楊 薇，劉 爽，樊曉靖

天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300193

化痰通絡(luò)方對急性腦梗死溶栓后JNK mRNA表達(dá)的影響*

楊 薇，劉 爽△，樊曉靖

天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300193

目的：探討化痰通絡(luò)方對急性腦梗死溶栓后缺血再灌注損傷后調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)關(guān)鍵靶點JN Km RN A的影響。方法：將健康SD大鼠160只隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、rt-PA組、rt-PA+化痰通絡(luò)法聯(lián)合組各40只。除假手術(shù)組在注射時以生理鹽水0.3 m L代替栓子溶液外，其余各組按大腦中動脈栓塞（M CA O）模型制備。rt-PA組予5.67m g/kgrt-PA溶栓治療，化痰通絡(luò)法聯(lián)合rt-PA組在溶栓基礎(chǔ)上予9m L/kg中藥濃煎劑灌胃治療，2次/d。每組分別于6 h及1、3、7天4個時相各取10只大鼠采用RT-PCR檢測方法，觀察梗死部位腦組織JNK mRN A表達(dá)變化情況。結(jié)果：與模型組相比，rt-PA組3、7天時JNK mRN A表達(dá)量均下降（P＜0.05），rt-PA+化痰通絡(luò)組4個時相JNK mRN A表達(dá)量均下降（P＜0.05）；與rt-PA組相比，rt-PA+化痰通絡(luò)組在第1天時JNK mRN A表達(dá)量下降（P＜0.05）。結(jié)論：化痰通絡(luò)方可通過降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后細(xì)胞凋亡性信號途徑中JNK mRN A表達(dá)水平減輕應(yīng)激腦神經(jīng)細(xì)胞不可逆性致死，達(dá)到防治急性腦梗死溶栓后缺血再灌注損傷進(jìn)一步發(fā)展的目的。

缺血再灌注損傷；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；細(xì)胞凋亡；JNK mRN A；化痰通絡(luò)

缺血再灌注損傷嚴(yán)重影響急性腦梗死溶栓治療的臨床療效，限制溶栓療法廣泛開展。經(jīng)動物模型實驗證實，再灌注后大量神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是引起凋亡的重要機(jī)制之一。究其原因，ERS持續(xù)時間過長或過強(qiáng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)若不能及時重新建立，則通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)啟動細(xì)胞凋亡途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，造成更大的損害。近年來研究表明J N K(c-Jun N-terminal kinases)信號途徑活化是其重要凋亡機(jī)制之一。因此減緩其誘導(dǎo)凋亡反應(yīng)可能成為減輕急性腦梗死溶栓后缺血再灌注繼發(fā)性損傷的一種潛在治療方式。

經(jīng)過多年臨床實踐，結(jié)合既往研究成果，我院以化痰通絡(luò)立法組方且聯(lián)合溶栓治療急性腦梗死患者，能明顯促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，提高患者日常生活能力和生存質(zhì)量［1-3］。本實驗通過觀察化痰通絡(luò)方對急性腦梗死溶栓后大鼠梗死部位腦組織J N K m RN A表達(dá)水平的影響，初步探討該法改善急性腦梗死溶栓后缺血再灌注損傷的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SD大鼠160只，雌雄各半，體質(zhì)量200～250g(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，2級)，實驗動物合格證號：SCXK(京)2014-0004。按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、rt-PA組、rt-PA+化痰通絡(luò)法組各40只，每組再分為6小時及1、3、7天4個時相組各10只［4］進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.2 藥物與試劑 化痰通絡(luò)法藥物組成：天麻10 g，半夏10 g，膽南星5 g，丹參30 g，川芎10 g，地龍10 g，酒大黃5 g，制成9 m L/kg濃煎劑(天津中醫(yī)藥大學(xué)制劑中心制備，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。注射用重組組織纖溶酶原激活劑(rt-PA，德國勃林格殷格翰公司生產(chǎn)，批號：005765201304)；血栓誘導(dǎo)劑(長春國奧藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：20081218)。

1.3 M CA O模型制備 模型組、rt-PA組和rt-PA+化痰通絡(luò)法聯(lián)合組參照張新江等［5］方法制備大腦中動脈栓塞(M CAO)模型大鼠。假手術(shù)組手術(shù)方法同模型制作，注射時以生理鹽水0.3 m L代替栓子溶液。

