吳明長 徐嘉娟 朱亞艷 王 港

(1.黃平縣國有林場 貴州黃平 556100；2.貴州省林業(yè)科學(xué)研究院 貴陽 550005)

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馬尾松SRAP-PCR反應(yīng)體系的建立及遺傳多樣性分析*

吳明長1徐嘉娟2朱亞艷2王 港2

(1.黃平縣國有林場 貴州黃平 556100；2.貴州省林業(yè)科學(xué)研究院 貴陽 550005)

利用相關(guān)序列擴增多態(tài)性(SRAP)分子標記技術(shù)，對黃平縣國有林場國家馬尾松良種基地子代測定林中評選出的31個優(yōu)良單株的遺傳多樣性和親緣關(guān)系進行分析。從360對SRAP引物組合中篩選出7對條帶清晰、多態(tài)性好的引物，在31份馬尾松材料中共擴增出151條帶，其中有150條多態(tài)性帶，多態(tài)性比率99.3%；利用4對引物進行遺傳多樣性分析表明，31份馬尾松材料間的遺傳相似系數(shù)值變化范圍為0.4239～0.8804，平均有效等位基因數(shù)為1.5679，Nei′s基因多樣性指數(shù)為0.3304，Shannon信息指數(shù)為0.4956，說明31個優(yōu)良單株間存在較高遺傳變異。應(yīng)用SRAP分子標記技術(shù)能有效地檢測供試樣本間的遺傳多樣性，揭示其親緣關(guān)系，為貴州省高世代種子園營建親本選配提供參考。

馬尾松；遺傳多樣性；親緣關(guān)系；SRAP

馬尾松(PinusmassonianaLamb.)是我國南方重要的用材樹種和荒山綠化的先鋒樹種，也是貴州主要的造林用材樹種，目前馬尾松遺傳改良已步入高世代種子園營建階段[1, 2]。種子園是林木良種繁育基地，要能提供遺傳品質(zhì)和播種品質(zhì)優(yōu)良的種子，保證種子園有較高的遺傳增益，種子園的建立才有意義；同時又必須保證種子園有較寬的遺傳基礎(chǔ)，才能保證種子園的質(zhì)量[3]。建園親本的選配關(guān)系著種子園的成敗，掌握建園材料的遺傳背景和親緣關(guān)系，對建園親本的選配具有重要意義。高世代種子園的建園材料主要來源于上一代種子園的子代林，具有較大的幾率出現(xiàn)半同胞家系甚至全同胞家系，如何配置由子代林中選出的無性系是當(dāng)前我們建設(shè)高世代種子園面臨的技術(shù)難點。

相關(guān)序列擴增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism，SRAP)標記是近年開發(fā)的一種新型分子標記技術(shù)[4, 5]。該標記方法擴增多態(tài)性高，能提供更多的生物學(xué)信息，檢測的結(jié)果能更好的反映物種的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，并且其操作簡便、成本低、可信度高、無需預(yù)先知道物種的序列信息[6～8]，是一個遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系研究、品種鑒定、種質(zhì)資源研究的有效工具。近年來，利用分子生物學(xué)手段研究親本間的親緣關(guān)系與遺傳差異，用以指導(dǎo)親本選擇、種質(zhì)鑒定方面的應(yīng)用已較為廣泛[9～11]。沈敬理等[12]基于SSR和SRAP分子標記技術(shù)，構(gòu)建了福建省漳平五一國有林場馬尾松種子園131個親本無性系的DNA指紋圖譜。王鵬良等[13]采用SRAP分子標記對119份廣西普通油茶進行遺傳多樣性分析，初步理清了供試材料間的遺傳關(guān)系。胡德昌等[14]應(yīng)用SRAP分子標記對24份桑樹品種資源進行親緣關(guān)系分析，篩選的SRAP引物能有效地檢測供試桑樹品種的遺傳多樣性，揭示品種間的親緣關(guān)系。本研究利用SRAP分子標記對黃平馬尾松種子園31個馬尾松家系優(yōu)選單株進行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，以期為黃平馬尾松高世代種子園建園親本選配提供分子水平的選擇依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

1.1.1 材料

試驗選取黃平縣國有林場國家馬尾松良種基地子代測定林中評選的31個優(yōu)良單株進行測定分析，其中1號和3號、19號和21號為半同胞家系，12a號和12b號、19a號和19b號為全同胞家系，其它單株母本不同，父本不清楚。選取生長良好、無病蟲害的嫩梢，剪下后放入裝有硅膠的自封袋中，做好標記，待干燥好后放入-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑及儀器

