畢云楓，姜仁鳳，何 舒，任大勇，徐琳琳，沈明浩

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118）

D-乳糖醇代替異丙基-β-D-巰基半乳糖苷對重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的影響

畢云楓，姜仁鳳，何 舒，任大勇，徐琳琳，沈明浩*

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118）

目的：用D-乳糖醇代替異丙基-β-D-巰基半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）作為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)重組葡萄糖苷酶的表達(dá)。方法：首先通過單因素試驗(yàn)探討D-乳糖醇濃度、誘導(dǎo)時(shí)間及誘導(dǎo)溫度對重組葡萄糖苷酶表達(dá)的影響，從而確定最佳影響因素的水平值，然后在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用三因素三水平的響應(yīng)面法對重組葡萄糖苷酶表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化分析，依據(jù)回歸分析方法確定最佳誘導(dǎo)工藝條件。結(jié)果：最佳誘導(dǎo)工藝條件為D-乳糖醇的誘導(dǎo)終濃度1.0 mmol/L、誘導(dǎo)時(shí)間7.0 h、誘導(dǎo)溫度34 ℃。結(jié)論：D-乳糖醇可以代替IPTG作為一種高效的lac及其衍生物的啟動子基因工程重組蛋白的理想誘導(dǎo)劑。

α-葡萄糖苷酶；誘導(dǎo)；響應(yīng)面；D-乳糖醇

異丙基-β-D-巰基半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG），是一種高效的lac及其衍生物的啟動子誘導(dǎo)劑，是β-半乳糖苷酶的活性誘導(dǎo)物質(zhì)。它可以直接進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)部，發(fā)揮誘導(dǎo)作用，使蛋白構(gòu)象變化，導(dǎo)致阻遏蛋白與O序列解離、發(fā)生轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮誘導(dǎo)作用。IPTG是一種非代謝性的誘導(dǎo)物，不會被菌體所消耗，只需要極少量的存在就能穩(wěn)定地誘導(dǎo)乳糖啟動子的轉(zhuǎn)錄[1]。但其具有潛在的毒性，對菌體生長有一定的抑制作用，且價(jià)格較昂貴[2-3]。而乳糖是一種二糖，沒有毒性，具有天然誘導(dǎo)乳糖操縱子的作用，但乳糖本身作為一種碳源可以被菌體代謝利用，因此需要不斷地向培養(yǎng)基中加入乳糖，因而對于菌體的生理及代謝也有一定程度的影響[4]。另外，乳糖需要借助于乳糖透過酶（permase）的作用進(jìn)入細(xì)胞，然后經(jīng)過β-半乳糖苷酶的作用轉(zhuǎn)化為異乳糖（allolactose）才能起到誘導(dǎo)劑的作用[5]。同IPTG相比，乳糖作為誘導(dǎo)劑對于乳糖操縱子的誘導(dǎo)調(diào)控過程更為復(fù)雜[6-7]。雖然乳糖誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)的應(yīng)用研究有較多報(bào)道[8-10]，但很多都表明乳糖誘導(dǎo)效果不及IPTG。所以李攀峰等[11]在2014年進(jìn)一步研究了IPTG與乳糖聯(lián)合誘導(dǎo)表達(dá)的優(yōu)化，但誘導(dǎo)表達(dá)效果也不及單獨(dú)使用IPTG誘導(dǎo)。目前國內(nèi)外對重組菌誘導(dǎo)劑研究最多的也只有IPTG和乳糖[12-15]，而它們本身及在誘導(dǎo)過程中存在很多缺點(diǎn)，因此，尋找一種更適宜的替代物非常有必要。

由于D-乳糖醇（4-O-β-D-吡喃半乳糖基-D-葡糖醇）化學(xué)結(jié)構(gòu)與IPTG相似，極易溶于水，微溶于乙醇，同時(shí)穩(wěn)定性較強(qiáng)，在酸、堿、光照及高溫條件下仍能保持穩(wěn)定性，安全性較高，當(dāng)前作為一種食品添加劑應(yīng)用于食品工業(yè)；其次，價(jià)格便宜、來源廣泛。所以本研究以D-乳糖醇為誘導(dǎo)劑來誘導(dǎo)重組α-葡萄糖苷酶的表達(dá)。響應(yīng)面分析法由Box及其合作者于20世紀(jì)50年代提出并逐步完善，它以回歸方程作為函數(shù)估算的工具，將多因子試驗(yàn)中因素與試驗(yàn)結(jié)果的關(guān)系用多項(xiàng)式擬合，將因子與實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)系函數(shù)化[16-18]，因此，本研究將探討各因子與響應(yīng)面值之間、因子與因子之間的相互關(guān)系，并進(jìn)行優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)將利用α-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌中進(jìn)行體外表達(dá)后的重組酶，研究通過D-乳糖醇作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)α-葡萄糖苷酶在大腸桿菌中的高效表達(dá)，并利用響應(yīng)面法對D-乳糖醇誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 菌種

