趙俊良，盧海鵬，芒 來，金 山，*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部動物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

乳酸菌鹽溶性蛋白培養(yǎng)物中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性肽的測定及分離

趙俊良1，盧海鵬1，芒 來2，金 山1，*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部動物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

將16 株乳酸菌用MRS液體培養(yǎng)基3 代繼代培養(yǎng)后，離心，并用滅菌的生理鹽水制成乳酸菌懸浮液，接種于遠(yuǎn)東多線魚肉鹽溶性蛋白溶液（salt-soluble protein，SSP），對其代謝產(chǎn)物進(jìn)行血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制活性測定，篩選出ACE抑制活性較高的Pediococcus acidilactici ID7菌株（ACE抑制率為47.6%）和Lactobacillus plantarum 6214菌株（ACE抑制率為40.6%）。利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）對Pediococcus acidilactici ID7的鹽溶性蛋白培養(yǎng)代謝物進(jìn)行色譜分析，獲得了兩個峰，其相應(yīng)成分對ACE抑制的IC50分別為1.21 μg/mL和1.07 μg/mL，利用凝膠過濾HPLC法對出現(xiàn)較高的ACE抑制活性峰的成分進(jìn)行色譜純化，獲得了ACE抑制率為26.67%，分子質(zhì)量為586.7 D以下的ACE抑制多肽。

乳酸菌；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶；鹽溶性蛋白；高效液相色譜法

近幾年研究表明乳酸菌代謝產(chǎn)物和乳酸菌菌體具有提高機(jī)體營養(yǎng)成分的吸收［1-2］、調(diào)節(jié)腸胃和乳糖不耐受、降低膽固醇［3-6］、消除致癌因子、抗腫瘤［7-8］、提高機(jī)體免疫力［9］、抗高血壓、預(yù)防動脈硬化［10-13］、抗酸化和抗衰老等作用，尤其是人們對乳酸菌的抗高血壓作用越來越關(guān)注。機(jī)體血壓受很多因素的調(diào)節(jié)作用，其中最重要的因素是腎素——血管緊張素系統(tǒng)（renin angiotensin system，RAS）和激肽釋酶——激肽系統(tǒng)（kallikrein kinin system，KKS）之間的平衡，而系統(tǒng)中存在的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）則是影響兩個系統(tǒng)平衡的重要因素。ACE將RAS系統(tǒng)中的血管緊張素Ⅰ（angiotensinⅠ，AngⅠ）轉(zhuǎn)換為血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ），而AngⅡ是活性很強(qiáng)的血管收縮劑，導(dǎo)致血壓升高；另一方面，ACE也能作用于KKS系統(tǒng)中的降血壓物質(zhì)緩激肽而使其失活，從而使KKS系統(tǒng)處于抑制狀態(tài)，同樣導(dǎo)致了血壓的升高，因此，抑制血漿和血管內(nèi)皮細(xì)胞的ACE活性，不僅能夠抑制具有升高血壓作用的血管緊張素Ⅱ的產(chǎn)生，同時也能抑制降血壓作用的緩激肽的分解，從而達(dá)到降血壓的目的。食源性ACE抑制肽具有安全性、無副作用的優(yōu)點(diǎn)，在食品與醫(yī)藥領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。

1978年Cheung等［14］首次報(bào)道食物蛋白源ACE抑制多肽的研究后，相繼報(bào)道了魚肉、肉類、蔬菜、水果、發(fā)酵食品［15］等蛋白源ACE抑制多肽的研究。到目前為止，從天然蛋白酶分解物中分離到400多種ACE抑制肽，而且也具有能夠使腸道充分吸收的短鏈多肽［15］，特別是已經(jīng)證明了奶酪［11］、醬油［16］、發(fā)酵大豆食品［17］及酸奶［18-19］中含有ACE抑制肽。

本實(shí)驗(yàn)通過對接種乳酸菌的遠(yuǎn)東多線魚肉鹽溶性蛋白（salt soluble protein，SSP）的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，研究了乳酸菌的SSP溶液代謝產(chǎn)物與ACE抑制活性的關(guān)系，并用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）對Pediococcus acidilactici ID7 SSP溶液培養(yǎng)物進(jìn)行了色譜分析和ACE抑制多肽的分離純化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與菌種

