錢琴蓮，李 曄，王求娟，王 穎，蘇秀榕，*

（1.寧波大學海洋學院，浙江 寧波 315211；2.寧波今日食品有限責任公司，浙江 寧波 315500）

基于GC-MS和電子鼻技術的金槍魚胰臟酶解氣味解析

錢琴蓮1，李 曄1，王求娟2，王 穎1，蘇秀榕1，*

（1.寧波大學海洋學院，浙江 寧波 315211；2.寧波今日食品有限責任公司，浙江 寧波 315500）

目的：對不同蛋白酶水解金槍魚胰臟的風味物質比較分析，為金槍魚胰臟深加工提供參考。方法：以不加蛋白酶作對照，不同蛋白酶水解金槍魚胰臟，利用電子鼻和頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase microextraction，HS-SPME）與氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）聯(lián)用儀，對酶解液氣味的響應值進行載荷分析、主成分分析和成分的定性定量分析。結果：電子鼻測得不加酶組與菠蘿蛋白酶、動物蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶組間氣味存在明顯差異。HS-SPME-GCMS法分別檢測出45、54、54、34、46、43、53 種和50 種揮發(fā)性成分，主要為烴類、醇類、醛類、酮類、呋喃類等化合物。增香的丁香醛、β-紫羅蘭酮和2-乙基呋喃均在動物蛋白酶組中相對含量最高。腥味物質在木瓜蛋白酶組、風味蛋白酶組和胰蛋白酶組中相對含量較低。結論：動物蛋白酶組能明顯增加怡人香味，而木瓜蛋白酶組、風味蛋白酶組和胰蛋白酶組對腥味有較好的改善作用。

金槍魚胰臟；蛋白酶水解；揮發(fā)性物質；頂空固相微萃??；電子鼻；氣相色譜-質譜聯(lián)用

錢琴蓮， 李曄， 王求娟， 等. 基于GC-MS和電子鼻技術的金槍魚胰臟酶解氣味解析［J］. 食品科學， 2016， 37（8）: 121-126.

胰腺是高等動物體內具有分泌功能的實體性腺體，含有蛋白質、胰酶、激素、多肽、氨基酸、核苷酸、脂類、多糖等活性物質［1］。金槍魚胰臟與陸生動物相比較更為發(fā)達，約占金槍魚總內臟質量的27%（鰓除外），將胰臟酶解可產生多肽、氨基酸等活性成分［2］。蛋白酶可將大分子蛋白質酶解成具有生物活性的小肽，王霞等［3］利用黃鰭金槍魚胰臟酶解液改善糖尿病大鼠血糖、血脂，促進糖代謝和脂代謝的良性循環(huán)。由于各種蛋白酶都具有相對的底物專一性，不同蛋白酶其作用位點也不一量，因此，不同蛋白酶會對酶解液的營養(yǎng)價值和風味起重要作用［4-8］。本實驗利用電子鼻系統(tǒng)，分析不同蛋白酶處理的金槍魚胰臟揮發(fā)性物質的變化差異，并結合頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）檢測胰臟的揮發(fā)性成分，以期探明金槍魚在不同蛋白酶或不加酶的條件下整體風味上的差異，為今后金槍魚胰臟酶解的加工工藝提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

金槍魚胰臟 浙江寧波今日食品有限公司；菠蘿蛋白酶、動物蛋白酶、風味蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶 廣西南寧龐博生物工程有限公司。

1.2儀器與設備

PEN3便攜式電子鼻系統(tǒng) 德國AirSense公司；QP2010 GC-MS聯(lián)用儀 日本島津公司；50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/ carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）、65 μm PDMS萃取頭 美國Supelco公司。

1.3方法

1.3.1金槍魚胰臟酶解液的制備

將清洗、瀝干后的胰臟放于組織攪碎機中打碎。實驗組量品：在底物質量濃度50 g/100 mL、加酶量為底物質量的1%、溫度55 ℃、時間6 h的酶解條件下制備酶解液；對照組量品：加酶量為0，其余條件與實驗組相同。

1.3.2量品處理

PEN3電子鼻的金屬氧化物電子鼻傳感器對各組量品不同氣味分子在其表面的化學作用轉化為電信號，從而得到不同的響應值，PEN3電子鼻10個傳感器對應揮發(fā)性風味物質見表1。