按文獻(xiàn)[19]的方法將新阿波羅棲熱袍菌（Thermotoga neapolitana DSM 4359）α-葡萄糖苷酶基因（注冊號為lcl2740）連接到pET-28a（+）質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21（DE3），－80 ℃凍存。此工程菌為卡那霉素抗性。

1.2 試劑與儀器

胰蛋白胨（tryptone）和酵母提取物（yeast extract）英國Oxoid公司；硫酸卡那霉素（Kan） 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖測定試劑盒 上海榮盛生物藥業(yè)有限公司；海藻糖 美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

JYP2-II超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；島津1800紫外分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.3 LB培養(yǎng)基的制備

LB液體培養(yǎng)基的配制：胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L，用1 mmol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0，于121 ℃滅菌20 min后備用。LB固體培養(yǎng)基的制備：在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入2 g/100 mL的瓊脂，于121 ℃滅菌20 min后，倒入平板。

1.4 菌種的活化及擴(kuò)培

取保存于－80 ℃的工程菌在LB固體培養(yǎng)基劃線，37 ℃恒溫箱過夜培養(yǎng)。然后取活化的工程菌，挑取單菌落于液體培養(yǎng)基中，200 r/min、37 ℃過夜振蕩培養(yǎng)。

1.5 工程菌的生長曲線

用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)工程菌，每隔1 h取樣用分光光度法測定菌體生長的OD600nm值。以工程菌菌液培養(yǎng)的時(shí)間為橫坐標(biāo)，以各時(shí)間點(diǎn)所測得菌液平均OD600nm值為縱坐標(biāo)，繪制工程菌的生長曲線。

1.6 D-乳糖醇誘導(dǎo)表達(dá)

1.6.1 工程菌最適誘導(dǎo)濃度的確定

在工程菌生長的菌液OD600nm值為0.4～0.6時(shí)，分別加入不同濃度的D-乳糖醇，使其終濃度分別達(dá)到0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mmol/L，然后在32 ℃振蕩培養(yǎng)，誘導(dǎo)6 h。通過相對酶活力的測定，確定最適的誘導(dǎo)濃度。

1.6.2 最適誘導(dǎo)時(shí)間的確定

在工程菌生長的菌液OD600nm值達(dá)到0.4～0.6時(shí)，加入最適濃度的誘導(dǎo)物，在32 ℃分別誘導(dǎo)培養(yǎng)4、5、6、7、8 h。通過相對酶活力的測定，確定最適的誘導(dǎo)時(shí)間。

1.6.3 最適誘導(dǎo)溫度的確定

在工程菌生長的菌液OD600nm值達(dá)到0.4～0.6時(shí)，加入最適誘導(dǎo)物，在最適的誘導(dǎo)時(shí)間下，分別在30、32、34、36、38 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)。通過相對酶活力的測定，確定最適的誘導(dǎo)溫度。以上測定值都做3 個(gè)平行樣。

1.6.4 α-葡萄糖苷酶的提取及活力測定

誘導(dǎo)后的菌液經(jīng)7 000hg離心5 min，取離心后菌體沉淀3～4 次反復(fù)凍融后，用pH 5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液溶解并超聲波破碎，然后經(jīng)12 000hg離心機(jī)離心取上清液，得粗酶液。酶活力測定的反應(yīng)體系為：60 μL pH 5.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液、20 μL終濃度為5 mmol/L海藻糖為底物和20 μL粗酶液均勻混合，60 ℃水浴2 h。依據(jù)葡萄糖測定試劑盒測酶活力，計(jì)算相對酶活力。酶活力單位定義：在上述條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需要的酶量。相對酶活力是與最大酶活力的比值，并定義最大酶活力為100%。

1.7 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用Design-Expert統(tǒng)計(jì)軟件，以誘導(dǎo)劑D-乳糖醇濃度（A）、誘導(dǎo)時(shí)間（B）、誘導(dǎo)溫度（C）為主要考察因素，相對酶活力為響應(yīng)值（Y），進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)分析。