實(shí)驗(yàn)所用16 株乳酸菌及其生化特性如表1所示，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基 北京陸橋有限責(zé)任公司；TYLG液體培養(yǎng)基：蛋白胨1.0 g/L、酵母粉0.50 g/L、葡萄糖0.50 g/L、吐溫-80 0.1 g/L、L-鹽酸鹽0.01 g/L、蒸餾水1 000 mL，pH 6.8。

1.1.3 試劑與儀器

氫氧化鈉、鹽酸、硼酸、葡萄糖 北京化工廠；乳糖 天津市永大化學(xué)試劑有限公司；醋酸乙酯、乙氰美國SMA公司；三氟乙酸 北京合力開拓化工有限公司；Bradford試劑 北京博凌科為生物科技有限公司。

HPS-160恒溫生化培養(yǎng)箱 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；U-1800型紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；Sigma 2-16PK高速低溫冷凍離心機(jī)、高效液相色譜儀、凝膠過濾高效液相色譜儀 德國Sigma公司；色譜柱5C18-AR-300 日本Nacalai Tesque公司；色譜柱Superdex Peptide HR 10/30 美國通用電氣公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 東京理化器械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 SSP溶液的制備

遠(yuǎn)東多線魚肉（75 g）加食鹽（1.5 g）后，再加蒸餾水（300 mL）、乳糖（2.0 g）、葡萄糖（2.0 g）及食鹽（1.1 g），用絞肉機(jī)研磨。將這個混合液用高速離心機(jī)離心（10 000×g，10 min，4 ℃），取上清液進(jìn)行過濾除菌（0.22 μm）制成SSP溶液（蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為8.0 mg/mL，pH 6.9）。測定蛋白質(zhì)濃度用紫外檢測方法［20］，即使用牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，測定280 nm波長處的吸光度之后換算為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。

1.2.2 乳酸菌的培養(yǎng)方法以及菌體濃度測定

分別將供試16 株乳酸菌用MRS液體培養(yǎng)基或TYLG液體培養(yǎng)基3 代繼代培養(yǎng)后，離心（13 000×g，20 min）取乳酸菌菌體，加5 mL滅菌生理鹽水制成菌體懸浮液。將菌體懸浮液1.0%接種于SSP溶液，L. casei 34143S、L. casei S-3-1、L.casei 6-2-05、L. plantarum 6214在30 ℃條件下培養(yǎng)24 h，其他菌株在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h。

1.2.3 ACE抑制活性測定方法

將培養(yǎng)乳酸菌的SSP溶液加熱滅菌（100 ℃，10 min）后，離心（13 000×g，20 min）取上清液，用氫氧化鈉調(diào)至pH值為8.3，作為樣品溶液，用Cheung等［14］的方法測定ACE抑制活性。將50 μL樣品溶液和50 μL ACE溶液（0.06 U/mL）在37 ℃條件下反應(yīng)10 min后，加入150 μL 200 mmol/L硼酸緩沖液（含6.7 mmol/L Bz-Gly-His-Leu，500 mmol/L NaCl，pH 8.3），在37 ℃條件下反應(yīng)30 min，然后用250 μL 1.0 mol/L的鹽酸停止反應(yīng)，再加醋酸乙酯0.5 mL充分?jǐn)嚢韬箅x心（800×g，15 min）抽提游離馬尿酸，并用移液管吸取上部醋酸乙酯層0.2 mL，在120 ℃烘箱內(nèi)烘干醋酸乙酯，再加入蒸餾水1.0 mL，混勻溶解馬尿酸后，用分光光度計(jì)在228 nm波長處測定吸光度，ACE抑制率計(jì)算公式如下。