電子鼻量品前處理：取各組量品200 μL于15 mL的量品瓶中密封，用于電子鼻檢測。每組量品設5 個平行。

GC-MS：取各組量品5 mL于15mL SPME頂空瓶中，密封30 min后，將經過老化處理過的50/30 μm DVB/ CAR/PDMS萃取頭（65 μm PDMS）插入頂空瓶中，于60 ℃水浴吸附30 min，迅速將萃取頭置于進量口250 ℃解吸2 min，進行GC-MS分析。

表1　PEN3所用傳感器及其性能描述Table 1 Sensors used and their main application in PEN3

1.3.3檢測條件

電子鼻：量品進量流量為300 μL/min，測量時間為196 s和197 s，清洗時間200～500 s。

GC條件：VOCOL毛細管色譜柱（60 m×0.32 mm，1.8 μm）；進量口溫度與接口溫度均為210 ℃，檢測溫度210 ℃；程序升溫：起始柱溫35℃保持2 min，以3 ℃/min升至40 ℃，保留1 min，再以5 ℃/min升至210 ℃，保持25 min；采用不分流進量模式，恒壓35 kPa；載氣為He，流速為0.3 mL/min。

MS條件：電子電離源；離子源溫度200 ℃；電子能量70 eV；接口溫度250 ℃；質量掃描范圍33～500 u；掃描時間35 min。

1.4數(shù)據(jù)處理

電子鼻測定結果利用WinMuster進行響應值分析、載荷分析以及主成分分析（principle component analysis，PCA）。GC-MS數(shù)據(jù)檢測結果通過計算機檢索譜庫Wiley及NIST 08相互匹配進行定性分析。將譜庫中化合物相似度低于80（最大值為100）的組分標為未鑒定出。各組分相對含量按照峰面積歸一化法計算。

2　結果與分析

2.1電子鼻檢測

2.1.1不同傳感器的響應值分析

圖1　電子鼻傳感器對不同酶解液揮發(fā)性物質的響應值Fig.1 Responses of electronic nose sensors to volatile substances of different hydrolysates

對各組的電子鼻檢測結果分別取平均值，得到不同傳感器響應值與各組揮發(fā)性風味的關系如圖1所示，S2、S6和S8這3 個傳感器的響應值較高。實驗組與對照組在S4、S5、S7和S10這4 個傳感器中響應值相差均極顯著，而傳感器S1和S6兩組均相差不顯著，傳感器S3中對照組和中性蛋白酶組響應值相差不顯著，說明在分析各組風味上，S4、S5、S7和S10參考性大，在S1、S3和S6參考性較小。

2.1.2載荷分析

圖2　電子鼻10 個傳感器響應值的載荷分析Fig.2 Loadings analysis of responses of ten electronic nose sensors

通過載荷分析，如圖2所示，可以得出電子鼻的10 個傳感器分別對量品的PCA的貢獻率：在PC1貢獻率方面，S2傳感器貢獻率最大，其余傳感器相差較?。欢赑C2貢獻率方面，S7傳感器貢獻率最大。響應值分析和載荷分析表明，不同的傳感器對量品的響應值不同，由響應值可推出對照組與實驗組的顯著性差異不同，各傳感器的載荷貢獻率差異明顯，據(jù)此可對傳感器進行選擇與優(yōu)化，使電子鼻檢測達到更優(yōu)的結果。綜上可知，選擇S2、S4、S5、S7和S10傳感器的響應值對不同蛋白酶優(yōu)化胰臟酶解液風味進行PCA。

2.1.3PCA

圖3　加酶實驗組和不加酶對照組的PCAFig.3 PCA analysis of odors of intact and hydrolyzed tuna pancreas

PCA是將所提取的傳感器多指標化為少數(shù)幾個綜合指標的一種線性判別方法，最后在PCA分析的散點圖上顯示主要的兩維散點圖。由金槍魚胰臟在不同蛋白酶作用下的PCA，由圖3可知，PC1貢獻率為96.17%，PC2貢獻率為1.90%，總貢獻率達98.07%，說明PCA可用于區(qū)分各組的揮發(fā)性氣味。在相同實驗條件下，各組均區(qū)分度較明顯，對照組與菠蘿蛋白酶、動物蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶的氣味呈現(xiàn)一定的聚類現(xiàn)象，但仍能有效區(qū)分。各組均在各自區(qū)域，不發(fā)生重疊，說明各組間均存在差異，具有一定的研究價值。因此，選用S2、S4、S5、S7和S10這5 個傳感器的響應值做PCA。

