林紅賽　黃永富　岳衛(wèi)華　王春仁

1 北京市醫(yī)療器械檢驗所?。ū本?01111）　2 中國食品藥品檢定研究院?。ū本?00050）

膠原和殼聚糖復合材料在組織工程支架中的應用

林紅賽1黃永富1岳衛(wèi)華1王春仁2

1 北京市醫(yī)療器械檢驗所（北京101111）2 中國食品藥品檢定研究院（北京100050）

內(nèi)容提要： 本文綜述了膠原和殼聚糖復合材料作為組織工程支架在皮膚修復、角膜修復和骨修復等方面的應用進展，表明膠原和殼聚糖復合材料已經(jīng)成為上述各個組織工程領域支架材料的研究熱點，但是膠原蛋白-殼聚糖復合材料不是萬能的，根據(jù)不同的用途，可能要加入一些其他的材料與其共混，以更好的符合不同目標組織的需求。

組織工程支架膠原殼聚糖復合材料

0.引言

組織工程是指應用生命科學與工程的原理及方法構建一個生物裝置來維護和增進人體細胞和組織的生長，以恢復、維持或提高受損組織或器官的功能［1］。組織工程研究包括種子細胞、組織工程支架和生長因子微環(huán)境三方面，其中組織工程支架是組織工程研究的重點之一，它為細胞的粘附和生長提供空間和有效的物理支撐，并決定著目標組織或器官的結構和形狀。構成組織工程支架的材料種類繁多，包括天然材料和合成材料兩大類，其中殼聚糖和膠原屬于應用非常廣泛的兩種天然材料，殼聚糖和膠原在創(chuàng)傷科、角膜修復科和骨科等領域廣為應用。本文就膠原和殼聚糖在組織工程中應用的優(yōu)缺點和兩種材料復合后在組織工程支架中的應用進展作一綜述。

1.膠原和殼聚糖復合材料

膠原是一種天然纖維蛋白，占人體或其他動物總蛋白含量的25%～33%，廣泛存在于動物的皮膚、骨、肌腱韌帶和角膜等組織中，是動物體內(nèi)含量最豐富的蛋白質(zhì)。由于膠原具有低免疫原性、可生物降解性以及良好的生物相容性等特點使得其作為構建活性組織工程支架的應用十分廣泛。但是，膠原機械性能和抗水性能差，在體內(nèi)降解時受局部因素的影響大，降解速度可控性不如人工合成多聚物，單獨用作基質(zhì)材料尚難以達到理想的要求［2］。

殼聚糖是甲殼素的部分或全部脫乙?；漠a(chǎn)物，為自然界中唯一的堿性多糖。這種天然高分子化合物，因其低抗原性、可生物降解性、良好的生物相容性及降解產(chǎn)物安全無毒，具有廣泛的抗菌、止血、止痛作用。同時還具有選擇性促進表皮細胞生長的獨特的生物活性，在生物材料方面的應用受到廣泛關注［3～5］。但是，目前殼聚糖支架材料也存在缺點，如溶解性不好、降解速率與新生組織的生成速率匹配性不佳，材料缺乏表面特異性等。

因此，單一的膠原和殼聚糖由于各自的缺點限制了其在組織工程領域的應用。有研究表明，充分利用兩種材料的優(yōu)缺點，將膠原與殼聚糖復合后能產(chǎn)生協(xié)同效應。早在2001年，tan等［6］對復合膠原-殼聚糖基質(zhì)做了物理和細胞學的相關實驗檢測，表明復合膠原和殼聚糖基質(zhì)就其生物學和機械特性，有作為一種細胞支架的潛力。不少學者發(fā)現(xiàn)，膠原和殼聚糖在分子級都是相容的，兩者之間具有較強的相互作用，不同比例的膠原和殼聚糖復合可以得到不同應用的組織工程支架材料，且該復合材料具有良好的生物安全性，對機體無毒，不致突變，對細胞有較強的親和作用，利于細胞生長和分化［7～9］。近年來有報道以膠原-殼聚糖共混膜為基質(zhì)用于上皮細胞的體外培養(yǎng)［10］，或?qū)⒛z原-殼聚糖加工成多孔支架材料用于真皮成纖維細胞的體外培養(yǎng)［11］，亦有對膠原-殼聚糖共混物相互作用的機理及性能方面的研究報道［12～14］。因此，膠原-殼聚糖復合材料在組織工程各個領域應用研究備受學者青睞。