試驗使用的試劑及廠家信息如下：2×Tap Master Mix購自上海欣百諾生物科技有限公司；100bp DNA Ladder(MD109)購自北京天根生化科技有限公司。

實驗中使用的主要儀器有Long Gene A200型PCR儀(朗基公司生產(chǎn))、DYY-12型電泳儀(北京六一公司生產(chǎn))。實驗在西北農(nóng)林科技大學(xué)分子實驗室完成。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計及篩選

參照Li等[4]提出的原則設(shè)計SRAP分子標記20個正向引物和18個反向引物，組合形成360對引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物名稱及序列見表1。將合成的360對SRAP引物進行初篩，獲得條帶清晰穩(wěn)定、擴增多態(tài)性好的7對引物用于分析。部分引物擴增結(jié)果見圖1。

1.2.2 DNA提取及檢測

采用改良的CTAB法提取馬尾松基因組DNA，使用核酸蛋白分析儀檢測DNA的濃度和純度，用超純水(ddH2O)將DNA樣品濃度稀釋為10 ng/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR擴增體系及檢驗

SRAP-PCR反應(yīng)體系(20μL)：模板DNA 1μL，正、反向引物各1μL，2×Tap Master Mix 10μL，dH2O 7μL。PCR擴增程序：95℃預(yù)變性1min；94℃變性1min，35℃退火1min，72℃延伸1min，共5個循環(huán)；94℃變性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。擴增產(chǎn)物用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染檢測，并拍照記錄。

表1 SRAP引物序列

圖1 引物ME6/EM16對31份馬尾松材料基因組DNA的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

1.2.4 條帶統(tǒng)計及遺傳距離和遺傳參數(shù)計算

根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜中同一水平位置條帶有無對應(yīng)賦值“1”、“0”的記錄結(jié)果，利用NTSYS-pc 2.10e軟件計算31份材料兩兩間的遺傳相似性系數(shù)。遺傳相似系數(shù)越大，表明供試材料間的親緣關(guān)系越近，反之則越遠[15]。首先對1號引物統(tǒng)計結(jié)果進行分析，然后再按引物編號順序逐對添加數(shù)據(jù)，最終完成一對引物、兩對引物……七對引物的分析。

1.3 可靠性檢驗設(shè)計

在采集供試馬尾松材料時，分別選取2組全同胞和半同胞家系材料，用以檢驗試驗結(jié)果的可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選結(jié)果分析

31個馬尾松優(yōu)良單株間的遺傳變異相對較大。從360個引物組合中篩選出多態(tài)性好、條帶清晰、重現(xiàn)性好的7對引物對31份馬尾松材料DNA樣品進行SRAP-PCR擴增。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測均有清晰的譜帶，并顯示豐富的多態(tài)性。7對引物組合共擴增出151條條帶，其中150條為多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率為99.3%，每對引物組合平均擴增出21.6條條帶和21.4條多態(tài)性條帶(表2)。引物組合ME6/EM15、ME6/EM16、ME6/EM17產(chǎn)生的多態(tài)性比率均為100%，ME6/EM9引物組合的多態(tài)性最低也已超過90%。由此表明SRAP分子標記具有比較高的多態(tài)性，同時也說明31個馬尾松優(yōu)良單株間具有豐富的遺傳多樣性。圖1是引物ME6/EM16對31份供試材料的擴增結(jié)果。

2.2 試驗結(jié)果可靠性分析

通過對31份馬尾松材料的聚類分析發(fā)現(xiàn)(圖2)：12a和12b、19a和19b兩組全同胞家系材料各自間具有最大的遺傳相似性(0.880 4)而聚到一起；1和3、28和31兩組半同胞家系各自間的遺傳相似系數(shù)分別為0.8152、0.8370，遺傳相似性較高，遺傳距離較小，分別聚到同一個小分支上。聚類分析結(jié)果與可靠性檢測設(shè)計的預(yù)期結(jié)果一致，表明本文試驗結(jié)果是比較可靠的。

圖2 31份馬尾松材料基于SRAP分子標記的UPGMA聚類圖

編號引物組合擴增條帶總數(shù)/條多態(tài)性條帶數(shù)/條多態(tài)性比率(%)1ME6/EM916159382ME6/EM1517171003ME6/EM1635351004ME6/EM1723231005ME6/EM715151006ME5/EM424241007ME4/OD82121100總和151150993