2.2HS-SPME-GC-MS測定結果

圖4　胰臟酶解液的的揮發(fā)性物質種類分析Fig.4 Classification of volatile compounds identified in protein hydrolysates from tuna pancreas

由圖4所示，由GC-MS分析發(fā)現(xiàn)菠蘿蛋白酶、動物蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶實驗組，以及不加酶對照組分別進行鑒定，分別得到45、54、54、34、46、43、53 種和50 種揮發(fā)性成分，從而可知經蛋白酶處理的酶解液揮發(fā)性物質總數(shù)中木瓜蛋白酶最少，動物蛋白酶和堿性蛋白酶最多。利用二元變量Jaccard系數(shù)［9］，對照組和實驗組相似度分別為菠蘿蛋白酶組61.02%、動物蛋白酶組76.27%、堿性蛋白酶組70.50%、木瓜蛋白酶組52.73%、風味蛋白酶組65.52%、胰蛋白酶組57.63%和中性蛋白酶組77.59%。從而可知木瓜蛋白酶組的酶解液風味可能與不加酶對照組相差最大。利用電子鼻檢測發(fā)現(xiàn)每組處理都能明顯分開，但是因為電子鼻只能夠對氣味的整體特征作出響應，不能對每一種單獨的揮發(fā)性物質作出響應，因此需要用GC-MS來進一步檢測分析，以此找出不同組風味上的具體差異。

2.2.1烴類化合物及風味

表2　金槍魚胰臟對照組和實驗組的揮發(fā)性物質相對含量Table 2 Relative contents of volatile compounds in the control and the experimental groups%

續(xù)表2%

續(xù)表2%

部分烷烴類可能源于脂肪酸降解，芳香烴則可能是由帶芳香基的游離氨基酸氧化產生的［10］。由表2可知，十五烷在所有組中均存在，且相對含量在所有烴類中最高，它與同量存在于各組的十七烷是天然魚香及其餌料硅藻的共同香氣物質。十五烷和十七烷可能是通過烷基自由基的脂質自氧化或類胡蘿卜素的分解生成，其閾值較高，因此對各組風味的形成直接貢獻不大，但有助于提高胰臟酶解液整體香味效果［11］。實驗組中的菠蘿蛋白酶、動物蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶組的十五烷和十七烷總量明顯低于不加酶對照組，烴類含量的減少意味著可能其他風味貢獻率大的揮發(fā)性物質相對含量的增多，對胰臟酶解液風味的復雜性起到一定作用。

2.2.2醇類化合物及風味

多數(shù)醇類化合物閾值較高，其中的直鏈飽和醇的香味對金槍魚胰臟酶解液的貢獻率較低，而一些不飽和醇的閾值較低，并具有蘑菇香氣和類似金屬味，對金槍魚胰臟酶解液的貢獻率較高［12-13］。由表2可知，除動物蛋白酶組外，其他組醇類相對含量均比不加酶對照組高，其中菠蘿蛋白酶組最高，實驗共檢出14 種醇類化合物，占總揮發(fā)性物質的9.89%～20.87%，均存在的醇類有1-辛烯-3-醇、5-甲基-1-己炔-3-醇、2，7-辛二烯-1-醇和E，E-壬-2，4-二烯醇。1-辛烯-3-醇是一種亞油酸的氫過氧化物的降解產物，表現(xiàn)出類似蘑菇的香氣，普遍存在于魚類的揮發(fā)性香味物質中［14］。1-戊烯-3-醇是菠蘿蛋白酶組中特有的，1-戊烯-3-醇具有水果香味、青草香，是沙丁魚、白鮭魚以及鯖魚的典型風味成分。除動物蛋白酶組和中性蛋白酶組外，其余實驗組中1-戊烯-3-醇和1-辛烯-3-醇的總量均高于不加酶對照組。由于醇類物質能產生品質較為柔和的水果香味［15］，因此認為其在胰臟酶解液整體風味中起貢獻鮮香味的作用。

