馬 特，宋連寶，趙 輝

（黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150080）

白酒窖泥中蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選及復(fù)配

馬 特，宋連寶，趙 輝*

（黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150080）

從優(yōu)質(zhì)白酒窖泥中分離篩選出8 株高產(chǎn)蛋白酶的兼性厭氧細(xì)菌，通過測定內(nèi)肽酶、氨肽酶、羧肽酶酶活力，最終篩選出3 株3 種蛋白酶活力相對較高的菌株HDS4、HDS6、HDS8，并對其進(jìn)行形態(tài)觀察、生理生化和16S rDNA鑒定，確定3 株菌分別為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）。以接種量為基礎(chǔ)，對3 株目的菌株進(jìn)行復(fù)配，得到的復(fù)配菌系3 種蛋白酶活力均比單一菌株高，3 種酶活力分別提高了8.907%、6.181%、8.781%。

蛋白酶；窖泥；鑒定；篩選；白酒

白酒為中國特有的一種以高粱等谷物為原料，采用大曲、小曲或麩曲為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)過發(fā)酵、蒸餾、貯存勾兌而成的蒸餾酒[1]。窖泥是濃香型白酒釀造的基礎(chǔ)，是產(chǎn)生白酒中香味物質(zhì)的功能菌生長繁殖的載體[2]。窖泥中微生物的種類、數(shù)量、種群間的相互作用以及代謝的多樣性對白酒品質(zhì)具有重要影響[3]。窖泥中的微生物可催化原料進(jìn)行一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)，能分解淀粉、脂肪形成糖和氨基酸引發(fā)美拉德反應(yīng)，生成香型白酒獨特的風(fēng)味前驅(qū)物[4]。在白酒釀造過程中添加蛋白酶產(chǎn)生菌產(chǎn)生蛋白酶，通過對原料中蛋白質(zhì)的水解，不僅可以促進(jìn)微生物生長，而且還可形成白酒中醇類等風(fēng)味物質(zhì)，從而使酒體更加豐滿醇厚[5]。

1964年，Koaze等[6]首次發(fā)現(xiàn)大孢子黑曲霉突變體（Aspergillus niger v. Tiegh）能產(chǎn)生兩種不同的酸性蛋白酶，即酸性蛋白酶A和酸性蛋白酶B，可用于白酒固態(tài)發(fā)酵。陳飛等[7]從茅臺鎮(zhèn)醬香型白酒生產(chǎn)樣品中分離得到1 株白地霉（Geotrichum candidum），該菌株可應(yīng)用于白酒風(fēng)味的提升。Kumae等[8]從酒曲中分離得到一株產(chǎn)蛋白酶的芽孢桿菌，經(jīng)鑒定為枯草孢桿菌（Bacillus subtilis）。Kumar等[9]從大曲中分離得到一株芽孢桿菌，通過紫外誘變后，可產(chǎn)生較高的蛋白酶酶活力，發(fā)酵性能優(yōu)良。Sumantha等[10]從固態(tài)發(fā)酵米糠中得到一株產(chǎn)中性蛋白酶的小孢根霉（Rhizopus microsporus NRRL 3671），對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該菌株在60 ℃、pH 7.0時得到最大酶活力。Su等[11]從鹽堿地的土樣中，分離出一株新的曲霉（Aspergillus sp. FC-10），可產(chǎn)耐鹽蛋白酶。近幾年許多研究者分別從富含蛋白的土壤樣品、海洋泥中的土樣中，篩選出產(chǎn)蛋白酶的菌株，并對其進(jìn)行了鑒定[12-20]。

蛋白酶是催化水解蛋白質(zhì)肽鍵的一類酶的總稱[21]。按其水解多肽的方式，可以將其分為內(nèi)肽酶和外肽酶兩類[22]。內(nèi)肽酶將蛋白質(zhì)分子內(nèi)部切斷，形成分子質(zhì)量較小的肽[23]。外肽酶從蛋白質(zhì)分子的游離氨基或羧基的末端逐個將肽鍵水解，而游離出氨基酸，前者為氨肽酶[24]，后者為羧肽酶[25]。在白酒發(fā)酵過程中，3 種酶的協(xié)同作用，可以使原料中的蛋白質(zhì)水解更加充分，游離的氨基酸數(shù)量增加，從而提高原料的利用率，并生成白酒中醇類等香味物質(zhì)。

