謝全靈，張怡評，陳暉，洪專，陳偉珠，方華

（國家海洋局第三海洋研究所，福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建廈門 361005）

章魚肉堿標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制＊

謝全靈，張怡評，陳暉，洪專，陳偉珠，方華

（國家海洋局第三海洋研究所，福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，福建廈門 361005）

研制了章魚肉堿標(biāo)準(zhǔn)樣品。以章魚加工副產(chǎn)物為原料，通過提取、分離純化制備高純章魚肉堿，采用紅外光譜（IR）、高分辨質(zhì)譜（MS）和核磁共振譜（NMR）進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。樣品分裝成144瓶，采用離子色譜檢測法進(jìn)行均勻性、穩(wěn)定性檢驗和定值分析。從樣品中隨機(jī)抽取15瓶進(jìn)行均勻性檢驗，經(jīng)F檢驗表明：在95%的置信區(qū)間內(nèi)樣品均勻性良好。在0～4℃條件下，經(jīng)過24個月長期試驗穩(wěn)定性考察，結(jié)果表明樣品穩(wěn)定性良好。標(biāo)準(zhǔn)樣品經(jīng)國內(nèi)8家具有分析資質(zhì)的實驗室進(jìn)行協(xié)同定值，章魚肉堿標(biāo)準(zhǔn)樣品定值結(jié)果為99.49%，相對擴(kuò)展不確定度為0.14%（k=1.96）。該標(biāo)準(zhǔn)樣品達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)樣品的技術(shù)要求，可用于章魚肉堿相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制和分析方法校正。

章魚肉堿標(biāo)準(zhǔn)樣品；均勻性；穩(wěn)定性；定值；不確定度

章魚肉堿（Octopine）又名章魚堿，在自然界中主要存在于章魚、烏賊、魷魚、扇貝等海產(chǎn)軟體動物中，由精氨酸與丙氨酸或丙酮酸在酶的作用下縮合而成，具有重要的生物活性功能［1-3］。研究發(fā)現(xiàn)，章魚肉堿是導(dǎo)致章魚、扇貝等味道鮮美的原因之一；章魚肉堿有助于降低小鼠血液中總膽固醇和VLDL，LDL膽固醇的水平，同時增加小鼠血液中HDL膽固醇水平［4］；對比研究揭示喂食章魚肉堿可顯著提高小白鼠的交尾次數(shù)及妊娠概率［5］。此外，章魚肉堿還是一種表征品質(zhì)和新鮮度的指示劑［6-7］，可以應(yīng)用于食品質(zhì)量監(jiān)控及安全等方面。目前，國內(nèi)外未見章魚肉堿標(biāo)準(zhǔn)樣品研制的報道。筆者以章魚加工副產(chǎn)物為原料，通過提取、分離純化獲得高純章魚肉堿單體，研制了標(biāo)準(zhǔn)樣品，為深入開展相關(guān)研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1　實驗部分

1.1主要儀器與試劑

離子色譜儀：Dionex ICS-3000型，配備積分脈沖安培檢測器，美國Dionex公司；

紅外光譜儀：Bruker VERTEX 70型，美國Bruker公司；

高分辨質(zhì)譜儀：Q-Tof micro 型，美國Waters公司；

核磁共振儀：Bruker 400 MHz型，美國Bruker公司；

天平：AL/104型，瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)；鹽酸、醋酸鈉、氫氧化鈉：分析純；實驗用水來自Milli-Q純水系統(tǒng)。

1.2章魚肉堿樣品的制備

以章魚加工副產(chǎn)物為原料，經(jīng)浸提、膜分離等步驟后獲得粗品，再采用色譜分離、濃縮、干燥等精制方法獲得純度不小于99%的章魚肉堿［8］。

1.3定性與定值分析

采用紅外吸收光譜、高分辨質(zhì)譜及核磁共振譜等對章魚肉堿標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行定性分析。采用離子色譜法對章魚肉堿樣品定值檢測。

1.4色譜條件

色譜柱：Dionex AminoPac PA-10柱（250 mm×2 mm，10 μm，美國Dionex公司）；柱流量：0.24 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：25 μL；流動相：A為水，B為250 mmol/L NaOH溶液，C為1.0 mol/L NaOAc，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1　梯度洗脫程序

1.5樣品溶液配制

打開章魚肉堿樣品瓶蓋子后，精密稱取章魚肉堿適量，用超純水配制成章魚肉堿質(zhì)量濃度約為8 μg/mL的溶液，按照1.4色譜條件進(jìn)行純度檢測，每個樣品重復(fù)進(jìn)樣3次。

1.6均勻性檢驗

按照GB/T 15000.3-2008［9］規(guī)定，本項目確定抽樣數(shù)目為15個，采用單因素多水平試驗方差分析法對章魚肉堿標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行純度均勻性檢驗，測定方法采用上述的離子色譜檢測法，每個樣品重復(fù)測3次。檢測數(shù)據(jù)用方差分析法進(jìn)行分析以判斷標(biāo)準(zhǔn)樣品的均勻性是否合格。