2.2.3醛類化合物及風味

由表2可知，本次實驗共檢測出25 種醛類化合物。在各組中，除木瓜蛋白酶組外，醛類化合物相對含量均位列第二，并且醛類化合物的閾值通常比其他化合物低，具有脂肪香味，因此，此類化合物對胰臟加熱后的整體風味有重要作用［16-17］。苯甲醛具有強烈的甜橙氣息、炒花生香以及腥味［18］，苯甲醛在對照組中相對含量最高，通過酶解，苯甲醛相對含量降低，說明通過蛋白酶的水解，明顯改變了胰臟加熱后的風味。2，4-癸二烯醛則會呈強烈的雞香和雞油味，在動物蛋白酶和堿性蛋白酶組中相對含量最高達1.97%［19］。壬醛、庚醛具有強烈的油脂氣味和魚腥味壬醛還具有柑橘量風味，實驗組中兩者總相對含量均比對照組高。己醛通常產生一種原生味、鮮香和類醛的特征香味［20］，主要來自ω-6不飽和脂肪酸，己醛在含量較高時，具有青草味-脂肪味［21］，各組中相對含量均在2%～5%之間，相差不大，給人以淡淡的清香。在各組中均含有清新果香的丁香醛，且相對含量都在2%以上，動物蛋白酶組和中性蛋白酶組通過對金槍魚胰臟酶解，將丁香醛對照組相對含量為2.76%分別上升到7.29%和9.25%之多，對胰臟酶解液整體風味有較大改善。

2.2.4酮類化合物及風味

酮類化合物可能是由于多不飽和脂肪酸熱氧化、氨基酸降解或微生物氧化產生的，具有獨特的清香和果香風味，并且隨著碳鏈的增長給出更強的花香特征，對胰臟酶解液特殊香味的形成有著重要作用［22］。由表2可知，實驗共檢測出15 種酮類化合物。在各組中均存在，相對含量相差不大的2，3-辛二酮對其奶油香氣有貢獻［23］。E，E-3，5-辛二烯-2-酮能帶來水果香，因此該物質的存在可能會對胰臟酶解液風味產生較好影響。β-紫羅蘭酮具有濃郁的紫羅蘭香氣，接近煙草的木香、果香和甜的氣味，是一種名貴香料，此外β-紫羅蘭酮具有較強的生物活性，對腫瘤的發(fā)生有明顯的抑制作用［24］。β-紫羅蘭酮在各組中均能檢測出，并且蛋白酶組中所含β-紫羅蘭酮的相對含量均高于不加酶組，動物蛋白酶組相對含量最高達2.05%，因此通過動物蛋白酶酶解，使得酶解液帶有類似清新的花香。

2.2.5呋喃類化合物及風味

呋喃類化合物來源于氨基酸與還原糖間的美拉德反應以及氨基酸的熱分解反應，它們大都具有很強的肉香味以及極低的香氣閾值，對金槍魚酶解液風味的形成具有重要影響。2-戊基呋喃具有類似火腿香味，2-乙基呋喃有強烈的肉香味、焦香味和甜味，產生誘人的芳香味［25］。不加酶對照組2-乙基呋喃相對含量僅為0.38%，通過添加動物蛋白酶進行酶解，相對含量上升到5.75%，由此可以看出，動物蛋白酶可對胰臟酶解液有增香作用。