2.3 參試材料遺傳多樣性分析

供試樣本遺傳相似性系數(shù)見表3，從表中可以看出：隨著引物對數(shù)的增多，遺傳相似系數(shù)最小值逐漸增大，增加到4對引物數(shù)據(jù)后趨于平衡；最大值總體呈減小趨勢，同樣增加到4對引物數(shù)據(jù)后趨于平衡。三對、四對、五對引物數(shù)據(jù)的聚類圖具有一定的相似性，6、9、10、11號樣品與其他樣品遺傳相似系數(shù)較低，13、16、17、18、19、21號樣品和23、24、28、29號樣品等總是以較高的遺傳相似性始終聚在一起。但相比之下，3對引物數(shù)據(jù)的聚類圖與四對和五對引物數(shù)據(jù)的聚類圖差異較大，將供試樣本在0.7附件劃分后，依據(jù)三對引物數(shù)據(jù)聚類圖劃分的居群中的樣本與四對和五對引物數(shù)據(jù)聚類圖劃分的居群中的樣本有較大出入，而依據(jù)四對引物數(shù)據(jù)的聚類圖劃分的居群則與依據(jù)五對引物數(shù)據(jù)聚類圖劃分的居群中樣本成員完全一致，只是在更細層次的聚類中略有差異。因此采用4對引物數(shù)據(jù)(90個多態(tài)性位點)即可對供試的31份馬尾松材料進行穩(wěn)定、準確的聚類(圖2)。

利用Popgene32軟件對供試樣本四對引物數(shù)據(jù)進行分析，得到31個馬尾材料91個位點平均等位基因觀察值(Na)為1.9890，平均有效等位基因數(shù)(Ne)為1.5679，Nei′s基因多樣性指數(shù)(H)為 0.3304，Shannon信息指數(shù)(I)為0.4956。張薇[16]等通過SSR分子標記對福建白砂林場馬尾松實生種子園家系及其自由授粉子代的遺傳多樣性分析表明：子代群體等位基因數(shù)平均為5.9167 個，有效等位基因數(shù)平均為2.3788 個，Shannon多樣性指數(shù)為1.0348，Nei′s多樣度為0.5740。張一等[17]利用ISSR分子標記對姥山林場馬尾松二代核心育種群體的36個親本無性系的分析發(fā)現(xiàn)供試樣本的Nei's 基因多樣性為0.328，Shannon信息多樣性指數(shù)為0.476。

表3 引物遺傳相似性系數(shù)表

2.4 不同親緣關(guān)系材料遺傳距離分析

2.4.1 全同胞單株遺傳距離分析

遺傳相似性分析結(jié)果表明所選取的兩組全同胞家系：12a和12b、19a和19b，各自間具有最大的遺傳相似系數(shù)0.8804，說明遺傳相似性最高，遺傳距離最小，親緣關(guān)系最近，并且從聚類分析結(jié)果(圖2)可以看到兩組全同胞家系的材料分別聚在了一起。

2.4.2 半同胞單株遺傳距離分析

對所選取的兩組半同胞家系的遺傳相似性分析表明， 1號和3號的遺傳相似系數(shù)為0.8152，28號和31號遺傳相似系數(shù)為0.8370，均具有較高的遺傳相似性，遺傳距離較小，親緣關(guān)系比較近，在聚類分析(圖2)時聚到了同一小分支上。

2.4.3 不同母本單株親緣關(guān)系分析

31份馬尾松材料的遺傳相似系數(shù)為0.4239～0.8804(表4)，除兩組全同胞家系和兩組半同胞家系外，21號和19號、17號和19號的遺傳相似系數(shù)較大，分別為0.8587、0.8478，遺傳相似性較高，親緣關(guān)系較近，推測21號、17號與19號同屬于一個半同胞家系。而6號與30號的遺傳相似系數(shù)最小，為0.4239，說明遺傳相似性最低，遺傳距離最大，親緣關(guān)系最遠。

表4 樣品間的遺傳相似系數(shù)

