吳 雨，李紅艷，張水鋒，牛燦杰，洪 凰，陳召桂，陳小珍，*

（1.浙江省質(zhì)量檢測(cè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310012；2.浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州 310014；3.浙江五芳齋實(shí)業(yè)股份有限公司，浙江 嘉興 314003）

高效液相色譜法測(cè)定粽子中的黃酮類化合物及其遷移規(guī)律

吳 雨1，2，李紅艷1，張水鋒1，牛燦杰1，洪 凰3，陳召桂3，陳小珍1，2，*

（1.浙江省質(zhì)量檢測(cè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310012；2.浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州 310014；3.浙江五芳齋實(shí)業(yè)股份有限公司，浙江 嘉興 314003）

建立天然包裝材料箬葉及粽米中葒草苷、異葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷、對(duì)香豆酸5 種黃酮類化合物的高效液相色譜的分析方法。通過測(cè)定一次蒸煮、二次蒸煮、不同保存條件等因素對(duì)箬葉及粽米中黃酮類化合物含量變化的影響，闡明了不同條件下箬葉中黃酮類化合物在粽子中的遷移規(guī)律。結(jié)果表明：一次蒸煮后，葒草苷、異葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷、對(duì)香豆酸5 種黃酮化合物從箬葉遷移到粽米的遷移率為7.41%～45.18%；二次蒸煮時(shí)，在120 min內(nèi)箬葉中5 種黃酮類化合物的遷移率為18.07%～65.94%，特別是在前30 min中，箬葉中黃酮類化合物降低明顯，分別占120 min總減少量的51.61%～72.48%，并且二次蒸煮的遷移率大于一次蒸煮。在30 d的保存時(shí)間內(nèi)，箬葉中黃酮類化合物在前15 d減少明顯，占總減少量的68.60%～85.50%（除異牡荊苷為0外）；第15天后遷出緩慢；30 d內(nèi)總遷移率分別為25.90%～64.84%（除異牡荊苷為0外）。隨著二次蒸煮時(shí)間與保存時(shí)間的變化，葒草苷與異葒草苷較遷移緩慢。新鮮保存的方式最有利于異牡荊苷在粽子中遷移，速凍保存最有利于葒草苷、異葒草苷、牡荊苷、對(duì)香豆酸的遷移。異牡荊苷在真空保存和速凍保存時(shí)短時(shí)間內(nèi)不發(fā)生遷移。

粽子；箬葉；黃酮類化合物；高效液相色譜；遷移規(guī)律

吳雨， 李紅艷， 張水鋒， 等. 高效液相色譜法測(cè)定粽子中的黃酮類化合物及其遷移規(guī)律［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（8）: 115-120.

WU Yu， LI Hongyan， ZHANG Shuifeng， et al. Determination of flavonoids in rice dumplings by high performance liquid chromatography and their migration patterns［J］. Food Science， 2016， 37（8）: 115-120. （in Chinese with English abstract）

黃酮類化合物是一類具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)的化合物，在自然界中以游離態(tài)（苷元）和結(jié)合態(tài)（與糖結(jié)合成苷類）的形式存在于植物體內(nèi)［1-3］，具有保護(hù)心腦血管、調(diào)節(jié)血脂、增強(qiáng)免疫力、抗菌、抗病毒等多種保健及藥理作用［4-8］。箬葉是一種天然生物黃酮的新資源，富含黃酮類、內(nèi)酯類和酚酸類化合物［9-11］，因其葉片寬大，氣味濃郁，自春秋以來就成為粽子的主要包裝材料。粽子作為中國傳統(tǒng)的膳食食品，具有清香可口、風(fēng)味多量、易保存便于烹飪等特性，廣受人們的喜愛。目前對(duì)粽子的研究主要為工藝方面，而在功能成分方面的研究鮮有報(bào)道。