1.8 D-乳糖醇與IPTG誘導(dǎo)表達(dá)[20-21]

在工程菌生長的菌液OD600nm值達(dá)到0.4～0.6時(shí)，分別加入最適誘導(dǎo)濃度1.0 mmol/L的D-乳糖醇在34 ℃條件下誘導(dǎo)7 h，和0.8 mmol/L的IPTG在30 ℃誘導(dǎo)4 h，誘導(dǎo)重組α-葡萄糖苷酶的表達(dá)。

2 結(jié)果與分析

2.1 工程菌的生長曲線

圖1 工程菌生長曲線Fig.1 Growth curve of the engineered strain

由圖1可知，工程菌在0～2 h為遲緩期，工程菌適應(yīng)新環(huán)境，生長速率緩慢；3～6 h為對數(shù)生長時(shí)期，此時(shí)營養(yǎng)物質(zhì)較充分，工程菌呈對數(shù)快速增長；7～9 h為穩(wěn)定期，由于培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)不斷地被消耗，工程菌新陳代謝產(chǎn)生的毒性物質(zhì)的積累等因素的影響，工程菌生長速率逐漸下降，而死亡的細(xì)菌開始逐漸增加，增殖數(shù)與死亡數(shù)漸漸趨于平衡，細(xì)菌總數(shù)處于穩(wěn)定狀態(tài)；10 h后為衰亡期，營養(yǎng)物質(zhì)減少，衰亡速率超過增長速率，細(xì)菌總數(shù)呈下降趨勢。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖2D-乳糖醇濃度對α-葡萄糖苷酶活力的影響Fig.2 Effect of lactitol concentration on α-glucosidase activity

由圖2可知，在D-乳糖醇在0.4～1.0 mmol/L濃度范圍內(nèi)，相對酶活力隨濃度的增加而不斷升高，1.0 mmol/L時(shí)相對酶活力最大，所以確定最佳誘導(dǎo)濃度為1.0 mmol/L。當(dāng)濃度繼續(xù)增大時(shí)，相對酶活力反而下降。說明工程菌對D-乳糖醇的誘導(dǎo)效應(yīng)是十分敏感的，較低的濃度即能啟動目的基因高效的表達(dá)，而高濃度反而抑制酶的表達(dá)。

圖3 誘導(dǎo)時(shí)間對α-葡萄糖苷酶活力的影響Fig.3 Effect of induction time on α-glucosidase activity

由圖3可知，誘導(dǎo)時(shí)間在4～7 h范圍內(nèi)，相對酶活力隨時(shí)間的延長而不斷增加，7 h時(shí)相對酶活力最大，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間繼續(xù)增加時(shí)，相對酶活力卻下降。由于誘導(dǎo)時(shí)間越長目的基因的表達(dá)量越多，就越容易形成包涵體[22]，從而導(dǎo)致相對酶活力下降。故選擇7 h為最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

圖4 誘導(dǎo)溫度對α-葡萄糖苷酶活力的影響Fig.4 Effect of induction temperature on α-glucosidase activity

由圖4可知，誘導(dǎo)溫度在30～34 ℃范圍內(nèi)，相對酶活力隨溫度的增加而不斷增加，34 ℃時(shí)相對酶活力最大，當(dāng)溫度繼續(xù)增加時(shí)，相對酶活力急劇下降。誘導(dǎo)溫度為34 ℃時(shí)目的基因表達(dá)量最高。這是由于溫度較低時(shí)，菌體生長速率和反應(yīng)速率較慢，從而增加外源蛋白的正確組裝和折疊，更多地形成可溶性的、有活性的產(chǎn)物[23]。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，根據(jù)三因素三水平方式分別進(jìn)行17 組試驗(yàn)，其中12 個(gè)為析因試驗(yàn)，5 個(gè)為中心試驗(yàn)以估計(jì)誤差。結(jié)果見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 Experimental design and results for response surface analysis

根據(jù)表1中Box-Behnken設(shè)計(jì)的試驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用Design-Expert軟件對表中結(jié)果進(jìn)行二次回歸分析，得到二次回歸方程：Y=－263.488+107.333A+4.065B+16.063C+0.542AB－0.218AC+0.175BC－47.169A2－1.024B2－0.228C2。

回歸方程二次項(xiàng)A2、B2、C2的系數(shù)均為負(fù)數(shù)，說明回歸方程存在穩(wěn)定點(diǎn)，即最大值點(diǎn)?；貧w方程的分析結(jié)果和回歸方程方差分析結(jié)果分別見表2、3。