本實驗選取黑龍江省富裕老窖酒業(yè)有限公司的窖泥，利用5 點取樣法，從窖泥中分離、篩選高產(chǎn)蛋白酶（內(nèi)肽酶、氨肽酶、羧肽酶）的細(xì)菌，以期篩選3 種產(chǎn)蛋白酶活性均較高的菌株，并對篩選出的菌株進(jìn)行鑒定。將篩選出的高產(chǎn)3 種蛋白酶的細(xì)菌進(jìn)行菌株復(fù)配，以期提高3 種蛋白酶活力，從而更好地發(fā)揮協(xié)同作用，達(dá)到提高白酒發(fā)酵的原料利用率，促進(jìn)菌體生長和提高白酒香氣的作用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

從黑龍江省富裕老窖酒業(yè)有限公司的優(yōu)質(zhì)老窖池中取樣的窖泥。

DL2000DNA Marker、細(xì)菌基因組DNA試劑盒生工生物工程（上海）有限公司；脫脂奶粉 完達(dá)山乳業(yè)有限公司；酪蛋白 北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

分離和保藏培養(yǎng)基：脫脂奶粉10 g、可溶性淀粉10 g、KH2PO40.3 g、MgSO4g7H2O 0.5 g、NaCl 1 g、瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓滅菌20 min[26]。

發(fā)酵培養(yǎng)基：可溶性淀粉5 g、牛肉膏5 g、蛋白胨5 g、酵母膏2.5 g、KH2PO40.3 g、NaCl 1 g、MgSO4g7H2O 0.5 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓滅菌15 min[26]。

1.2 儀器與設(shè)備

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀德國Biometra公司；瓊脂糖凝膠電泳儀 美國Bio-Rad公司；UV755B紫外分光光度計、FA1004電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī) 美國日立公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

依據(jù)生態(tài)學(xué)原理，采用5 點法對酒廠的優(yōu)質(zhì)窖池中的窖泥進(jìn)行采集。取樣自上而下，按4 層分別采集，同一層面按中心部和周邊部5 點取樣，并混合均勻作為1 個樣品，在室溫下進(jìn)行采樣，記好標(biāo)記，無菌密封，4 ℃冰箱保存。

1.3.2 產(chǎn)蛋白酶菌株的初篩

稱取1 g窖泥加入到裝有99 mL滅菌分離培養(yǎng)基的三角燒瓶中，靜置培養(yǎng)24 h，吸取富集菌液0.5 mL，進(jìn)行不同濃度梯度稀釋，分別取0.1 mL涂布于分離培養(yǎng)基上，每個梯度做3 個平行樣，37 ℃倒置恒溫培養(yǎng)24 h，產(chǎn)透明圈的為目的菌株。根據(jù)其菌落形態(tài)不同進(jìn)行簡單歸類，并進(jìn)行純化保藏。

1.3.3 產(chǎn)蛋白酶菌株的復(fù)篩

測定初篩菌株的蛋白酶活力進(jìn)行復(fù)篩。用發(fā)酵培養(yǎng)基對目的菌株進(jìn)行培養(yǎng)，離心后取上清液分別測定內(nèi)肽酶、氨肽酶、羧肽酶的活力。

內(nèi)肽酶活力單位是指在38 ℃、pH 5.5條件下，1 min內(nèi)水解酪蛋白產(chǎn)生酪氨酸的酶量；氨肽酶活力單位是指在50 ℃、pH 5.5條件下，1 min內(nèi)水解酪蛋白產(chǎn)生酪氨酸的酶量；羧肽酶活力單位是指在30 ℃、pH 6.6條件下，1 min內(nèi)水解乙酰酪氨酸乙酯產(chǎn)生酪氨酸的酶量。3 種酶活力均采用紫外分光光度法測定[25,27-28]。