近年來，食品容器、包裝等接觸材料中某些特定物質(zhì)在食品中的遷移規(guī)律成為國內(nèi)外研究的熱門，主要為涂覆［12］、陶瓷［13］、塑料［14］和玻璃［15］等包裝材料中有毒有害物質(zhì)的遷移。目前，國內(nèi)外關(guān)于黃酮類化合物研究［16-19］主要為竹葉、荷葉、艾葉、車前子等植物中黃酮類化合物的檢測(cè)，對(duì)包裝材料中黃酮類化合物在食品中遷移規(guī)律的研究尚屬空白。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜檢測(cè)方法，分析了粽米及包裝材料箬葉中葒草苷、異葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷、對(duì)香豆酸5 種黃酮類化合物含量，并分別對(duì)一次蒸煮、二次蒸煮、保存條件及保存時(shí)間等影響因素進(jìn)行了討論，研究箬葉中5 種黃酮類化合物在粽子中的遷移規(guī)律。該研究契合了社會(huì)倡導(dǎo)的綠色健康飲食理念，為推廣傳統(tǒng)天然包裝材料在食品中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

箬葉、糯米、粽子（約100 g/個(gè)，經(jīng)一次蒸煮后出廠） 浙江五芳齋實(shí)業(yè)股份有限公司；前處理?xiàng)l件優(yōu)化所用箬葉采自浙江杭州，包粽子及遷移規(guī)律研究所用箬葉采自湖南張家界；甲醇、乙腈、乙酸、乙醇（均為色譜純） 德國Meker公司。

1.2儀器與設(shè)備

LC-20AD高效液相色譜儀 日本Shimadzu公司；高速冷凍離心機(jī) 美國Thermo公司；AS10200AT超聲波清洗儀 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；WH-861渦旋混合器 太倉華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Büchi公司：XBridge C18色譜柱 美國Waters公司；超純水儀 美國Millipore公司。

1.3方法

1.3.1量品前處理

箬葉量品清洗后經(jīng)自然風(fēng)干，粉碎過40 目篩后，稱取0.5 g（精確到0.001 g）；粽米經(jīng)攪碎后取10 g（精確到0.01 g）。分別于50 mL離心管中，加入體積分?jǐn)?shù)40%乙醇溶液5 mL，渦旋，混合均勻后頻率為20 kHz超聲提取15 min，10 000 r/min離心5 min，收集上清液于雞心瓶。固體殘?jiān)貜?fù)提取一次，合并2 次上清液，45 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，用水定容至10 mL，過0.22 μm水相濾膜后供高效液相色譜法分析測(cè)定。

1.3.2量品提取

振蕩提取法和超聲波提取法比較：量品分別用振蕩提取法和超聲波提取法（頻率為20 kHz）提取15 min。

超聲波提取法優(yōu)化：超聲波頻率20～60 kHz，超聲時(shí)間5～30 min（箬葉量品），15～60 min（粽米量品），試劑乙醇體積分?jǐn)?shù)0%～100%，加入乙醇2.5～12.5 mL/次（箬葉量品），5.0～20.0 mL/次（粽米量品）。

1.3.3色譜條件

采用XBridge C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分離。流動(dòng)相：0.1%乙酸-乙腈-甲醇（78∶9∶13，V/V）溶液，柱溫35 ℃；流速0.9 mL/min；進(jìn)量量15 μL；波長309、342 nm。

1.3.4量品的蒸煮及保存工藝

一次蒸煮：將粽子放入水中，選用蒸煮溫度115～170 ℃，壓力0.1 MPa，蒸煮時(shí)間80 min，經(jīng)室溫冷卻后備用；二次蒸煮：將粽子放入水中，選用蒸煮溫度100 ℃，蒸煮時(shí)間30 min，經(jīng)室溫冷卻后備用；新鮮粽：粽子經(jīng)一次蒸煮后，在室溫條件下保存，保質(zhì)期：5～7 d；真空粽：粽子經(jīng)一次蒸煮后，進(jìn)行真空包裝，在121 ℃條件下高溫滅菌后，室溫條件下保存，保質(zhì)期：270 d；速凍粽：粽子經(jīng)一次蒸煮后，對(duì)粽子進(jìn)行速凍處理，使粽子中心溫度降至-18 ℃，冷凍保存（-18 ℃），保質(zhì)期：540 d。