1.4 干預(yù)方法 rt-PA組、rt-PA+化痰通絡(luò)法聯(lián)合組于血栓注入后3小時，將5.67 m g/kg rt-PA加入0.9%生理鹽水2 m L中，一次性于20分鐘內(nèi)由尾靜脈緩慢注入溶栓治療。rt-PA+化痰通絡(luò)組同時給予化痰通絡(luò)方中藥灌胃治療，6小時組于造模成功后給予中藥1次；1天組于造摸成功后及處死前2小時各給中藥1次，共2次；3天組于造模成功后開始給藥，每日給中藥2次，持續(xù)3天，共6次；7天組于造模成功后開始給藥，每日給中藥2次，持續(xù)7天，共14次。均采用灌胃方法給藥。其余各組采用與中藥相等劑量的蒸餾水于灌服中藥相同時間點灌胃。

1.5 檢測指標(biāo)及方法 各組大鼠斷頭處死，取大腦梗死組織勻漿，采用熒光定量PCR檢測調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后中凋亡途徑關(guān)鍵靶點J N K m RN A表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5統(tǒng)計學(xué)軟件處理，計量資料以(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

同一組內(nèi)，和6小時相比，模型組1天時相J N K m RN A表達(dá)量升高(P＜0.05)，其他各組1天時相J N K m RN A表達(dá)量均達(dá)最高，符合腦梗死發(fā)展規(guī)律。同一時相內(nèi)，與假手術(shù)組相比，模型組在4個時相中J N K m RN A表達(dá)量均增高(P＜0.05)；與模型組相比，rt-PA組3天、7天時相J N K m RN A表達(dá)量均下降(P＜0.05)，rt-PA+化痰通絡(luò)組4個時相J N K m RN A表達(dá)量均下降(P＜0.05)；與rt-PA組相比，rt-PA+化痰通絡(luò)組1天時相時J N K m RN A表達(dá)量下降(P＜0.05)，見表1。

表1 不同時相大腦梗死組織JN K m RN A表達(dá)量(±s)

表1 不同時相大腦梗死組織JN K m RN A表達(dá)量(±s)

注：■表示同一組內(nèi)和6小時相比，P＜0.05；同一時相內(nèi)，*表示和假手術(shù)組相比，P＜0.05；△表示與模型組相比，P＜0.05；▲表示與rt-PA組相比，P＜0.05。

組別 只數(shù) 6 h 1 d 3 d 7 d假手術(shù)組 40 0.24±0.02 0.25±0.04 0.31±0.09 0.30±0.08模型組 40 0.83±0.05* 1.00±0.09■* 0.76±0.03* 0.73±0.07*rt-PA組 40 0.73±0.16 0.93±0.11 0.58±0.14△ 0.47±0.09△rt-PA+化痰通絡(luò)組 40 0.65±0.07△ 0.73±0.12△▲ 0.52±0.17△ 0.46±0.13△

3 討論

相關(guān)研究［6］發(fā)現(xiàn)，ERS作為關(guān)鍵因素參與了腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，其相應(yīng)凋亡機(jī)制與J N K信號通路密切相關(guān)。J N K是M APK家族的重要成員之一，因其可以調(diào)控細(xì)胞內(nèi)外不同的應(yīng)激反應(yīng)，又叫應(yīng)激激活蛋白激酶。經(jīng)國內(nèi)外學(xué)者研究［7-9］證實，J N K信號通路能介導(dǎo)多種細(xì)胞外刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的發(fā)生，在調(diào)控腦組織缺血再灌注內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡中發(fā)揮重要作用。因此，調(diào)節(jié)J N K信號通路是治療細(xì)胞凋亡引起疾病的重要靶點。Anand等［10］研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞中J N K通路隨著p-M KK4、p-J N K和p-c-J un表達(dá)增加而被激活，進(jìn)一步介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞死亡，發(fā)揮重要作用。而在腦缺血再灌注損傷模型中，抑制磷酸化J N K的表達(dá)，可有效減輕全腦缺血再灌注引起的海馬區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞凋亡［11］。