2.在組織工程中的應用進展

2.1組織工程皮膚修復材料

組織工程皮膚是利用組織工程技術，在組織工程支架材料上復合種子細胞，從而構建出用于修復、維護和改善損傷皮膚組織、功能和形態(tài)的皮膚替代物。理想的組織工程支架材料不僅要有利于種子細胞的增殖、分化，而且也能與機體很好的結合并發(fā)揮相應的功能作用。膠原蛋白-殼聚糖復合材料由于具有適宜的三維多孔結構，有利于細胞的增殖分化等，在組織工程皮膚支架材料方面已得到了廣泛的應用。

余丕軍［15］等發(fā)現(xiàn)，膠原蛋白-殼聚糖（80：20）復合納米纖維膜具有優(yōu)異的生物力學性能、生物相容性和生物可降解性。用膠原蛋白-殼聚糖（80:20）復合納米纖維膜覆蓋SD大鼠背部全層皮膚缺損創(chuàng)面后并打包固定，修復14天后創(chuàng)面已基本對合、干痂，且與普通紗布敷料覆蓋創(chuàng)面實驗組相比，膠原蛋白-殼聚糖復合納米纖維膜能更好的促進創(chuàng)傷修復、愈合。黃愛賓等［16］研制了一種膠原-磺化羧甲基殼聚糖/硅橡膠皮膚再生材料，并以小型豬為模型，考察了其對燙傷全層皮膚缺損的修復性能，結果發(fā)現(xiàn)，該皮膚再生材料具有更快的血管化性能，且經(jīng)該材料處理的創(chuàng)面能有效支持薄自體皮片的移植成活，實現(xiàn)深度燙傷創(chuàng)面的全層修復。王新剛等［17］構建一種含有PLGA編織網(wǎng)/膠原-殼聚糖復合支架（PCCS）的連續(xù)性真皮再生模板，植入大鼠皮下觀察，結果發(fā)現(xiàn)，連續(xù)性真皮再生模板具有優(yōu)良的機械性能，合適的三維多孔結構和快速誘導組織、細胞及血管長入的潛能，作為真皮替代物具有一定的應用前景。Gingras等［18］將人成纖維細胞和角質(zhì)形成細胞接種于膠原-殼聚糖海綿上，體外培養(yǎng)31天后植入裸鼠背部，移植60天后可觀察到皮膚神經(jīng)的生長，表明三維結構的膠原-殼聚糖海綿可促進皮膚神經(jīng)的生長，有望成為組織工程皮膚支架材料。Ma等［11］采用冷凍干燥法制備得到膠原和殼聚糖支架，并經(jīng)過戊二醛交聯(lián)，體外培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞的實驗和體內(nèi)動物實驗都表明，膠原和殼聚糖支架可以保持膠原蛋白原有良好的細胞相容性，并有效地促進細胞的浸潤和增殖，可作為真皮替代物研究。

2.2組織工程角膜修復材料

近年來，角膜組織工程的興起為組織工程人角膜和組織工程人角膜基質(zhì)的體外重建以及患者通過臨床角膜移植重建光明帶來了新的希望［19～20］。在運用組織工程技術構建組織工程角膜時，支架材料的選擇成了制約組織工程角膜構建的重要環(huán)節(jié)。目前，用于構建組織工程角膜的支架材料主要有膠原、殼聚糖、異種角膜基質(zhì)等天然材料，此外，還包括一些人工合成材料和復合材料等。復合的膠原和殼聚糖支架與其他組織工程支架材料相比，在可降解性、免疫原性、安全性、生物相容性等方面具有較明顯的優(yōu)勢。