2　結(jié)果與分析

2.1前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)比較振蕩提取法和超聲波提取法，發(fā)現(xiàn)超聲波提取法提取率遠(yuǎn)高于振蕩提取法。由于超聲波頻率、超聲波提取時(shí)間是影響有效成分提取率的主要因素，應(yīng)根據(jù)實(shí)際量品的性質(zhì)來確定適宜的超聲頻率、超聲時(shí)間［20-22］。故選擇超聲波頻率與超聲時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。由圖1可知，箬葉與粽米的最佳超聲波提取條件均為：20 kHz條件下超聲提取15 min。

圖1　黃酮類化合物含量隨超聲頻率、超聲時(shí)間的變化Fig.1 Influence of ultrasonic frequencyand time on the contents of flavonoids in Indocalamus leaves （A） and glutinous rice （B）

繼而對(duì)提取試劑乙醇體積分?jǐn)?shù)、單次提取液用量進(jìn)行了優(yōu)化，如圖2所示，箬葉量品每次采用5 mL體積分?jǐn)?shù)40%乙醇溶液提取2 次，粽米量品采用15 mL體積分?jǐn)?shù)40%乙醇溶液提取1 次時(shí)，提取效率最佳。

圖2　箬葉中黃酮類化合物含量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）和單次提取液用量（B）的變化Fig.2 Influence of ethanol concentration （A） and volume （B） on the contents of flavonoids in Indocalamus leaves

2.2黃酮類化合物的高效液相色譜測(cè)定方法的優(yōu)化

圖3　5 種黃酮類化合物的光譜圖Fig.3 UV Spectra of 5 flavonoids

圖4　標(biāo)準(zhǔn)溶液中5 種黃酮化合物的色譜圖Fig.4 Chromatograms of mixed standard solution of 5 flavonoids at 10 mg/L

黃酮類化合物多為中等極性，常采用乙腈或甲醇與乙（或甲）酸水溶液為流動(dòng)相［23-24］，通過反相色譜柱分離、液相色譜紫外分析測(cè)定［25］。本實(shí)驗(yàn)嘗試以乙腈與乙酸溶液為流動(dòng)相，異葒草苷和葒草苷出峰時(shí)間過近，兩峰部分重疊，難以定量；以甲醇與乙酸溶液為流動(dòng)相時(shí)，牡荊苷和異牡荊苷也出現(xiàn)同量狀況。最終選用0.1%乙酸-乙腈-甲醇（78∶9∶13，V/V）溶液，等梯度洗脫。由圖3可知，對(duì)香豆酸在波長309 nm處有最大吸收峰，其他4 種碳苷黃酮在波長342 nm處有最大吸收峰。從圖4可以看出，目標(biāo)分析物均得到了很好地分離和檢測(cè)。5 種黃酮類化合物在0.1～100 mg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2均在0.99以上。檢出限（RSN=3）為0.01～0.03 mg/L，定量限（RSN=10）為0.03～0.09 mg/L。

圖5　樣品中5 種黃酮化合物的色譜圖Fig.5 Chromatograms of 5 flavonoids in Indocalamus leaves （A） and glutinous rice （B）

按1.3.1節(jié)及1.3.3節(jié)，對(duì)箬葉與新鮮白粽粽米中的黃酮類化合物進(jìn)行分析，所得的色譜圖如圖5所示，進(jìn)一步說明，該色譜條件分離能力強(qiáng)，檢測(cè)靈敏度高，適用于實(shí)際量品中5 種黃酮類化合物的同時(shí)分離測(cè)定。

