張爾力（湖南警察學(xué)院，湖南　長沙　410138）

EDC/NHS法制備免疫磁珠及其效果驗證

張爾力（湖南警察學(xué)院，湖南長沙410138）

免疫磁珠又叫免疫磁性微球，是免疫學(xué)和磁性微球結(jié)合而發(fā)展的一類新型材料，一般用于物質(zhì)的提取和分離，由于其高效、低毒等特性，目前在生物化學(xué)領(lǐng)域、醫(yī)藥領(lǐng)域、食品檢測領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。本文主要應(yīng)用EDC/NHS法活化羧基磁珠，再將人類精子特異性抗體與之偶聯(lián)，最后制備成免疫磁珠，進行細胞捕獲實驗，分別捕獲人類的上皮細胞和精子，提取DNA，進行PCR（聚合酶鏈式反應(yīng)），進行電泳，根據(jù)STR（短串聯(lián)重復(fù)）圖譜的對比驗證了這種方法制備的免疫磁珠的偶聯(lián)效果。實驗證實，用EDC/NHS法活化制備的免疫磁珠能選擇性地捕獲到精子而不能捕獲到上皮細胞，該方法制備磁珠效果良好。

新型材料；免疫磁珠；細胞分離與提純；PCR；STR

磁性分離技術(shù)在工業(yè)上的應(yīng)用已經(jīng)有很長的歷史，1979年John Ugelstad［1］等制備了具有超順磁性聚苯乙烯微球，并將其磁化與抗體連接成分離細胞效果很好的免疫磁珠，使這一技術(shù)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域開始得到應(yīng)用。近年來，免疫磁珠分選細胞技術(shù)憑借其高效快速、簡便易行、無毒無害、低成本、分離純度高、保留細胞活性等特點，已被應(yīng)用于臨床實驗診斷，分離和檢測各種腫瘤細胞、骨髓細胞、血細胞、細菌及其他微生物等方面。

抗體與磁性微球的偶聯(lián)是將單克隆抗體與帶有功能基團的磁珠偶聯(lián)，抗體與磁珠連接的方式有兩種：共價偶聯(lián)（covalent coupling）和物理吸附（physicalabsorption）。物理吸附非常不穩(wěn)定，在一定的條件下很容易脫落，而共價偶聯(lián)是抗體與磁珠表面的基團共價結(jié)合，使抗體穩(wěn)固地結(jié)合在磁珠上。磁珠上的醛基、環(huán)氧基等基團可以直接和目標分子上的氨基結(jié)合，而含其他基團的磁珠則需要進行活化才能與目標分子連接。常用的活化方法有：碳二亞胺法、重氮法、烴化法、溴化氰法、戊二醛法、伍德沃德試劑K法等［2］。Molday等［3］把含有羧基的磁性聚合物微球用熒光染料作上標記，經(jīng)碳二亞胺活化，在微球表面偶聯(lián)抗體或外源凝集素，對人紅血細胞和B淋巴細胞進行了成功分離。國內(nèi)劉輝榮等［4］用EDC和NHS活化磁珠表面羧基，再和抗體的氨基反應(yīng)，這樣將抗體與磁珠偶聯(lián)，并用了多種方法檢驗磁珠與抗體的結(jié)合率。精子特異性抗體的特性是只能與精子膜特異性抗原反應(yīng)而不能與上皮細胞膜蛋白反應(yīng)。本文采用EDC/NHS法表面抗體修飾羧基磁珠來制備精子特異性抗體免疫磁珠，用細胞捕獲的方法來驗證磁珠的制備效果。

1　方法原理

EDC/NHS法表面抗體修飾羧基磁珠的原理：基磁珠表面所含的羧基（-COOH）先與現(xiàn)配的EDC溶液反應(yīng)，生成不穩(wěn)定的氨基活性O(shè)-?；逯虚g體，該中間體可以有三種轉(zhuǎn)化途徑：第一種是與溶液中的水反應(yīng)，還原成羧基磁珠；第二種是與抗體的氨基（-NH2）反應(yīng)，直接生成免疫磁珠；第三種是不穩(wěn)定的氨基活性O(shè)-?；逯虚g體與NHS反應(yīng)，生成半穩(wěn)定的氨基反應(yīng)活性NHS酯，該產(chǎn)物再與抗體上的氨基反應(yīng)，生成免疫磁珠。本實驗偶聯(lián)抗體是通過第三種轉(zhuǎn)化途徑。

2　主要儀器和試劑

EDC（1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺），北京中生瑞泰有限公司；NHS（N-羥基琥珀酰亞胺），北京中生瑞泰有限公司；MES（2-嗎啉乙磺酸），北京中生瑞泰有限公司；EDC溶液：將EDC溶解在冷的25mmol/LMES，pH=5中，EDC終濃度50mg/mL；NHS溶液：將NHS溶解在冷的25mmol/LMES，pH=5中，NHS終濃度50mg/mL；含有0.1%BSA和0.1%Tween-20的PBS溶液：在PBS中加入BSA和Tween-20，使BSA和Tween-20分別占總?cè)芤嘿|(zhì)量分數(shù)的0.1%；含有0.1%BSA的PBS溶液：在PBS中加入的BSA，使BSA占總?cè)芤嘿|(zhì)量分數(shù)的0.1%；0.05mol/ L pH=7.4 Tris溶液：將0.79g TrisHcl加入到90mL蒸餾水中，調(diào)pH值為7.4；100mmol/L pH=5MES溶液：將2.13gMES加入90mL蒸餾水中，pH值為5；AmpFlSTR?Identifiler plus PCR擴增試劑盒包含，美國Applied Biosystems公司；QIAamp DNAM48提取試劑盒；②磁性分離架，美國Promega公司；Dynabeads?M-270CarboxylicAcid羧基磁珠，美國Invitrogen公司；BCA蛋白定量試劑盒，中國Solarbio公司；Nanodrop_2000c超微量分光光度計，美國Thermo公司；③Anti-JLP抗體，英國abcam公司；④采集健康成年女性的口腔上皮細胞和健康成年男性的精子，分別制備成細胞數(shù)約104的細胞懸液。

