婁 麗 李從瑞 侯 娜 楊成華 鄧倫秀

(貴州省林業(yè)科學研究院 貴陽 550005)

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牛耳朵組培快繁體系的建立及優(yōu)化

婁 麗 李從瑞 侯 娜*楊成華 鄧倫秀

(貴州省林業(yè)科學研究院 貴陽 550005)

以當年生長良好的牛耳朵葉片為外植體,通過對外植體的消毒、不定芽誘導、增殖及生根培養(yǎng)，篩選高效穩(wěn)定的無菌芽誘導優(yōu)化體系。結(jié)果表明:外植體最佳消毒方法為用70%酒精浸泡30s，3%NaClO消毒2.0 min；不定芽誘導最佳培養(yǎng)基為: WPM+6-BA3.0mg/L+2-ip 1.0mg/L+NAA0.1mg/L，誘導率為83.23%；不定芽增殖最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+GA30.5mg/L，增殖系數(shù)為16.0，且不定芽長勢良好；生根培養(yǎng)基以1/2MS+IBA0.1mg/L+NAA0.05mg/L為較好，生根率達92.35%。以腐殖土：珍珠巖=3:1為移栽基質(zhì)的成活率最高達100%。

牛耳朵；芽誘導；培養(yǎng)基

牛耳朵(ChiritaeburneanHanc)為苦苣苔科唇柱苣苔屬植物，根和全草入藥，其味甘、性平,具有補虛、止咳、解毒等藥用功效[1～4]。唇柱苣苔屬植物全世界約130種；其中約81種分布在我國的西南、華南向東達浙江、福建、臺灣，湖北、湖南、廣東、廣西、貴州、四川等地[2～6]。牛耳朵是多年生草本植物,花1～15朵,花序基部有苞葉,寬卵形或卵形,葉面被密毛?；ü诠軋A柱狀,呈紫色或淡紫色，花期4～7月。其在海拔400～1200米的石灰?guī)r山地或山溝邊林下生長，適于疏松肥沃的酸性或微酸性土壤。牛耳朵葉四季常青,花期長、花色艷麗,尤其是開花前期花梗頂端苞片外緣呈紫紅色,作室內(nèi)盆栽觀賞效果佳；牛耳朵還可用于露地花壇、草坪及地被植物栽培，具有極高的園林景觀開發(fā)前景，是一個正待開發(fā)的觀賞植物[2～3]。 目前，吳建璋等初步研究表明牛耳朵提取物對自發(fā)性高血壓有顯著的藥用功效，其作為藥用植物雖然尚未進入開發(fā)階段，但具有極大的開發(fā)潛力。

牛耳朵采用播種繁殖、扦插繁殖，繁殖速度慢，后代易產(chǎn)生遺傳變異。溫放[6]等對牛耳朵在組織培養(yǎng)方面進行了研究，研究結(jié)果表明，不定芽的誘導率僅為73%，存在誘導率低、叢生芽增殖系數(shù)較低的缺點。本研究以牛耳朵葉片為外植體，對其無菌體系建立、不定芽誘導、繼代增殖、生根等一系列問題進行了研究，篩選各階段最佳培養(yǎng)基配方，建立牛耳朵芽誘導高頻植株體系。旨在為其標準規(guī)模化育苗提供技術(shù)理論支撐，對生產(chǎn)實踐意義極為重要。

1 材料與方法

1.1 材料來源

供試材料為貴州省荔波茂蘭自然保護區(qū)的牛耳朵(ChiritaeburneanHanc)，以當年生長良好的葉片為外植體。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的消毒