表2 回歸模型分析結(jié)果Table 2 Significance test of all coefficients in regression model

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

由表2、3可知，模型P＜0.000 1，表明回歸模型極顯著。方程中除AB、AC、BC交互項(xiàng)不顯著外，C為顯著，其他各項(xiàng)對Y相對酶活力影響都是極顯著。分析結(jié)果同時(shí)也表明試驗(yàn)因素對響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系，二次項(xiàng)對響應(yīng)值也有很大的影響[24-26]。模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.964 6，表明96.46%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可用該模型進(jìn)行解釋，說明方程擬合較好，可靠性較高。變異系數(shù)值越低，顯示實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性越好，本實(shí)驗(yàn)變異系數(shù)達(dá)到0.33%，較低，說明試驗(yàn)點(diǎn)數(shù)據(jù)的這種擬合方法合理、可靠。

2.4 響應(yīng)面各因素間的交互作用

根據(jù)表2的回歸模型分析可知，3 個(gè)因素對酶活力均具有顯著影響。在保持1 個(gè)因素為最優(yōu)條件下，其他2 個(gè)因素與響應(yīng)值關(guān)系用三維坐標(biāo)圖表示，可以直觀反映各因素對響應(yīng)值的影響關(guān)系，見圖5。

圖5 各因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Contour and response surface plots for the interactive effect of three factors on α-glucosidase activity

圖5 直觀地給出了各個(gè)因素交互作用的響應(yīng)面和等高線分析圖，其中各圖表示A、B、C中任意一個(gè)變量取零水平時(shí)，其余兩個(gè)變量對酶活力的交互影響，從響應(yīng)面的最高點(diǎn)和等高線可以看出，在所選的范圍內(nèi)存在極值，既是響應(yīng)面的最高點(diǎn)，同時(shí)也是等值線最小橢圓的中心點(diǎn)[27-29]。圖5a表明，A、B的交互作用較強(qiáng)，實(shí)際值較大的A和B，反而使得響應(yīng)值相對酶活力有減小的趨勢，可能由于時(shí)間長導(dǎo)致目的基因蛋白形成較多的包涵體。當(dāng)誘導(dǎo)劑D-乳糖醇濃度在0.8～1.2 mmol/L、誘導(dǎo)時(shí)間在6～8 h時(shí)，隨著D-乳糖醇濃度和誘導(dǎo)時(shí)間的增加，相對酶活力不斷增加，D-乳糖醇濃度高于1.0 mmol/L，時(shí)間高于7 h時(shí)相對酶活力下降。圖5b表明，AC的交互作用在因素B實(shí)際值為7 h以上時(shí)較強(qiáng)，也表現(xiàn)出與圖5a相同的現(xiàn)象。當(dāng)D-乳糖醇濃度在0.8～1.2 mmol/L、誘導(dǎo)溫度在32～36 ℃時(shí)，隨著D-乳糖醇濃度和誘導(dǎo)溫度的增加，相對酶活力不斷增加，D-乳糖醇濃度高于1.0 mmol/L、誘導(dǎo)溫度高于34 ℃時(shí)，相對酶活力開始下降。圖5c表明，BC的交互作用不大，在因素B實(shí)際值為7 h以上因素C很大的范圍內(nèi)都能夠得到較大的響應(yīng)值，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間在6～8 h、誘導(dǎo)溫度在32～36 ℃時(shí)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)溫度的不斷增加，相對酶活力不斷增加，誘導(dǎo)時(shí)間高于7 h，誘導(dǎo)溫度高于34 ℃時(shí)，相對酶活力開始下降。所以從響應(yīng)面圖和等高線分析圖可以確定其最佳D-乳糖醇濃度為1.0 mmol/L、誘導(dǎo)時(shí)間為7 h、誘導(dǎo)溫度為34 ℃。

2.5 D-乳糖醇與IPTG誘導(dǎo)表達(dá)效果比較

圖6 IPTG與D-乳糖醇對α-葡萄糖苷酶活力的影響效果比較Fig.6 Effect of IPTG versus D-lactitol on α-glucosidase activity

圖6 為IPTG和D-乳糖醇在最優(yōu)表達(dá)條件（D-乳糖醇誘導(dǎo)濃度為1.0 mmol/L、誘導(dǎo)時(shí)間為7 h、誘導(dǎo)溫度為34 ℃）下的蛋白表達(dá)結(jié)果，在相同的酶液終體積下，D-乳糖醇為誘導(dǎo)劑所誘導(dǎo)的葡萄糖苷酶為IPTG最佳條件下誘導(dǎo)后的相對酶活力的99.13%，相差極其微小，經(jīng)方差分析|t|=0.369 0＜t0.05（4）=2.776，說明用D-乳糖醇做誘導(dǎo)劑與IPTG做誘導(dǎo)劑無顯著性差異，所以可以用D-乳糖醇替代IPTG做重組蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)劑。