1.3.4 菌株形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定

參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》，對篩選出高產(chǎn)蛋白酶活力的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)描述和生理生化鑒定。生理生化鑒定包括：甲基紅（M.R.）實驗、吲哚實驗、脲酶實驗、乙酰甲醇（V.P.）實驗、明膠液化、檸檬酸鹽利用實驗、淀粉水解實驗、過氧化氫實驗、硝酸鹽還原實驗、葡萄糖氧化發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣實驗、糖/醇（D-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露醇）發(fā)酵產(chǎn)酸實驗等，每個實驗重復(fù)3 次[29-30]。

1.3.5 菌株16S rDNA鑒定

1.3.5.1 提取細(xì)菌基因組DNA

細(xì)菌基因組DNA提取使用生工生物工程（上海）股份有限公司細(xì)菌基因組DNA試劑盒。

16S rDNA通用引物設(shè)計如下：正向引物P1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物P2：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。

1.3.5.2 PCR反應(yīng)體系和程序

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：10hPCR Buffer（Mg2+）2.5 μL，dNTP Mixture 2 μL，P1 1 μL，P2 1 μL，DNA模板1 μL，去離子水17.3 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，共25 μL。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性0.5 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，循環(huán)32 次；72 ℃終延伸8 min，4 ℃保存。

1.3.5.3 目的片段與載體連接

用TaKaRa連接試劑盒將回收產(chǎn)物連接至pMD19-T載體上，4 ℃反應(yīng)過夜，利用Tiangen公司質(zhì)粒提取試劑盒將載體與DNA片段進(jìn)行連接，連接目的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，保存重組陽性克隆，并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.3.5.4 16S rDNA片段的測序與系統(tǒng)發(fā)育分析

將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測定。再將測序所得到的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對分析，通過MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.6 菌株復(fù)配的研究

1.3.6.1 菌株的生長曲線

將篩選出的高產(chǎn)3 種蛋白酶的菌株HDS4、HDS6、HDS8接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，每隔2 h在660 nm波長處測定菌液的光密度（OD660nm）值，繪制菌體24 h生長曲線，確定3 種菌株的最佳培養(yǎng)時間。

1.3.6.2 菌株復(fù)配

將篩選出的高產(chǎn)3 種蛋白酶的菌株HDS4、HDS6、HDS8進(jìn)行最適接種量試驗，并以最適接種量為基礎(chǔ)，利用發(fā)酵培養(yǎng)基，在37 ℃、pH 7.0、搖床轉(zhuǎn)速為140 r/min培養(yǎng)16 h，選擇HDS4的接種量為1%、2%、3%，HDS6的接種量為3%、4%、5%，HDS8的接種量為2%、3%、4%，以復(fù)配后的菌體濃度為試驗結(jié)果，做三因素三水平的正交試驗。

1.3.6.3 復(fù)配后3 種蛋白酶活力的比較

進(jìn)行復(fù)配菌體的生長與產(chǎn)酶實驗：在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種復(fù)配菌體，在37 ℃、pH 7.0、搖床轉(zhuǎn)速為140 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，每隔2 h取發(fā)酵液測定菌液的OD600nm值，同時離心后測定3 種蛋白酶活力，繪制菌體的生長和產(chǎn)酶曲線，以考察菌體生長與酶活力之間的關(guān)系。同時在培養(yǎng)16 h后對復(fù)配后菌系的3 種酶活力進(jìn)行測定，并進(jìn)行單一菌株在最佳接種量條件下培養(yǎng)16 h后的酶活力實驗，對復(fù)配體系及單菌株發(fā)酵的酶活力進(jìn)行對比。

1.4 菌體濃度的分析方法

將菌懸液梯度稀釋，利用平板菌落計數(shù)法測得菌落數(shù)，并運用比色法測定菌液的OD600nm值，根據(jù)單位體積菌落數(shù)與OD600nm值的相關(guān)性，從而回歸推算出菌液濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的分離篩選

初篩菌共46 株，根據(jù)3 種酶活力高低比較，選出8 株，酶活力見表1。菌株HDS6的內(nèi)肽酶活力、HDS4的氨肽酶活力和HDS8的羧肽酶活力相對較高，分別為104.516、84.269、72.538 U/mL。

表1 8 株菌的3 種蛋白酶活力比較Table 1 Comparison of three enzyme activities in 8 strains U/mL

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 菌株的形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定