2.3量品中黃酮類化合物的含量

表1　原料及樣品中黃酮類化合物的含量（n=3）Table 1 Contents of flavonoids in raw materials and samples （n= 3）mg/kg

由表1、2可知，原料中黃酮類化合物含量不同，箬葉中分別加入3 種不同水平的標(biāo)準(zhǔn)品，5 種黃酮類化合物的回收率為74.5%～125.1%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）（n=5）為4.0%～8.1%；在糯米基質(zhì)中加入3 種不同水平的標(biāo)準(zhǔn)品，5 種黃酮類化合物的回收率為65.2%～126.5%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）為2.4%～7.5%。黃酮類化合物在箬葉中檢出限（RSN=3）為0.2～0.5 mg/kg，定量限（RSN=10）0.6～1.5 mg/kg；在糯米中檢出限為0.02～0.03 mg/kg，定量限為0.06～0.09 mg/kg，均可以滿足實(shí)際量品的分析要求。

表2　原料中黃酮類化合物的加標(biāo)回收率、檢出限、定量限、RSDTable 2 Spiked recovery， LOD， LOQ and RSD of flavonoids in raw materials

2.4箬葉中黃酮類化合物在粽子中的遷移規(guī)律

2.4.1一次蒸煮對(duì)黃酮類化合物遷移的影響

為分析在一次蒸煮后粽子中黃酮類化合物含量的遷移變化規(guī)律以及觀察粽子本底對(duì)遷移是否有干擾，實(shí)驗(yàn)選取同一批用于包裹粽子的箬葉和經(jīng)過一次蒸煮出廠銷售的新鮮白粽按1.3.1節(jié)處理后進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)粽子均由兩張?bào)枞~包裹而成，兩張?bào)枞~的質(zhì)量約為5.5 g。由表1可得，箬葉中含有相當(dāng)量的黃酮類化合物，其中異葒草苷、對(duì)香豆酸含量較高，分別為84.88 mg/kg和157.78 mg/kg；糯米中不含葒草苷、牡荊苷及異牡荊苷，只含有少量的異葒草苷與香豆酸，其含量分別僅為0.07 mg/kg和0.09 mg/kg，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響可忽略不計(jì)，因此選擇糯米粽子作為評(píng)價(jià)遷移率的空白本底量品。經(jīng)過一次蒸煮后，箬葉中各黃酮類化合物含量明顯減少，異葒草苷、葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷、對(duì)香豆酸的減少量分別是62.61、7.59、9.38、11.42、127.77 mg/kg，其中遷移進(jìn)入粽米中的黃酮類化合物的比例分別為7.41%、36.22%、40.30%、18.05%、45.18%。

2.4.2二次蒸煮對(duì)黃酮類化合物遷移的影響

由于人們從市場(chǎng)購買的都是經(jīng)過一次蒸煮后出廠銷售的粽子，買回經(jīng)二次蒸煮后食用，因此對(duì)黃酮類化合物隨二次蒸煮時(shí)間的遷移進(jìn)行探究具有實(shí)際意義。選取一批新鮮白粽，放入100 ℃沸水中蒸煮，選擇蒸煮時(shí)間為10～120 min，其余步驟按1.3.1節(jié)方法處理。結(jié)果表明箬葉中的黃酮類化合物含量隨二次蒸煮時(shí)間延長均呈減少趨勢(shì)，后90 min減少緩慢。由表1可知，在120 min內(nèi)，異葒草苷、葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷、對(duì)香豆酸的總減少量分別是13.31、4.69、0.62、4.86、16.79 mg/kg。前30 min減少量大，分別占總減少量的72.05%、64.39%、51.61%、61.93%、72.48%。粽米中的黃酮類化合物含量隨二次蒸煮時(shí)間延長而增加，其中遷入粽米中的黃酮類化合物的遷移率分別為18.07%、65.94%、55.43%、56.57%、64.47%；遷移率高于一次蒸煮。對(duì)二次蒸煮前后黃酮類化合物含量變化的研究發(fā)現(xiàn)，葒草苷、異葒草苷在箬葉中含量均高于牡荊苷，而在粽米中的遷移量均低于牡荊苷，故葒草苷，異葒草苷隨時(shí)間遷移較緩慢?？傊?，高溫能實(shí)現(xiàn)5 種黃酮類化合物的快速遷移，且二次蒸煮的遷移率大于一次蒸煮。