1.7穩(wěn)定性檢驗

為了考察樣品的穩(wěn)定性，確定其有效期，取本標(biāo)準(zhǔn)樣品模擬上市包裝，進(jìn)行0～4℃條件下的24個月長期試驗，分別于0，3，6，9，12，18，24個月末取樣檢測，通過考察標(biāo)準(zhǔn)樣品純度的變化來研究樣品的穩(wěn)定性。采用上述離子色譜檢測法，每份樣品連續(xù)進(jìn)樣2次，然后用歸一法求出其純度的平均值。

2　結(jié)果與討論

2.1章魚肉堿的定性分析

章魚肉堿通過紅外光譜、高分辨質(zhì)譜及核磁共振譜進(jìn)行定性分析。

2.1.1章魚肉堿的紅外光譜分析

將章魚肉堿與溴化鉀干燥后研勻，壓片后放入紅外光譜儀進(jìn)行掃描，獲得相應(yīng)紅外光譜數(shù)據(jù)見表2。表2詳細(xì)列出了樣品的紅外光譜數(shù)據(jù)及歸屬。其中3 399，3 181，3 013 cm-1為羧基和胺基的伸縮振動；2 835，1 360 cm-1為亞甲基的伸縮振動和彎曲振動；1 687，1 631 cm-1為胍基的碳氮雙鍵伸縮振動和—NH2的彎曲振動。

表2　章魚肉堿紅外光譜數(shù)據(jù)

2.1.2章魚肉堿的高分辨質(zhì)譜分析

高分辨質(zhì)譜測得章魚肉堿加氫離子精確質(zhì)量數(shù)為247.140 1，與理論值（247.140 0）相符。

2.1.3章魚肉堿的核磁共振譜分析

對該樣品進(jìn)行NMR測試，核磁數(shù)據(jù)見表3，與文獻(xiàn)［10］報道的章魚肉堿1H NMR和13C NMR圖譜等數(shù)據(jù)一致。從樣品的紅外光譜、高分辨質(zhì)譜和NMR譜證明了所研制的樣品是章魚肉堿，結(jié)構(gòu)式見圖1。

表3　章魚肉堿的1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)（D2O）

圖1　章魚肉堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

2.2章魚肉堿的定量分析方法選擇

章魚肉堿的檢測方法有高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳分析、酶技術(shù)測定等，其中高效液相色譜法是最常用的一種方法。章魚肉堿屬于胍類化合物，存在極性大、紫外末端吸收等特點，此類化合物的定量檢測常用柱前或柱后衍生高效液相色譜法［11-13］。由于章魚肉堿含有氨基和羧基，可采用1，2-萘醌-4-磺酸鈉、二苯乙醇酮［14］及茚三酮［15］作為衍生試劑，通過衍生化方法提高反相高效液相色譜法的準(zhǔn)確度、靈敏度。目前，章魚肉堿的檢測方法尚無統(tǒng)一的國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。離子色譜具有靈敏度高、分離度高、無需衍生化等優(yōu)點，因此采用離子色譜對章魚肉堿樣品定值。

2.3均勻性試驗

標(biāo)準(zhǔn)樣品的均勻性檢驗是標(biāo)準(zhǔn)樣品研制過程中不可缺少的程序，因此在對樣品進(jìn)行分裝后，對章魚肉堿標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行純度均勻性檢驗，均勻性檢驗結(jié)果見表4與表5。

表4　章魚肉堿標(biāo)準(zhǔn)品純度均勻性檢驗結(jié)果

表5　方差分析的結(jié)果

統(tǒng)計量F=MSamong/MSwithin=6.278×10-7/ 3.107×10-7=2.02，F(xiàn)（0.05，14，30）=2.04，F(xiàn)＜F（0.05，14，30），說明在95%的置信區(qū)間內(nèi)，章魚肉堿樣品均勻性良好。

2.4穩(wěn)定性試驗

取本標(biāo)準(zhǔn)樣品，模擬上市包裝，在溫度為0～4℃的條件下放置24個月，分別于0，3，6，9，12，18，24個月取樣，按穩(wěn)定性重點考察項目檢測，試驗結(jié)果見表6。根據(jù)GB/T 15000-2008《標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則（3）標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計方法》的要求，采用直線模型作為經(jīng)驗?zāi)Ｐ?，對長期穩(wěn)定性獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

表6　章魚肉堿樣品在0～4℃儲存條件下的穩(wěn)定性

斜率：

直線上的點的標(biāo)準(zhǔn)偏差：

取其平方根s=0.0386135%，與斜率相關(guān)的不確定度：

自由度為n-2和P=0.95（95%置信水平），t0.95，n-2=2.571，t0.95，n-2s（b1）=2.571×0.001 863%= 0.004 790%，由于斜率，故斜率是不顯著的，因而未觀測到不穩(wěn)定性。