將室外采集的葉片經(jīng)流水沖洗1h，先用70%酒精不同時間處理葉片，無菌水沖洗3～5次。再用3%NaClO消毒，3%NaClO消毒時間為2.0min、4.0min、6.0min和8.0min。滅菌后無菌水沖洗3～5次，接種在MS培養(yǎng)基上，添加蔗糖25g/L和瓊脂5g/L,調(diào)節(jié)pH值5.8；每瓶1個外植體，每一處理接種30瓶，培養(yǎng)溫度25±2℃，放置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，暗培養(yǎng)7d，然后轉(zhuǎn)移到光照強度1500～2000lx，每天光照12h，光照培養(yǎng)3d,觀察記錄污染數(shù)和成活數(shù)。萌發(fā)率(%)=腋芽萌發(fā)數(shù)/接種數(shù)(不包括污染數(shù))。

1.2.2 誘導不定芽

將無菌外植體葉片切成0.5cm×0.5cm的小塊，轉(zhuǎn)接到添加不同濃度6-BA,2-ip和NAA的WPM培養(yǎng)基上，進行葉片誘導不定芽的影響因子研究。當6-BA 濃度為3.0mg/L和NAA濃度為0.1mg/L，2-ip濃度為0.1,0.5,1.0,1.5,2.0和2.5mg/L 6個濃度梯度，30d統(tǒng)計不定芽萌芽情況。每個處理30瓶，每個處理重復3次，放置在溫度25±2℃，光照強度1500～2000lx，每天光照12h的環(huán)境。叢生芽誘導率(%)=誘導出不定芽芽的腋芽數(shù)/接種的腋芽數(shù)。

1.2.3 牛耳朵不定芽增殖

將葉片誘導的不定芽，接種到添加不同濃度的6-BA、NAA、GA3的MS培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。30d統(tǒng)計不定芽增殖情況。每個處理30瓶，每個處理重復3次，放置于在溫度25±2℃，光照強度1500～2000lx，每天光照12h。增殖系數(shù)=誘導后不定芽的數(shù)/誘導前不定芽的數(shù)。

1.2.4 牛耳朵不定芽生根

將不定芽切成單芽，接種在濃度為0.1 mg/L IBA、0.05 mg/L NAA、0.1 mg/L IBA+0.05 mg/L NAA和不加激素的1/2MS培養(yǎng)基上。每個處理接種30瓶，每個處理重復3次，放置于在溫度25±2℃，光照強度1500～2000lx，每天光照12h。觀察記錄生根情況并計算生根率。生根率=生根小苗數(shù)/總苗數(shù)×100%。

1.2.5 煉苗與移栽

將生根組培苗揭開瓶蓋，在室內(nèi)自然條件下煉苗7d；將苗移出培養(yǎng)瓶，用毛刷輕輕清洗根上的培養(yǎng)基。初步研究使用煉苗基質(zhì)為腐殖土、黃土、樹皮、珍珠巖4種，按不同配比，設(shè)置4個處理：I腐殖土；Ⅱ黃土；Ⅲ黃土：珍珠巖=3:1；Ⅳ腐殖土：珍珠巖=3:1。所用移栽基質(zhì)經(jīng)高錳酸鉀消毒，將苗移栽入基質(zhì)中，覆膜以及定期澆水保持空氣濕度，栽后30d統(tǒng)計苗成活率。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

Excel 2007進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理； SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒處理對牛耳朵成活率的影響

消毒劑種類和消毒時間長短對外植體的影響較大，適宜的消毒劑和處理時間可有效降低污染數(shù)，減少組織污染死亡，提高外植體的成活率(表1)。結(jié)果表明70%酒精消毒時間30s+3%NaClO滅菌4min，污染率較低，成活率為57%；當3%NaClO浸泡時間增加至6min，污染率和成活率都下降。因此采用70%酒精處理30s+3%NaClO浸泡4min的消毒滅菌，牛耳朵葉片外植體能得到較高的成活率和較低的污染率。