式中：A1為反應(yīng)中ACE和樣品同時存在的吸光度；A2為反應(yīng)中蒸餾水代替樣品的吸光度；A3為加1.0 mol/L鹽酸停止ACE與馬尿酰-組氨酰-亮氨酸（N-Hippuryl-His-Leu hydrate，HHL）的空白反應(yīng)的吸光度。

1.2.4 ACE抑制多肽分離方法

1.2.4.1 樣品前處理

用MRS液體培養(yǎng)基3 代繼代培養(yǎng)Pediococcus acidilactici ID7后，13 000×g離心20 min取乳酸菌菌體，加5 mL滅菌生理鹽水制成菌體懸浮液。將菌體懸浮液按接種量1.0%接種于SSP溶液（過濾除菌，0.22 μm），在37 ℃條件下培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)后，100 ℃加熱處理10 min，10 000×g離心20 min取上清液，與乙醇以體積比1∶9緩慢混合沉淀蛋白（在10 ℃以下的環(huán)境進(jìn)行），離心（10 000×g，20 min），分別回收乙醇可溶性成分和乙醇不可溶性成分，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，加與樣品同體積蒸餾水溶解后，過濾除菌（0.22 μm）。pH值調(diào)至為8.3后用于測定ACE抑制率。

1.2.4.2 P. acidilactici ID7 SSP溶液培養(yǎng)物的乙醇可溶性成分分析

將P. acidilactici ID7 SSP溶液培養(yǎng)物的乙醇可溶性成分作為分析對象，以未接種乳酸菌SSP溶液為對照。用逆相-HPLC分離乙醇可溶性成分。色譜柱為5C18-AR-300（4.6 mm×250 mm，5 μm），進(jìn)樣量：80 μL；流動相：A為0.05%三氟乙酸（tri fluoroacetic acid，TFA），B為80%乙腈（含0.05% TFA），流速1.0 mL/min。收集移動相B：0～35%（40 min）線性梯度洗脫出的峰。

1.2.4.3 凝膠過濾HPLC分離

爸爸把矜持和驕傲種到了易非的骨子里。這些過眼云煙一樣的尊貴和富足，讓易非不聽任何得道高僧的教誨，就明白一切皆是流水。那些在她面前顯擺和賣弄的人，易非打從心眼兒里可憐他們。——盡管他們不知道，他們甚至在想：我倒要看看她到底有多大的定力？

用凝膠過濾HPLC分析逆相-HPLC中高ACE抑制率的洗脫峰。色譜柱為Superdex Peptide HR 10/30，流速為0.8 mL/min，測定波長為220 nm，用0.01% TFA作為移動相收集溶出的峰。收集ACE抑制率較高的峰在同樣條件下再次利用凝膠過濾HPLC進(jìn)行ACE抑制物質(zhì)的純化。

1.2.5 分子質(zhì)量測定方法

對凝膠過濾HPLC純化得到的峰進(jìn)行分子質(zhì)量測定。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：流動相為0.01% TFA，流速為0.8 mL/min。以已知分子質(zhì)量的胰島素A鏈蛋白（2 532 D）、放線菌素C（1 280 D）及致癌蛋白（586.70 D）為標(biāo)準(zhǔn)品，以已知分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)溶出時間為橫坐標(biāo)，蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y=-136.02x+4 066.70（R2=0.995 2）。將待測組分溶出時間代入回歸方程計(jì)算其分子質(zhì)量。

1.2.6 SSP溶液質(zhì)量濃度測定

用Bradford法［21］測定。取100 μL ACE抑制溶液，加1 mL Bradford試劑，振動攪拌后，放置5～30 min，用分光光度計(jì)在595 nm波長處測定吸光度。以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品，以牛血清白蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y=0.003 6x+ 0.004 6（R2=0.998 7）。將待測組分吸光度代入回歸方程計(jì)算其質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