根據(jù)遺傳相似性分析及聚類分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分材料間的親緣關(guān)系較近，在親本選配時應(yīng)配置到不同的區(qū)組中，避免長生近交，同時考慮在同一區(qū)組的親本間親緣關(guān)系不能太遠，以免產(chǎn)生生殖隔離，影響種子園的產(chǎn)量和質(zhì)量，據(jù)此將31個優(yōu)良單株劃分為3組：Ⅰ：1號、2號、12號、13號、16號、19號、22號、23號、24號、28號；Ⅱ：3號、4號、5號、14號、15號、17號、18號、20號、21號、29號、31號；Ⅲ：6號、7號、8號、9號、10號、11號、25號、26號、27號、30號，為高世代種子園建園親本的選配提供分子生物學(xué)方面的參考。

3 討論

本研究利用SRAP分子標記分析了黃平縣國有林場國家馬尾松良種基地計劃作為基地高世代種子園建園材料的31個優(yōu)良單株的遺傳多樣性，每對引物可以擴增出15～35條帶，多態(tài)性水平為99.3%，表明該批材料具有比較寬的遺傳基礎(chǔ)，為馬尾松高世代種子園的配置提供了豐富的遺傳基礎(chǔ)。

林木生長周期長、遺傳背景復(fù)雜，在遺傳改良過程中很難在短期內(nèi)對親本進行有效的評價和利用，因而增加了親本選擇的盲目性，限制了林木遺傳改良的進程和效果。近年來，利用分子標記技術(shù)研究親本間遺傳差異與雜交子代性狀表現(xiàn)的相關(guān)性，用以指導(dǎo)雜交親本的選配成為林木遺傳育種領(lǐng)域中的熱點。張一等[18]利用ISSR分子標記研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)馬尾松一代育種親本間的分子遺傳距離處于0.264～0.529時，親本間的遺傳距離與其子代生長性狀具有顯著的相關(guān)性；李梅等[19]對杉木的研究表明，親本的遺傳距離在一定范圍內(nèi)與子代樹高、胸徑和材積性狀呈顯著正相關(guān)；李善文等[20]研究發(fā)現(xiàn)，楊樹中隨著父、母本間遺傳距離的增大，子代生長的雜種優(yōu)勢更顯著。當(dāng)前我國馬尾松遺傳改良已經(jīng)進入高世代育種階段，收集保存的育種親本所受的人工選擇強度更大，遺傳背景也更加復(fù)雜。因此，通過分子標記技術(shù)研究親本遺傳背景，輔助親本選配和雜種優(yōu)勢預(yù)測，將對馬尾松高世代育種中提高親本選配效率和雜種優(yōu)勢利用具重要的意義。

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Establishment of SRAP-PCR Reaction System and Analysis of Genetic Diversity ofPinusmassoniana

WU Ming-chang1XU Jia-juan2ZHU Ya-yan2WANG Gang2

(1.Huangping County State-owned Forest Farm, Guizhou, Huangping 556100; 2.Guizhou Academy of Forestry, Guizhou, Guiyang 550005, China.)

The sequence-related amplified polymorphism (SRAP) was used for the analysis of genetic diversity and genetic relationship of 31 superior individuals selected from progeny test plantation in the national masson pine seeds base of state-owned forestry farm in Huangping county. Seven primer pairs with clear strips and good polymorphism was selected from 360 primer pairs,151 bands were amplified from 31 test materials, among which 150 bands were polymorphic, resulting in a polymorphic rate of 99.3%; 4 pairs of primer were used to analyze genetic diversity. The results showed that :the genetic similarity coefficients among 33 test materials ranged from 0.4239 to 0.8804, the average effective number of alleles was 1.5679, Nei′s gene diversity index was 0.3304, and Shanaon′s information index was 0.4956, which indicated that relatively higher genetic diversity exists between 31 superior individuals of Pinus massoniana. The genetic diversity and genetic relationship of test samples could be effectively revealed by SRAP marker technology, and the results would provide reference of parent selection in advanced generation seed orchard of Pinus massoniana.

Pinusmassoniana; genetic diversity; genetic relationships; SRAP

2016-04-22

吳明長(1974～)，助理工程師，主要從事馬尾松良種基地研究與管理工作。Email:478759549@qq.com

，王港(1979～)，副研究員，主要從事林木遺傳改良與苗木培育技術(shù)研究。Email:417328697@qq.com

“杉木、馬尾松優(yōu)良無性系選育及利用技術(shù)研究”(黔林科合 [2014] 04號)；馬尾松種子園改造與高世代種子園建園材料研究(院立項目)。

S722.8+3

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