3　結 論

通過電子鼻測定，在整體風味上，不同蛋白酶處理金槍魚胰臟具有明顯差異。胰臟加熱后，無論有無加酶均產生了多種揮發(fā)性成分，木瓜蛋白酶水解液的種類數(shù)與不加酶蛋白酶實驗組相差較大。堿性蛋白酶組和動物蛋白酶組中烴類化合物相對含量最少，因此這2 組的風味較其他組要濃郁和復雜。醇類化合物在整體風味中主要起增加鮮香味的作用，動物蛋白酶組醇類物質相對含量僅比不加酶組少1.10%，其他加酶組的醇類物質相對含量均比不加酶組高，說明酶解液對風味改善具有一定作用。1-戊烯-3-醇、1-辛烯-3-醇、己醛、庚醛、E，Z-2，6-壬二烯醛、Z-4-庚烯醛、苯甲醛、2，4-庚二烯醛、壬醛、2，4-壬二烯醛和E，E-3，5-辛二烯-2-酮等是魚肉中產生腥味的化合物［26-28］，在不加酶，添加菠蘿蛋白酶、動物蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶不同處理條件下，腥味物質相對含量分別為20.59%、20.88%、20.07%、25.45%、15.69%、14.89%、14.53%和18.22%。由此可見，木瓜蛋白酶、風味蛋白酶和胰蛋白酶對胰臟酶解液腥味形成有明顯改善。帶有怡人果香味的丁香醛，在中性蛋白酶組和動物蛋白酶組中相對含量分別為9.25%和7.29%，可對腥味有一定的掩蓋作用，提高了胰臟酶解液的可接受度。為整體風味貢獻較大的β-紫羅蘭酮，在動物蛋白酶組含量最高，使得酶解液帶有類似清新的花香。2-戊基呋喃具有類火腿香味，2-乙基呋喃有強烈的肉香味、焦香味和甜味，產生誘人的芳香味，這2 種物質在動物蛋白酶中相對含量也最高。以上可以看出，動物蛋白酶可對胰臟酶解的風味有較大的改善。

通過電子鼻和GC-MS數(shù)據(jù)綜合分析表明，木瓜蛋白酶、風味蛋白酶和胰蛋白酶酶解液的腥味比其他組低，且具有去腥效果，動物蛋白酶酶解液具有多種高含量的優(yōu)質風味物質，風味改善效果明顯，為今后金槍魚胰臟酶解液制品以及其他類似產品提供參考和理論依據(jù)。

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Analysis of Volatile Flavor Compounds of Tuna Pancreatic Protein Hydrolysates Produced by Different Proteases

QIAN Qinlian1， LI Ye1， WANG Qiujuan2， WANG Ying1， SU Xiurong1，*
（1. School of Marine Sciences， Ningbo University， Ningbo 315211， China； 2. Ningbo Today Food Co. Ltd.， Ningbo 315500， China）

Objective: To compare the volatile flavor compounds of tuna pancreatic protein hydrolysates produced by different proteases and therefore to provide references for deep processing of tuna pancreas. Methods: An electronic nose was used to detect odors of tuna pancreatic tissue as a control and its enzymatic hydrolysates. The sensor array was optimized by loading analysis for principal component analysis （PCA）. Headspace solid-phase micro extraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry（HS-SPME-GC-MS） was used to identify and compare the volatile flavor components of all the above samples. Results: PCA analysis revealed that electronic nose enabled the detection of significant differences in odors of the control， bromelain， animal protease， alkaline protease， papain， flavorzyme， trypsin and neutral protease groups. A total of 45， 54， 54， 34， 46， 43， 53 and 50 volatile substances were identified by HS-SPME-GC-MS in these groups， respectively， mainly including hydrocarbons， alcohols，aldehydes， ketones and furans. The flavor compounds syringaldehyde， β-ionone and 2-ethyl-furan were the most abundant in the animal-derived protease groups. The relative contents of fishy odor compounds in the papain， flavorzyme and trypsin groups were lower than those in other groups. Conclusion: The hydrolysis of tuna pancreas with animal-derived proteases could significantly enhance pleasant flavor. Papain， flavourzyme and trypsin have better effects on deodorization.

tuna pancreas； proteases； volatile substances； headspace solid-phase micro extraction （HS-SPME）； electronic nose； gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）

10.7506/spkx1002-6630-201608021

TS254.1

A

1002-6630（2016）08-0121-06

10.7506/spkx1002-6630-201608021. http://www.spkx.net.cn QIAN Qinlian， LI Ye， WANG Qiujuan， et al. Analysis of volatile flavor compounds of tuna pancreatic protein hydrolysates produced by different proteases［J］. Food Science， 2016， 37（8）: 121-126. （in Chinese with English abstract）

10.7506/ spkx1002-6630-201608021. http://www.spkx.net.cn

2015-11-19

國家海洋區(qū)域發(fā)展創(chuàng)新示范項目（2013710）；寧波市科技局農業(yè)與社發(fā)重大科技項目（2010C10040）

錢琴蓮（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品檢測與研發(fā)。E-mail：953452623@qq.com

蘇秀榕（1956—），女，教授，博士，研究方向為食品科學與工程、生物化學與分子生物學。

E-mail：suxiurong@nbu.edu.cn

引文格式：