賈卉等［21］探討以膠原-殼聚糖為生物支架構建角膜基質(zhì)細胞復合膜及其生物相容性，采用活體前節(jié)OCT、Cs-4檢查和離體組織學及免疫組化觀察結果顯示，兔和人角膜基質(zhì)細胞在膠原-殼聚糖共混膜上生長良好，移植后復合膜逐漸發(fā)生降解，角膜組織未發(fā)生壞死和溶解，角膜上皮、基質(zhì)和內(nèi)皮細胞形態(tài)結構正常，認為膠原-殼聚糖可作為角膜基質(zhì)構建的生物支架。王迎軍等［22］發(fā)現(xiàn)，人角膜緣上皮細胞能在支架上較好地粘附和增殖分化，顯示復合膜支架具有良好的細胞親和性，認為殼聚糖-膠原復合膜有望成為一種性能良好的角膜組織工程支架。丁勇等［23］探討了殼聚糖-膠原共混膜作為載體體外培養(yǎng)兔角膜基質(zhì)細胞的可行性，結果發(fā)現(xiàn)傳代細胞具有角膜基質(zhì)細胞的生物特性，殼聚糖-膠原共混膜適合角膜基質(zhì)細胞傳代培養(yǎng)。侯江平等［24］研究了殼聚糖-膠原復合膜植入角膜內(nèi)不同部位的生物相容性，分別在兔角膜周邊基質(zhì)層和中央基質(zhì)層間植入，不同時間取出做組織切片觀察，植入兔角膜中央基質(zhì)層的早期眼表穩(wěn)定，但是兩周過后伴隨著材料的緩慢降解，材料周邊變得不透明，伴隨著炎癥細胞浸潤，最終完全溶解；植入角膜周邊基質(zhì)層間后在短時間內(nèi)能完全降解，適宜作為角膜修復材料，特別是作為角膜緣干細胞的載體，可以用來修復角膜緣干細胞損傷引起的角膜疾病。

2.3組織工程骨修復材料

自體骨移植被認為是骨缺損修復的金標準，但由于來源有限而受到限制，近年來，組織工程學的興起使得骨缺損修復有了新的治療可能。如羥基磷灰石和生物陶瓷燈無機成分等可以作為骨的替代物，但這些無機成分與人體組織有一定的差別，故不少學者將目光轉(zhuǎn)向了與人體組織更接近的膠原和殼聚糖等有機成分的材料。很多研究表明，膠原和殼聚糖復合支架材料可為細胞提供吸附和生長的空間，有望成為骨修復的新型材料［25～26］。

單程等［27］采用先后于-20°C和液氮中冷凍的預凍方式，冷凍干燥法制備膠原-殼聚糖雙層仿生支架，對比了純殼聚糖支架、純膠原支架、膠原殼聚糖復合材料單層支架和仿生多層支架的力學性能。結果膠原和殼聚糖的復合存在化學反應，復合材料可以形成更好的多孔結構，仿生多層支架從上至下分別具有致密層結構，圓形孔結構和垂直孔結構，仿生多層軟骨支架的結構接近于天然關節(jié)軟骨多層結構，有望更好地維持軟骨細胞表型和提高軟骨損傷修復效果。初殿偉等［28］構建兔骨髓間充質(zhì)干細胞/殼聚糖-膠原支架復合體，探討該支架作為軟骨組織工程支架的可行性。將第3代兔骨髓間充質(zhì)干細胞接種于支架內(nèi)，構建細胞/支架復合體，細胞/支架共培養(yǎng)24h、48和72 h后，骨髓間充質(zhì)干細胞可滲入支架多孔結構內(nèi)，并黏附在支架上成簇生長，部分細胞已與支架融合，證明殼聚糖-膠原支架基本符合軟骨組織工程支架要求，能夠作為種子細胞的承載體。于洪宇等［29］建立了殼聚糖-膠原蛋白支架材料結合干細胞誘導分化移植給動物模型，觀察了殼聚糖-膠原凝膠復合骨髓間充質(zhì)干細胞修復兔關節(jié)軟骨缺損的組織學變化，結果發(fā)現(xiàn)，大部分軟骨缺損區(qū)被新生軟骨修復，提示應用骨髓間充質(zhì)干細胞結合殼聚糖-膠原蛋白復合物可以修復關節(jié)軟骨缺損。Shi等［30］采用凍干法，將Ⅰ型膠原蛋白和脫乙酰度為88%的殼聚糖制備成海綿狀多孔三維支架，該支架具有良好的孔洞結構，交聯(lián)后力學強度也得到了明顯的提高。皮下種植試驗證明其生物相容性和可降解性良好，體外培養(yǎng)軟骨細胞和支架復合物，發(fā)現(xiàn)支架促進了軟骨細胞的增殖、分化并維持其表型。