腦梗死屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)病”范疇，風(fēng)痰瘀阻證是缺血性中風(fēng)急性期的主要證型，早期投以化痰泄?jié)?、祛瘀通絡(luò)方藥切中病機(jī)［12-14］。在以往研究成果的基礎(chǔ)上結(jié)合臨床經(jīng)驗確立化痰通絡(luò)方，該方由天麻、半夏、膽南星、丹參、川芎、地龍、酒大黃7味藥組成，方中川芎為血中氣藥，辛散上行，丹參涼血活血，二藥合用行氣活血祛瘀；天麻為治風(fēng)之神藥；半夏、膽南星具有清熱化痰通絡(luò)之功；地龍清熱熄風(fēng)通絡(luò)；酒大黃清熱祛瘀瀉濁。7味藥合用共奏祛風(fēng)化痰、清熱瀉濁、祛瘀通絡(luò)之功效。在臨床上采用化痰通絡(luò)法聯(lián)合溶栓治療超早期急性腦梗死風(fēng)痰瘀阻證患者，療效滿意［15］。

本研究通過RT-PCR方法檢測腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織J N K m RN A表達(dá)量不同時相的變化，發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組相比，其余各組J N K m RN A表達(dá)量均較假手術(shù)組增加，說明缺血再灌注損傷導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生，而在損傷后1小時達(dá)峰值，符合腦出血再灌注損傷病理發(fā)展趨勢，該結(jié)果與蔡理［16］對損傷后J N K3基因參與神經(jīng)細(xì)胞凋亡及神經(jīng)功能恢復(fù)的研究結(jié)果相似；與模型組相比，rt-PA+化痰通絡(luò)組4個時相J N K m RN A表達(dá)量均明顯下降，說明化痰通絡(luò)法聯(lián)合rt-PA溶栓，可通過有效減少腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織中J N K m RN A的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞凋亡信號途徑，減少神經(jīng)細(xì)胞不可逆致死性，進(jìn)而保護(hù)腦梗死后缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)細(xì)胞，防治急性腦梗死溶栓后缺血再灌注損傷的進(jìn)一步發(fā)展。

隨著急性腦梗死溶栓后缺血再灌注損傷的不斷深入研究，復(fù)方中藥在調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)、減少細(xì)胞凋亡中多途徑、多靶點作用優(yōu)勢可能成為治療急性腦梗死后缺血再灌注的新方法。

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The Influence of HuaTan TongLuo Prescription on the Expressions of JNKmRNA of the Rats with Acute Cerebral Infarction after Thrombolysis

YANG Wei，LIU Shuang△，F(xiàn)AN Xiaojing
The Second Affiliated Hospital of Tianjin University of TCM，Tianjin 300193，China

Objective:To observe the effects of HuaTan TongLuo prescription on the expressions of JNK mRNA of the rats after ischemia reperfusion injury with acute cerebral infarction.Methods:All 160 rats were randomly allocated to sham operation group，the model group，rt-PA group and the group of HuaTan TongLuo method combined with rt-PA，40 rats each group.Except sham operation group received the injection of physiological saline，0.3 mL，in place of embolus solution，other groups were prepared by middle cerebral artery occlusion （MCAO）.rt-PA group accepted thrombolytic therapy，5.67mg/kg，the group of HuaTan TongLuo method combined with rt-PA intragastric administration of herbal concentrated decoction，9mL/kg，twice per day，on the foundation of thrombolytic therapy.Ten rats were taken out from each group and detected by RT-PCR method at the times of six hours，one day，three days and seven days，and the expressions of JNK mRNA in cerebral tissue of the infracted area were observed. Results:The expressions of JNK mRNA decreased notably at three days and seven days of rt-PA group compared with the model group（P＜0.05），JNKmRNA expressions lowered obviously at four different times in the group of HuaTan TongLuo method combined with rt-PA（P＜0.05）；compared with rt-PA group，JNKmRNA expressions reduced obviously in the group of HuaTan TongLuo method combined with rt-PA in one day（P＜0.05）.Conclusion: HuaTan TongLuo prescription could relieve irreversible death of brain nerve cells by decreasing JNKmRNA expressions in cellular apoptosis signal pathway after the stress of endoplasmic reticulum，therefore to achieve the goal of preventing further development of ischemia reperfusion injury after the thrombolysis of acute cerebral infarction.

ischemia reperfusion injury；the stress of endoplasmic reticulum；cellular apoptosis；JNKmRNA；HuaTan TongLuo

R255.2

A

1004-6852（2016）09-0009-03

2015-03-27

國家自然科學(xué)基金項目（編號81273942）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)及前沿技術(shù)研究計劃（編號12JCZDJC25300）。

楊薇（1989—），女，在讀碩士研究生。研究方向：腦病的診治。

△通訊作者：劉爽（1984—），女，博士學(xué)位，主治醫(yī)師。研究方向：腦病的中西醫(yī)結(jié)合診治。