2.4.3保存時(shí)間對(duì)黃酮類化合物遷移的影響

由于真空粽可保存的時(shí)間較長，故選取一批保存時(shí)間分別為1、15、30 d的真空白粽，按1.3.1節(jié)處理后進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)表明箬葉中的黃酮類化合物含量隨保存時(shí)間延長均呈減少趨勢(shì)，在30 d內(nèi)，異葒草苷、葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷、對(duì)香豆酸的總減少量分別是11.94、5.38、1.66、0.70、13.25 mg/kg。箬葉中黃酮類化合物在前15 d減少明顯，分別占總減少量的72.19%、85.50%、68.67%、22.86%、68.60%，15～30 d遷出速率減緩。5 種黃酮類化合物能隨保存時(shí)間發(fā)生遷移，粽米中的黃酮類化合物含量都隨保存時(shí)間延長而增加，由表1可知，由箬葉遷出而遷入粽米中的黃酮化合物遷移率分別為25.90%、38.32%、51.75%、0、64.84%。觀察保存時(shí)間延長對(duì)黃酮類化合物含量的影響，粽米中黃酮類化合物隨保存時(shí)間延長均勻增加，葒草苷、異葒草苷在箬葉中含量均高于牡荊苷，而在粽米中的遷移量均低于牡荊苷，與其他3 種黃酮類化合物相比，葒草苷、異葒草苷隨時(shí)間遷移較緩慢，共同的遷移緩慢可能與這2 種物質(zhì)是同分異構(gòu)體有關(guān)。

2.4.4保存方式對(duì)黃酮類化合物遷移的影響

選取一批保存方式不同的新鮮白粽（常溫保存）、真空白粽（真空包裝保存）、速凍白粽（-18 ℃保存），按1.3.1節(jié)處理，如表1所示，在不同保存方式條件下，新鮮保存最有利于異牡荊苷在粽子中遷移，而速凍保存最有利于其余4 種黃酮類化合物的遷移。異牡荊苷在真空粽與速凍粽中短時(shí)間內(nèi)未發(fā)生遷移。其余4種黃酮類化合物遷移到粽米中的含量從大到小依次是速凍粽、新鮮粽、真空粽。故新鮮保存最有利于異牡荊苷在粽子的遷移，而速凍保存最有利于其余4 種黃酮類化合物在粽子中的遷移。

3　結(jié) 論

通過實(shí)驗(yàn)建立了箬葉及粽米中異葒草苷、葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷、對(duì)香豆酸5 種黃酮類化合物的高效液相色譜檢測(cè)方法，并對(duì)箬葉和粽米前處理方法進(jìn)行選擇和優(yōu)化。對(duì)影響粽子中黃酮類化合物遷移因素的研究發(fā)現(xiàn)如下結(jié)論：

1）原料：箬葉中黃酮類化合物含量很高，糯米基本不含這5 種黃酮類化合物，是檢測(cè)遷移較好的空白本底。

2）蒸煮次數(shù)：一次蒸煮、二次蒸煮均能實(shí)現(xiàn)5 種黃酮類化合物短時(shí)間內(nèi)遷移。一次蒸煮后，經(jīng)水浸提進(jìn)入粽米中的黃酮類化合物的遷移率為7.41%～45.18%。二次蒸煮時(shí)，葒草苷、異葒草苷隨時(shí)間遷移較緩慢，箬葉中的黃酮類化合物前30 min減少量大，分別占120min內(nèi)總減少量的51.61%～72.48%。在120 min內(nèi)遷入粽米中的黃酮類化合物的遷移率為18.07%～65.94%。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，二次蒸煮的遷移率大于一次蒸煮。