16 株乳酸菌SSP溶液培養(yǎng)物的ACE抑制率結(jié)果如表2所示。S. thermophilus 2330M2、P. acidilactici ID7、E. faecalis TH15、L. delbrueckii subsp. bulgaricus 7235、L. casei 34143S、L. casei S-3-1、L. casei 6-2-05及L. plantarum 6214等8 株乳酸菌SSP溶液培養(yǎng)物的ACE抑制率為20%以上，其中菌株ID7、6214及TH15的ACE抑制率達(dá)到40%以上。E. faecium 220B1、L. helveticus 4024M2、Lactobacillus sp. 305501、L. delbrueckii subsp. bulgaricus M340-1、L. delbrueckii subsp. lactis D340-2的ACE抑制率為10%以下，幾乎沒有ACE抑制活性，這可能與這些乳酸菌的SSP溶液培養(yǎng)物pH值下降到4.0時，ACE抑制活性物質(zhì)在酸性環(huán)境下被破壞有關(guān)。該結(jié)果表明，不同乳酸菌SSP溶液培養(yǎng)物ACE抑制活性具有差異，而且，未接種乳酸菌的SSP溶液未檢測到ACE抑制活性，證明了乳酸菌SSP溶液培養(yǎng)物的ACE抑制物質(zhì)是乳酸菌分解SSP溶液而產(chǎn)生的乳酸菌代謝產(chǎn)物。

2.2 P. acidilactici ID7 SSP溶液培養(yǎng)物ACE抑制活性測定結(jié)果

對接種P. acidilactici ID7的SSP溶液培養(yǎng)物分別進(jìn)行乙醇可溶性成分和乙醇不可溶性成分回收，測定其ACE抑制活性，結(jié)果如表3所示。未檢測到乙醇不可溶性成分的ACE抑制活性，乙醇可溶性成分的IC50值為1.72 μg/mL，表明ACE抑制物在乙醇可溶性成分中，而且具有較高的ACE抑制活性，因此對乙醇可溶性成分進(jìn)行了ACE抑制多肽的分離。

2.3 P. acidilactici ID7 SSP溶液培養(yǎng)物乙醇可溶性成分逆相-HPLC分離及ACE抑制活性

將P. acidilactici ID7菌的SSP溶液培養(yǎng)物用95%乙醇進(jìn)行純化，對乙醇可溶性成分用逆相-HPLC進(jìn)行色譜分離，結(jié)果如圖1所示，獲得了2 個峰（峰Ⅰ、峰Ⅱ）。P. acidilactici ID7的SSP溶液培養(yǎng)物和空白對照組的色譜峰完全不一樣，說明隨著乳酸菌代謝活動，SSP溶液被分解產(chǎn)生新的多肽，而且所有的多肽溶出在30%以下乙腈中，測定其ACE抑制活性結(jié)果，峰Ⅰ、峰Ⅱ的IC50值分別為1.21、1.07 μg/mL，說明分離到較高的ACE抑制活性肽，峰Ⅰ、峰Ⅱ蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度分別為3.17、0.67 μg/mL，說明峰ⅡACE抑制活性更顯著。

2.4 凝膠過濾HPLC分離

對采用逆相-HPLC分離獲得的具有較高ACE抑制活性峰Ⅱ（IC50值為1.07 μg/mL）用凝膠過濾HPLC進(jìn)行色譜分析，結(jié)果如圖2所示，在21.30、43.72 min出現(xiàn)2 個峰（A和B），ACE 抑制率分別為3.33%、26.67%，說明ACE抑制活性物在峰B上。用已知分子質(zhì)量的胰島素A鏈蛋白（2 532 D）、放線菌素C（1 280 D）及致癌蛋白（586.70 D）的凝膠過濾HPLC檢量線推算出分子質(zhì)量，分別為1 170 D（峰A）、586.7 D以下（峰B）。將具有ACE抑制活性的峰B再次利用凝膠過濾HPLC進(jìn)行純化，獲得了單一的ACE抑制活性多肽的色譜（圖3）。已有報(bào)道證明，酸奶ACE抑制多肽（Ile-Pro-Pro，Val-Pro-Pro）［19］、發(fā)酵大豆食品Tofuyo的ACE抑制多肽（Ile-Phe-Leu，Tro-Leu）［17］及魚肉蛋白水解物的ACE抑制多肽（Met-Tyr，Lys-Trp，Arg-Val-Tyr）［22］對輕度高血壓患者具有降壓作用。因此，從P. acidilactici ID7菌代謝SSP溶液培養(yǎng)物中分離到的ACE抑制多肽可能與以上報(bào)道的一樣，具有較高的ACE抑制活性。