3　實驗方法

免疫磁珠制備有兩個主要步驟，第一步是未偶聯(lián)抗體的磁性微球的制備，第二步是抗體與磁性微球的偶聯(lián)。本實驗采用美國Invitrogen公司的商品化磁珠Dynabeads?M-270CarboxylicAcid羧基磁珠偶聯(lián)抗體，減少了磁性微球的制備這一過程，直接使用已經(jīng)制備成功的穩(wěn)定的羧基功能化磁珠與所選抗體偶聯(lián)。

表1　免疫磁珠捕獲兩種細胞成功次數(shù)對比

3.1EDC/NHS活化羧基磁珠

將EP管置于磁力架上4min，待磁珠和溶液固液分離，在剩下裝有磁珠的EP管中加入50μL 25mmol/LPH=5的MES溶液，充分振蕩混合10min，固液分離，重復(fù)一次；在洗滌過的磁珠中加入25μL現(xiàn)配的EDC溶液和25μLNHS溶液，充分混合均勻，25℃孵育30min；固液分離，向EP管中加入50μL 25mmol/L PH=5的MES溶液，充分混合，固液分離，重復(fù)洗滌磁珠一次。

3.2已活化磁珠偶聯(lián)抗體反應(yīng)基本步驟

將30μL抗體（濃度1mg/mL）加入到30μL 25mmol/L MES，PH=5中，加入已活化的磁珠中，振蕩混勻，加入40μL 25mmol/LPH=5的MES溶液后置于渦旋振蕩器上振蕩確保充分混合?；旌衔镌?5℃孵育1h，將EP管放在磁力架上4min。磁珠中加入100μL 50mmol/L PH=7.4的Tris溶液，將EP管置于25℃孵育15min，期間緩慢旋轉(zhuǎn)振蕩，避免磁珠沉淀。15min后固液分離，移除液體成分。加入100μL含0.1%BSA和0.1% Tween-20的PBS溶液，將EP管置于渦旋振蕩儀上，充分振蕩搖勻，后將EP管置于磁力架上4min，固液分離，移除液體成分，如此重復(fù)4次。之后，將磁珠懸浮在50μL含有0.1%BSA的PBS緩沖液中。

3.3細胞捕獲驗證

首先按照上文中的方法制備104數(shù)量級的人精子懸液和人上皮細胞懸液，取1μL（上皮細胞懸液取100μL）加入EP管中，計數(shù)兩種細胞數(shù)量大致相同，再向EP管中加入10μL免疫磁珠，25℃孵育60min后，固液分離，將余下磁珠盡量完全吸出轉(zhuǎn)移至一新管，用500μL含有0.1%BSA的PBS緩沖液洗滌三次，余下的磁珠進行捕獲到的細胞的DNA提取。每種細胞實驗重復(fù)10次。

3.4DNA的擴增和毛細管電泳檢測

用AmpFlSTR?Identifiler Plus PCR擴增試劑盒10μL體系擴增提取出的DNA樣本。然后再將整個體系放入熱循環(huán)儀進行擴增。擴增程序：95℃預(yù)變性11min；94℃變性20s，59℃退火3min，循環(huán)29次；60℃終延伸30min，15℃保持。每組均設(shè)置陽性（9947A）和陰性（空白）對照。在3130XL型遺傳分析儀上根據(jù)標準步驟檢測擴增產(chǎn)物。

4　實驗結(jié)果

用GenMapper IDv3.2軟件進行數(shù)據(jù)分析，將所得的分型與樣本提供者進行比對（表1），將有13個以上基因座分型與精子供者一致，并且各等位基因峰高大于50RFUs定為分型正確的標準，結(jié)果用SPSS20統(tǒng)計學(xué)軟件進行χ2檢驗。

經(jīng)χ2檢驗，P＜0.05，制備出的免疫磁珠對兩種細胞的捕獲結(jié)果的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。統(tǒng)計結(jié)果顯示，Anti-JLP抗體免疫磁珠捕獲精子的成功率為100%，而成功捕獲上皮細胞的成功率為0。

5　結(jié)語

實驗結(jié)果顯示，用EDC/NHS法活化制備的免疫磁珠能選擇性地捕獲到精子而不能捕獲到上皮細胞，實現(xiàn)了預(yù)期效果，該方法制備磁珠效果良好。

［1］Ugelstad A.Process for preparing an aqueouse emulsion or dispersion of a party water-solublematerial and use of polymer particles prerared according to thisprocessasa toner in xerography［P］.EP0003905.1979-09-05.

［2］趙永芳.生物化學(xué)技術(shù)原理及其應(yīng)用［M］：第二版.武漢：武漢大學(xué)出版社，1994.238-241.

［3］Molday RS.Nature，1977，268:437-438.

［4］劉輝榮，徐宏，古宏晨.簡便高效分離細胞新型免疫磁珠制備［J］.中國公共衛(wèi)生，2008.24（11）：1349-1351.