對菌株HDS4、HDS6、HDS8進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和生理生化鑒定，結(jié)果見表2和表3，3 株菌可以初步鑒定為芽孢桿菌屬。

表2 3 株菌的形態(tài)特征Table 2 Morphological characteristics of three selected strains

表3 3 株菌的生理生化實驗結(jié)果Table 3 Physiological and biochemical properties of three selected strains

2.2.2 菌株的16S rDNA鑒定及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

圖1 16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳分析Fig.1 Electrophoresis analysis of 16S rDNA PCR amplified products

以菌株HDS4、HDS6、HDS8的基因組為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增，電泳檢測，在1 000～2 000 bp處有明亮的特征條帶，見圖1，序列的長度與測序的結(jié)果相符。

菌株HDS4、HDS6、HDS8的16S rDNA經(jīng)測序，其序列長分別為1 570、1 513、1 550 bp，與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對分析，利用DNAMAN軟件繪制菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和生理生化分析，可以確定菌株HDS4為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、HDS6為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、HDS8為蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）。

圖2 菌株HDS4（A）、HDS6（B）、HDS8（C）系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建Fig.2 Phylogenetic trees of strains HDS4 （A）， HDS6 （B） and HDS8 （C）

2.3 菌株的復(fù)配

2.3.1 3 株菌的生長曲線

將篩選出的高產(chǎn)3 種蛋白酶的菌株HDS4、HDS6、HDS8接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，由圖3可知，菌株HDS4的遲緩期為2～4 h，對數(shù)期為4～12 h，穩(wěn)定期12～16 h，衰亡期16～24 h；菌株HDS6的遲緩期為2～4 h，對數(shù)期為4～14 h，穩(wěn)定期14～18 h，衰亡期18～24 h；菌株HDS8的遲緩期為2～4 h，對數(shù)期為4～12 h，穩(wěn)定期12～16 h，衰亡期16～24 h，綜合3 株菌的生長曲線，確定復(fù)配菌系的培養(yǎng)時間為14～16 h。

圖3 3 株菌的生長曲線Fig.3 Growth curves of HDS4， HDS6 and HDS8

2.3.2 目的菌株的最適接種量

圖4 接種量對目的菌株HDS4（A）、HDS6（B）、HDS8（C）生長的影響Fig.4 Effect of inoculum amount on the growth of HDS4 （A）， HDS6 （B） and HDS8 （C）

如圖4所示，HDS4的最適接種量為2%，HDS6的最適接種量為4%，HDS8的最適接種量為3%，其各自的菌體濃度均達(dá)到最高。

2.3.3 目的菌株的復(fù)配

由表4可知，確定目的菌株的復(fù)配最優(yōu)組合為A2B2C3，即以接種量分別為2%的HDS4，4%的HDS6，4%的HDS8菌株進(jìn)行菌株的混合復(fù)配。表5方差分析表明，對試驗結(jié)果的影響順序依次為：HDS4＞HDS6＞HDS8，HDS4的F=8.7與F0.1(2,2)=9接近，對試驗結(jié)果影響較為顯著，HDS6、HDS8兩個因素對試驗結(jié)果影響不顯著。

表5 目的菌株復(fù)配正交試驗結(jié)果方差分析Table 5 Analysis of variance of orthogonal tests

2.4 復(fù)配后3 種蛋白酶活力的比較

2.4.1 復(fù)配菌體生長和產(chǎn)酶曲線的繪制

圖5 復(fù)合菌株生長和產(chǎn)酶曲線Fig.5 Growth and enzyme production curves of optimal mixed start culture

由圖5可知，復(fù)配菌株快速進(jìn)入對數(shù)期，自第16小時以后，菌體生長逐漸進(jìn)入穩(wěn)定期。此時該菌株產(chǎn)內(nèi)肽酶、氨肽酶、羧肽酶的酶活力最大值，說明產(chǎn)蛋白酶活力與菌體的生長成正相關(guān)，進(jìn)入對數(shù)期即開始產(chǎn)酶，而且酶活力不斷增加。當(dāng)進(jìn)入穩(wěn)定期以后，由于芽孢的生成，酶活力有所下降。