3 結(jié) 論

乳糖操縱子作為一種可誘導(dǎo)的負(fù)調(diào)控型操縱子，是目前研究的最為詳盡的基因操縱子，已被廣泛應(yīng)用于大腸桿菌工程菌株的構(gòu)建中。IPTG和乳糖是文獻(xiàn)報(bào)道最多的誘導(dǎo)劑。其中IPTG誘導(dǎo)條件簡單，在大腸桿菌中不被代謝和降解，效果持久穩(wěn)定。但I(xiàn)PTG存在潛在的毒性且價(jià)格昂貴，因而只作為實(shí)驗(yàn)室少量蛋白表達(dá)時(shí)的誘導(dǎo)劑[30]；乳糖作為原核細(xì)胞的常用碳源，是乳糖操縱子控制細(xì)菌自身系列酶的天然底物，對乳糖操縱子具有天然的誘導(dǎo)作用，且價(jià)廉易得、無毒無害；但由于乳糖可以被細(xì)胞作為碳源代謝利用，誘導(dǎo)過程需要多次添加，操作麻煩，誘導(dǎo)效果不及IPTG，且誘導(dǎo)機(jī)制比IPTG更為復(fù)雜，誘導(dǎo)條件不易掌握，需要對菌體生長及誘導(dǎo)條件進(jìn)行更為精細(xì)的研究及優(yōu)化[31]。

本實(shí)驗(yàn)通過響應(yīng)面法優(yōu)化了D-乳糖醇誘導(dǎo)重組α-葡萄糖苷酶的表達(dá)條件。得到重組α-葡萄糖苷酶的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為：誘導(dǎo)劑D-乳糖醇濃度1.0 mmol/L、誘導(dǎo)時(shí)間7 h、誘導(dǎo)溫度34 ℃。在最適條件下，通過比較D-乳糖醇與IPTG對重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)酶的誘導(dǎo)量幾乎無差異。D-乳糖醇與IPTG的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，且無毒無害，價(jià)廉易得，不被菌體所降解，誘導(dǎo)過程簡便易行。所以D-乳糖醇完全可以代替IPTG作為lac及其衍生物的啟動子誘導(dǎo)劑。對于各種利用原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行重組蛋白的實(shí)驗(yàn)研究及大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，均具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價(jià)值。

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D-Lactitol as a Substitute for Isopropyl-β-D-Thiogalactoside to Induce Recombinant Protein Expression

BI Yunfeng, JIANG Renfeng, HE Shu, REN Dayong, XU Linlin, SHEN Minghao*
(College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Objective: To induce the expression of recombinant glycosidase using D-lactitol instead of isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG). Methods: Single-factor experiments were performed to discuss the effect of D-lactitol concentration, induction time and temperature on the expression of recombinant glucosidase and consequently select three appropriate levels for each of the three variables. Subsequently, the levels of these variables were optimized by regression analysis and response surface methodology. Results: The optimal induction conditions were determined to be induction at 34 ℃ for 7.0 h with 1.0 mmol/L lactitol. Conclusion: D-Lactitol can replace IPTG as an ideal inducer for the production of recombinant proteins in genetically engineered strains with the efficient promoter of lac and its derivatives.

α-glucosidase; induction; response surface methodology; D-lactitol

10.7506/spkx1002-6630-201607024

Q786

A

1002-6630（2016）07-0128-06

畢云楓, 姜仁鳳, 何舒, 等. D-乳糖醇代替異丙基-β-D-巰基半乳糖苷對重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的影響[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(7): 128-133. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607024. http://www.spkx.net.cn

BI Yunfeng, JIANG Renfeng, HE Shu, et al. D-Lactitol as a substitute for isopropyl-β-D-thiogalactoside to induce recombinant protein expression[J]. Food Science, 2016, 37(7): 128-133. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607024. http://www.spkx.net.cn

2015-06-22

吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（吉教科合字[2015]第207號）

畢云楓（1976—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称访笇W(xué)。E-mail：yunfeng5609@sohu.com

*通信作者：沈明浩（1963—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全評價(jià)。E-mail：shenmh2003@163.com