2.4其他應用

膠原-殼聚糖復合支架在組織工程支架領域還有很多其他方面的應用，如有諸多在心臟瓣膜、周圍神經(jīng)、牙周組織工程等領域［31～33］的應用研究。付建華等［34］探討應用骨髓基質(zhì)干細胞誘導分化的內(nèi)皮細胞為種子細胞，膠原-殼聚糖復合物為支架材料，運用組織工程學的原理和方法體外構建組織工程心臟瓣膜的可行性，結果表明，以兔主動脈壁體外分離、培養(yǎng)、傳代的平滑肌細胞、成纖維細胞和BMSCs誘導分化的內(nèi)皮細胞為種子細胞，依次種植在膠原-殼聚糖復合支架上，可以構建組織工程心臟瓣膜。Sang等［35］采用制備了含肉桂酸酯海藻酸鈉的膠原-殼聚糖神經(jīng)導管，植入大鼠12周后，神經(jīng)導管可連接大鼠坐骨神經(jīng)的間隙，可用于周圍神經(jīng)再生。Shi等［36］研制了殼聚糖-膠原復合TGF-β微球的復合支架，體外細胞培養(yǎng)后，通過MTT檢測細胞增殖，共聚焦顯微鏡觀察細胞三維生長，發(fā)現(xiàn)支架可以促進細胞的生長，對促進牙周組織再生具有可行性。何曉寧等［37］將體外培養(yǎng)牙周韌帶細胞接種于殼聚糖膠原支架上，結果發(fā)現(xiàn)該支架可以作為牙周韌帶細胞的載體，對牙周韌帶細胞的粘附、增殖及細胞外基質(zhì)的合成均有較好地促進作用。

3.面臨的問題

盡管膠原-殼聚糖支架材料在組織工程中的應用非常廣泛，但大部分還處于研究階段，且對用于組織工程的膠原-殼聚糖支架材料的研究仍不夠全面，支架材料仍然存在許多缺點。如力學強度有限、降解速率與新生組織的生成速率匹配性不佳、材料與宿主的整合性差、材料缺乏表面特異性等。因此，膠原蛋白-殼聚糖復合材料不是萬能的，根據(jù)不同的用途，可能要加入一些其他的材料與其共混，以更好的符合不同目標組織的需求。此外，就兩者共混比例而言，不同的用途其混合比例也有差別，且多數(shù)研究結果離臨床應用尚有一定的距離，這仍然需要更多的組織工程研究者共同努力來解決。

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邁瑞化學發(fā)光骨代謝免疫檢測套餐，覆蓋維生素D，PTH，CT，以國際溯源參考方法為量值基礎，實現(xiàn)18分鐘高速結果回報，第二代PTH抗體設計，最長56天在機穩(wěn)定性滿足各級臨床終端的使用需求，骨代謝三項對高低鈣血癥，骨質(zhì)疏松、佝僂病、軟骨病、慢性腎病、甲狀旁腺疾病、骨髓瘤、甲狀腺癌等具備高度特異性。邁瑞化學發(fā)光傳染病免疫檢測套餐，覆蓋術前八項測試，以國際溯源參考體系為量值基礎，實現(xiàn)乙肝定量跟蹤，覆蓋灰區(qū)樣本研究，重點關注突變株和變異株檢測，通過德國法蘭克福血站CE標準檢測滿足臨床檢測需求，HIV第四代試劑全國CDC考評，靈敏度和特異性獲得最佳結果。

Application of Collagen and Chitosan Composites in Tissue Engineering Scaffold

LIN hong-sai1HUANG yong-fu1YUE wei-hua1WANG chun-ren2
1 Beijing institute of medical device testing（Beijing101111）2 National institutes for food and drug control（Beijing100050）

A review about application of collagen and chitosan composite as a tissue engineering scaffold in the field of skin repair， cornea repair and bone repair. It indicated that collagen and chitosan composites had become a research hotspot in the each field of tissue engineering scaffold material. While the collagen and chitosan composite was not a panacea， according to different purposes，blending other material to meet the demand of different organizational goals is superable.

tissue engineering scaffold， collagen， chitosan， composite material

1006-6586（2016）10-0012-05

R318

A

2016-05-23