2.4.2 蛋白酶活力的對比

以接種量分別為2% HDS4、4% HDS6、4% HDS8菌株復(fù)配得到的復(fù)配菌株振蕩培養(yǎng)16 h，由表6可知，復(fù)配后的菌系內(nèi)肽酶、氨肽酶、羧肽酶酶活力分別為112.736、91.987、82.269 U/mL。同時進(jìn)行3 株單菌在最佳接種量（HDS4 2%、HDS6 4%、HDS8 3%）下的發(fā)酵產(chǎn)酶實驗，實驗結(jié)果如表6所示，復(fù)配菌株的3 種酶活力均高于單一菌株，較單一菌株的3 種酶活力最大值，內(nèi)肽酶、氨肽酶、羧肽酶分別提高了8.907%、6.181%、8.781%，說明復(fù)配結(jié)果有意義。同時與已報道[25,27,31-34]的菌株產(chǎn)內(nèi)肽酶酶活力62.538、147.322 U/mL，產(chǎn)氨肽酶酶活力102.347、23.825 U/mL，產(chǎn)羧肽酶酶活力86.535、117.523 U/mL相比，該復(fù)配體系3 種酶活力總體水平均較高。

表6 菌株復(fù)配前后蛋白酶活力的比較Table 6 Comparison of protease activities of HDS4， HDS6， HDS8 and their combination

3 結(jié) 論

本實驗從東北寒區(qū)優(yōu)質(zhì)白酒窖泥中篩選出內(nèi)肽酶、氨肽酶、羧肽酶活力均較高的菌株HDS4、HDS6、HDS8，并經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化和16S rDNA鑒定，確定菌株分別為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）。以接種量為基礎(chǔ)，以達(dá)到最大菌體濃度為目的，對目的菌株進(jìn)行復(fù)配，得到的復(fù)配菌系3 種酶活力較于單一菌株的3 種酶活力均得以提高，其分別提高了8.907%、6.181%、8.781%。

實驗菌株均來源于白酒窖泥，能適應(yīng)白酒發(fā)酵環(huán)境，若應(yīng)用于白酒發(fā)酵，在3 種蛋白酶的協(xié)同作用下，可以大幅度提高原料的利用率，為白酒發(fā)酵體系中多種微生物提供氨態(tài)氮，而且還可形成白酒中醇類等風(fēng)味物質(zhì)，從而使酒體豐滿醇厚，這對于白酒企業(yè)很有實際應(yīng)用價值。

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Screening of Protease-Producing Strains in Liquor Pit Mud and Mixed-Culture Fermentation for Enhanced Protease Production

MA Te, SONG Lianbao, ZHAO Hui*
(Agricultural Microbiology Engineering Research Center, Ministry of Education, College of Life Science, Heilongjiang University, Harbin 150080, China)

Eight strains of facultative anaerobic bacteria with higher capacity to produce protease were isolated and screened from high-quality liquor pit mud. Out of the 8 strains, 3 strains producing higher endopeptidase, aminopeptidase and carboxypeptidase activities including HDS4， HDS6 and HDS8 were selected and identified by morphological， physiological and biochemical properties and 16S rDNA sequence analysis as Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, and Bacillus thuringiensis. Mixed-culture fermentation with the 3 strains yielded an increase of 8.907%, 6.181% and 8.781% in endopeptidase, aminopeptidase and carboxypeptidase activities compared with single-culture fermentation, respectively.

protease； pit mud； identification； screening； liquor

10.7506/spkx1002-6630-201607027

Q815

A

1002-6630（2016）07-0146-06

馬特, 宋連寶, 趙輝. 白酒窖泥中蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選及復(fù)配[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(7): 146-151. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201607027. http://www.spkx.net.cn

MA Te, SONG Lianbao, ZHAO Hui. Screening of protease-producing strains in liquor pit mud and mixed-culture fermentation for enhanced protease production[J]. Food Science, 2016, 37(7): 146-151. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607027. http://www.spkx.net.cn

2015-04-18

黑龍江省博士后科研啟動基金項目（LBH-Q13139）

馬特（1989—），女，碩士研究生，研究方向為發(fā)酵工程。E-mail：835147262@qq.com

*通信作者：趙輝（1971—），男，副教授，博士，研究方向為發(fā)酵工程。E-mail：zhaohui9463@sohu.com