表1 不同消毒處理結(jié)果統(tǒng)計表

2.2 不同濃度激素對葉片誘導不定芽的影響

牛耳朵接種于表2所示的培養(yǎng)基上培養(yǎng)45d左右形成一簇生芽﹙圖A﹚。試驗發(fā)現(xiàn)，在前30d的培養(yǎng)過程中，芽分化和生長速度較慢，但繼續(xù)培養(yǎng)25d后，叢生芽的誘導數(shù)量增多，生長速度加快。在6-BA和NAA濃度一定，2-ip濃度在0.1～2.5mg/L之間變化時，葉片叢生芽的誘導率呈先上升后下降的趨勢，在1.0mg/L時，誘導率達到最高，為83.23%；NAA濃度保持不變時，低濃度的2-ip不利于無菌芽的分化，誘導率和平均發(fā)芽數(shù)隨著2-ip濃度的增加先升高后下降，在1.0mg/L時達到最高；而高于1.0mg/L時，玻璃化現(xiàn)象嚴重，誘導率反而下降。因此，在6-BA濃度3.0mg/L 和NAA濃度為0.1mg/L時，2-ip濃度為1.0mg/L更適合誘導叢生芽，誘導率達到最高，為83.23%，平均萌芽數(shù)為15.32個。因此，葉片誘導叢生芽的最佳培養(yǎng)基為WPM+6-BA3.0mg/L+2-ip 1.0mg/L+NAA0.1mg/L。

表2 不同濃度激素對牛耳朵葉片不定芽的誘導情況

2.3 不同濃度激素對不定芽增殖的影響

不同濃度激素對不定芽增殖的影響見表3。方差分析進行多重比較：不同濃度激素處理對牛耳朵不定芽增殖有顯著差異。觀察發(fā)現(xiàn)6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+GA30.5mg/L為牛耳朵不定芽增殖最佳激素配比，分化不定芽較快，很快形成小植株，且數(shù)量多，部分分生出細根；無菌芽在該培養(yǎng)基上20天后開始萌發(fā)，平均分化不定芽16.34個，在該組合培養(yǎng)基上，接種30天左右，分化的不定芽形成植株形態(tài)，具有3～4片葉片(圖B)。

2.4 不同濃度激素處理對生根的影響

將有2～4片葉的無根苗轉(zhuǎn)接入生根培養(yǎng)基上，接種15d左右觀察有白色細長的根發(fā)生﹙圖C﹚。對不同試驗號進行多重比較方差分析(表4)，結(jié)果顯示不同激素組合處理對牛耳朵生根的影響表現(xiàn)差異顯著。各處理的均值大小依次為4(92.35%)﹥3(82.30%)﹥2(52.12%)﹥1(32.18%)；結(jié)果表明一定激素濃度的IBA和NAA組合對牛耳朵生根有促進作用，誘導牛耳朵生根最佳組合為4號培養(yǎng)基，即：1/2MS+NAA0.05 mg/L +IBA0.1mg/L，植株須根多，生長良好，生根率平均可達92.35%。

表3 不同濃度激素處理對不定芽增殖生長的影響

注：表中小寫字母表示同一激素在0.05水平上的顯著性差異(下同)。

表4 激素處理對牛耳朵不定芽誘導生根情況

2.5 煉苗與移栽

經(jīng)過生根培養(yǎng)的組培苗，煉苗7d，使其適應外界環(huán)境，移栽在已消毒的3:1的腐殖土：珍珠巖中，澆水，覆膜，70%的遮陽網(wǎng)覆蓋遮陰。結(jié)果表明：8月移栽，30d后，移栽苗生長良好，移栽成活率100%以上﹙圖D﹚，且正常開花(圖E)。

3 結(jié)論與討論

由于牛耳朵葉片上有短茸毛,在表面消毒時加大了滅菌的難度；在植物組織培養(yǎng)過程中，外植體消毒是關(guān)鍵一步。許多研究者采用升汞消毒，但是升汞消毒后難去除殘留的汞，本研究中采用當年生長良好的葉片，經(jīng)流水沖洗1h，先用70%酒精處理30s，再用3%NaClO消毒滅菌4min的方法，使無菌外植體成活率為57%，污染率降低為26.67%。

