁加兩份乙醇，也能觀察到明顯的絮狀物。

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