長期穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明，章魚肉堿標(biāo)準(zhǔn)樣品在0～4℃冷藏條件下保存24個月穩(wěn)定性良好，所以樣品的有效期可定為2年。

2.5定值結(jié)果及其不確定度評定

2.5.1定值結(jié)果

本標(biāo)準(zhǔn)樣品按照GB/T 15000.3-2008標(biāo)準(zhǔn)要求，采用多個實驗室協(xié)作定值，選擇獲得國家或部門認(rèn)可的，具備資質(zhì)的8家實驗室進(jìn)行樣品定值。隨機(jī)抽取8瓶樣品，每個定值實驗室送1瓶，采用上述的離子色譜檢測法進(jìn)行測定，應(yīng)用面積歸一法進(jìn)行定值，定值結(jié)果見表7。

表7　定值結(jié)果匯總表

2.5.2定值結(jié)果的不確定度評定

根據(jù)GB/T 15000.3-2008標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，定值結(jié)果由標(biāo)準(zhǔn)值和不確定度組成。標(biāo)準(zhǔn)樣品特性標(biāo)準(zhǔn)值的測量不確定度UCRM由標(biāo)準(zhǔn)值定值試驗的不確定度uchar、均勻性檢驗的不確定度ub和穩(wěn)定性檢驗的不確定度ults組成。依據(jù)全部測定結(jié)果，計算章魚肉堿標(biāo)準(zhǔn)樣品的特性標(biāo)準(zhǔn)值和不確定度。

（1）標(biāo)準(zhǔn)值定值試驗的不確定度：uchar=0.02%。

（2）均勻性檢驗的不確定度ubb。

瓶間方差：

式中的MSamong，MSwithin來自表5。

瓶間標(biāo)準(zhǔn)偏差是該方差的平方根：

（3）穩(wěn)定性檢驗的不確定度ults

由2.3穩(wěn)定性檢驗試驗可知：

標(biāo)準(zhǔn)樣品定值結(jié)果的不確定度：

擴(kuò)展不確定度U95=ku=1.96×0.07%=0.14%。

通過統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)處理，章魚肉堿標(biāo)準(zhǔn)樣品的特性值定值結(jié)果為99.49%，置信度為95%的擴(kuò)展不確定度為0.14%。

3　結(jié)語

研制了章魚肉堿標(biāo)準(zhǔn)樣品，對其進(jìn)行了均勻性檢驗、穩(wěn)定性考察，考察結(jié)果表明該標(biāo)準(zhǔn)樣品符合標(biāo)準(zhǔn)樣品均勻性與穩(wěn)定性的要求。研制的章魚肉堿標(biāo)準(zhǔn)樣品對章魚肉堿相關(guān)產(chǎn)品的測量和科學(xué)研究提供了技術(shù)支撐和量值溯源保證，具有重要意義。

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Development of Octopine Certified Reference Material

Xie Quanling， Zhang Yiping， Chen Hui， Hong Zhuan， Chen Weizhu， Fang Hua
（Third Institute of Oceanography， State Oceanic Administration， Fujian Collaborative Innovation Center for Exploitation and Utilization of Marine Biological Resources， Xiamen 361005，China）

Abstrat Octopine certified reference material was developed. Octopine was made from the processing byproduct of octopus. The structure of octopine certified reference material was comfirmed by infrared spectroscopy （IR），high resolution mass spectral （HRMS） and nuclear magnetic resonance （NMR）. Octopine was divided into 144 bottles. The homogeneity and stability testing and quantitative analysis method were evaluated by ions chromatography. According to analysis procedure of homogeneity，15 bottles of sample were randomly taken from 144 bottles，the sample homogeneity of inspection validated by F-test statistical methods within the 95% confidence interval was good. The stability inspection was carried on the long-term（24 months），and the results indicated that the period for octopine of storage was 24 months at 0 - 4℃. A cooperative certification was conducted with 8 qualified laboratories. The certified purity value of the reference material of octopine was 99.49% with the relative expaned uncertainty of 0.14 % （k=1.96）. The reference material can conform to the technical requirement of the certified reference material. The material was intended for use in the method validation and quality control regarding octopine.

octopine； certified reference material； homogeneity； stability； certification； uncertainty

O656

A

1008-6145（2016）03-0004-05

10.3969/j.issn.1008-6145.2016.03.001

*廈門市科技計劃項目（NO.3502Z20130004）；海洋公益性行業(yè)科研專項（201205022-8）；廣東海洋經(jīng)濟(jì)發(fā)展區(qū)域示范項目（GD2012-D01-001）

聯(lián)系人：洪專；E-mail∶ hzh@tio.org.cn

2016-03-14