3 結(jié) 論

通過對16 株乳酸菌代謝SSP溶液培養(yǎng)物中ACE抑制活性的測定，獲得了具有較高ACE抑制活性的P. acidilactici ID7（ACE抑制率為47.6%）和L. plantarum 6214（ACE抑制率為40.6%）。從出現(xiàn)較高的ACE抑制活性的P. acidilactici ID7 SSP溶液培養(yǎng)物中進(jìn)行ACE抑制物分離，結(jié)果表明，ACE抑制物在乙醇可溶性成分中。用逆相-HPLC對乙醇可溶性成分進(jìn)行分離，收集到2 個ACE抑制活性峰（Ⅰ、Ⅱ）。對其中具有較高ACE抑制活性峰Ⅱ（IC50值為1.07 μg/mL）用凝膠過濾HPLC色譜進(jìn)行分離，得到了ACE抑制率為26.67%，分子質(zhì)量為586.7 D以下的ACE抑制多肽，說明乳酸菌能分解SSP溶液產(chǎn)生ACE抑制活性多肽。

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Separation and Determination of Angiotensin Converting Enzyme Inhibitory Peptide from Salt-Soluble Protein Solution Fermented with Lactic Acid Bacteria

ZHAO Junliang1， LU Haipeng1， MANG Lai2， JIN Shan1，*
（1. Key Laboratory of Clinical Diagnosis and Treatment Technology in Animal Disease， Ministry of Agriculture，College of Veterinary Medicine， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot 010018， China；2. College of Animal Science， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot 010018， China）

Sixteen lactic acid bacteria （LAB） strains were cultured for 3 generations in MRS liquid medium， centrifuged，prepared into LAB suspension with sterilized physiological saline， and then inoculated in salt-soluble protein （SSP） solution from arabesque greenling. Through determining angiotensin converting enzyme （ACE） inhibitory peptide from metabolites，Pediococcus acidilactici ID7 and Lactobacillus plantarum 6214 displayed high ACE inhibitory activity， with a percentage inhibition of 47.6% and 40.6%， respectively. Higher ACE inhibitory activity in SSP solution fermented with Pediococcus acidilactici ID7 was determined by high performance liquid chromatograph （HPLC）. Meanwhile， two peaks after HPLC purification were achieved， which showed IC50of 1.21 μg/mL and 1.07 μg/mL， respectively. The peak with higher ACE inhibitory activity was purified by gel filtration. The obtained ACE inhibitory peptide showed percentage inhibition of 26.67% and molecular weight less than 586.7 D.

lactic acid bacteria （LAB）； angiotensin converting enzyme （ACE）； salt-soluble protein （SSP）； high performance liquid chromatography （HPLC）

10.7506/spkx1002-6630-201609032

Q939.99

A

1002-6630（2016）09-0170-05

趙俊良， 盧海鵬， 芒來， 等. 乳酸菌鹽溶性蛋白培養(yǎng)物中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性肽的測定及分離［J］. 食品科學(xué)，2016， 37（9）： 170-174. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609032. http：//www.spkx.net.cn

ZHAO Junliang， LU Haipeng， MANG Lai， et al. Separation and determination of angiotensin converting enzyme inhibitory peptide from salt-soluble protein solution fermented with lactic acid bacteria［J］. Food Science， 2016， 37（9）： 170-174.（in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609032. http：//www.spkx.net.cn

2015-06-24

內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012MS0405）；國家國際科技合作專項(xiàng)（2011DFR30860）

趙俊良（1990—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)楂F醫(yī)微生物與免疫學(xué)。E-mail：13484711238@163.com

*通信作者：金山（1968—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)楂F醫(yī)微生物與免疫學(xué)。E-mail：jinshan@imau.edu.cn