不同類型植物對培養(yǎng)基具有選擇性，通常情況下草本植物用MS為基本培養(yǎng)基，WPM培養(yǎng)基用于木本植物。溫放[6～7]等對黃花牛耳朵、牛耳朵組織培養(yǎng)的研究結(jié)果表明：采用MS為基本培養(yǎng)基，誘導率僅為73%，本研究用WPM為基本培養(yǎng)基進行誘導不定芽，極大縮短誘導芽時間，同時增加不定芽的數(shù)量。因此，當外植體難誘導不定芽的草本植物時可采用WPM培養(yǎng)基。合適的激素種類及濃度可有效促進不定芽的誘導及增殖，牛耳朵葉片誘導不定芽的試驗結(jié)果顯示，濃度為1.0mg/L的2-ip有利于芽誘導，誘導率為83.23%。MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+GA30.5mg/L明顯促進不定芽的增殖。牛耳朵最適生根培養(yǎng)基配方為1/2MS+NAA0.05mg/L+IBA0.1mg/L。適宜濃度的NAA和IBA對不定根的發(fā)生有明顯的促進作用，生根率平均可達92.35%，且植株的葉片生長健壯，長勢良好。室外移栽時，牛耳朵組培苗對空氣相對濕度要求較高，移栽注意澆水保濕，移栽適宜基質(zhì)為腐殖土：珍珠巖=3︰1，成活率達100%以上。因此，本試驗建立的牛耳朵組培快繁體系具有周期短、增殖系數(shù)大、成活率高等優(yōu)點，適合在生產(chǎn)上規(guī)?；茝V應用。本研究僅對牛耳朵芽誘導、增殖及生根快繁技術(shù)重要環(huán)節(jié)進行了研究，但有關(guān)光照和溫度等環(huán)境條件在牛耳朵組培快繁的影響有待進一步研究。

注：A.不定芽誘導;B.不定芽增殖;C生根培養(yǎng);D.煉苗;E.開花植株圖1 牛耳朵芽誘導體系不同階段及開花狀態(tài)

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Establishment and Optimization of Technique system of Tissue Culture forChiritaeburneanHanc

LOU Li LI Cong-rui HOU Na* YANGg Chen-hua DENG Lun-xiu

(Guizhou Academy of Forestry, Guiyang, Guizhou 550005)

The shoots were induced in vitro from Chirita eburnean Hanc leaflets through disinfection, adventitious shoots induction, proliferation and rooting culture.The results showed that the best method for the explant disinfection was “30s soaked in 70% alcohol”， 3%NaClO disinfection 2min; The best medium for adventitious bud induction: WPM+ 6-BA3.0mg/L 2-ip 1.0mg/L NAA0.1mg/L, the induction rate was 83.23%; The best medium for adventitious bud proliferation of MS +6-BA1.0mg/L NAA0.1mg/L GA30.5mg/L, the proliferation coefficient was 16, and the adventitious buds grew well; 1/2MS +IBA0.1mg/L NAA0.05mg/L was the best rooting medium, and the rooting rate was 92.35%. In the humus soil: Perlite =3:1 for transplanting survival rate was as high as 100%.

Chirita eburnean Hanc; Shoots induction; Medium

2016-04-10

貴州省科技廳推廣項目“貴州野生草本花卉引種栽培示范”(編號：黔科合成字(2012)5033號資助)。

婁麗(1989～)，女，貴州貴陽，研實員，從事植物生物技術(shù)研究，E-mail:louli2007@163.com，聯(lián)系電話：15286066085。

侯娜(1983～)，女，陜西戶縣人，工程師，從事林木生物技術(shù)研究，E-mail：houna1018@163.com，聯(lián)系電話：18984309353。

S722.3+7

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