3）保存時(shí)間：在30 d內(nèi)，葒草苷，異葒草苷隨時(shí)間遷移較緩慢，箬葉中黃酮類化合物在前15 d減少明顯，分別占總減少量的68.60%～85.50%（除異牡荊苷為0外），15～30 d遷出速率減緩。30 d內(nèi)，由箬葉遷出而遷入粽米中的黃酮類化合物遷移率為25.90%～64.84%（除異牡荊苷為0外）。

4）保存方式：新鮮保存最有利于異牡荊苷在粽子中遷移，而速凍保存最有利于葒草苷、異葒草苷、牡荊苷、對(duì)香豆酸的遷移。異牡荊苷在真空保存和速凍保存條件下，短時(shí)間內(nèi)不發(fā)生遷移。

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Determination of Flavonoids in Rice Dumplings by High Performance Liquid Chromatography and Their Migration Patterns

WU Yu1，2， LI Hongyan1， ZHANG Shuifeng1， NIU Canjie1， HONG Huang3， CHEN Zhaogui3， CHEN Xiaozhen1，2，*
（1. Zhejiang Institute of Quality Inspection Science， Hangzhou 310012， China；2. College of Chemical Engineering， Zhejiang University of Technology， Hangzhou 310014， China；3. Zhejiang Wufangzhai Industrial Co. Ltd.， Jiaxing 314003， China）

A method was developed for the determination of isoorientin， orientin， vitexin， isovitexin and p-coumaric acid in Indocalamus leaves and rice dumplings wrapped in them by high performance liquid chromatography （HPLC）. The migration patterns of these flavonoid compounds in fresh， vacuum-packaged and quick-frozen rice dumplings during the cooking process were established by determining their contents in Indocalamus leaves and the wrapped rice. The results showed that in the first boiling cycle， the migration percentages of flavonoids from indocalamus leaves to rice dumplings were 7.41%-45.18%. In the second cycle， the contents of flavonoids in indocalamus leaves were rapidly reduced in the first 30 min by 51.61%-72.48% as compared to the total reduction during the entire period of 120 min， and the migration percentages of flavonoids were 18.07%-65.94%， which were higher than those in the first boiling cycle. During the storage period of 30 days， the contents of flavonoids （except for no change in isovitexin） in Indocalamus leaves were reduced in the first 15 days by 68.60%-85.50% as compared to the total reduction over the whole storage period and the migration was slowed down from the 15 day onwards； the migration percentages of flavonoids （except that isovitexin did not migrate）were 25.90%-64.84% during the 30-day storage. During the second boiling cycle and storage period， the migration rates of isoorientin and orientin were lower than those of other flavonoids. Fresh rice dumplings were most beneficial for the migration of isovitexin， while quick-frozen samples were beneficial for the migration of other flavonoids. The migration of isovitexin under vacuum and quick-frozen conditions did not happen in a short time.

rice dumplings； Indocalamus leaves； flavonoids； high performance liquid chromatography （HPLC）； migration pattern

10.7506/spkx1002-6630-201608020

2015-07-10

公益性行業(yè)（質(zhì)檢）科研專項(xiàng)（201310150）；浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃項(xiàng)目（2015C37055）

吳雨（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩c檢測(cè)。E-mail：lucky1232009@163.com

陳小珍（1960—），女，高級(jí)工程師，本科，研究方向?yàn)槭称钒踩c檢測(cè)。E-mail：cxz730@163.com

TS201.2

A

1002-6630（2016）08-0115-06

10.7506/spkx1002-6630-201608020. http://www.spkx.net.cn

10.7506/spkx1002-6630-201608020. http://www.spkx.net.cn

引文格式：