羅　杰　王建沅　周成旭　嚴小軍　徐繼林　駱其君　馬　斌　吳小凱

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211）

紅光下培養(yǎng)方式對雨生紅球藻細胞增殖及其活力的影響

羅杰王建沅周成旭嚴小軍徐繼林駱其君馬斌吳小凱

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院，寧波 315211）

雨生紅球藻；綠色細胞；紅光；培養(yǎng)方式

研究重點針對雨生紅球藻綠色游動細胞的增殖培養(yǎng)階段，分析了在利于細胞增殖的紅光條件下，幾種培養(yǎng)方式的調(diào)整對增殖過程和細胞活力的影響。結(jié)果顯示：（1）在紅光下，增殖平臺期維持時間長，細胞活力穩(wěn)定，細胞中性脂無累積，但進入平臺期前，細胞中性脂有規(guī)律波動，進入平臺期后相對穩(wěn)定； 通過更新率為20%的半連續(xù)培養(yǎng)，細胞數(shù)產(chǎn)出較批次培養(yǎng)提高57%； 半連續(xù)培養(yǎng)中細胞呈現(xiàn)脅迫調(diào)節(jié)的時間較批次培養(yǎng)晚。隨著培養(yǎng)時間增加，半連續(xù)培養(yǎng)下細胞營養(yǎng)鹽吸收能力降低。（2）初始接種密度與細胞增殖速率及細胞光合活力呈負相關(guān)：初始密度低的細胞增殖速率較高，細胞光合作用活力高。（3）在培養(yǎng)過程中添加CO2時，最大密度均有提高，達6.0×105cells/mL，較無添加組提高54%； 細胞分裂速率均有提高，但紅光下較白光下增殖速率高（分別為0.223/d和0.198/d）； 添加CO2降低培養(yǎng)液pH，利于維持適宜增殖的pH環(huán)境。葉綠素?zé)晒鈪?shù)以及細胞粒徑在紅光和白光下有顯著差異：紅光下，F(xiàn)v/Fm顯著高于白光下； 紅光下補充CO2顯著減小細胞粒徑，而白光下粒徑無顯著變化。研究結(jié)果顯示，在紅光下，采用間斷式半連續(xù)培養(yǎng)補充CO2培養(yǎng)綠色游動細胞，有利于提升細胞活力與產(chǎn)出。

蝦青素是一種次生類胡蘿卜素，具有艷麗的色澤以及強的抗氧化能力，被應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖、食品添加劑、化妝品和醫(yī)藥等眾多領(lǐng)域［1］。能合成蝦青素的生物有甲殼類生物、酵母以及一些微型藻類。蝦青素也可人工合成［2］。雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）是一種淡水單細胞綠藻。其休眠孢囊內(nèi)蝦青素含量可占到細胞干重的4%［3］。不僅如此，紅球藻來源的天然蝦青素生物活性及其安全性均高于人工合成蝦青素或其他生物來源的蝦青素［4，5］，因此，紅球藻是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)蝦青素的理想材料。

培養(yǎng)雨生紅球藻生產(chǎn)蝦青素的工業(yè)實踐依賴于紅球藻的生物學(xué)特征。紅球藻生活史周期有典型的綠色游動細胞期和紅色休眠孢囊期。綠色游動細胞具有高的光合效率及細胞活性，以及活躍的細胞分裂能力，是紅球藻生產(chǎn)中實現(xiàn)高生物量的關(guān)鍵階段； 受環(huán)境條件脅迫時，細胞逐漸轉(zhuǎn)入紅色休眠孢囊階段，此期細胞分裂速率下降并大量累積蝦青素［6］，是蝦青素生產(chǎn)的關(guān)鍵階段。因此，工業(yè)生產(chǎn)上常采用兩步法培養(yǎng)［7，8］：第一步，綠色細胞增殖培養(yǎng)，以獲得最大生物量為階段目標； 第二步，通過光、鹽、營養(yǎng)鹽脅迫或添加胡蘿卜素合成的前體底物等手段［9，10］，達到蝦青素最大最優(yōu)化累積。另外，細胞在兩步驟轉(zhuǎn)換過程中可能因脅迫造成死亡而造成生產(chǎn)損失，轉(zhuǎn)換界面階段細胞狀態(tài)也是整個工藝流程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［11］。并且，對高活力的營養(yǎng)細胞進行脅迫，所能合成的蝦青素比細胞活力低的細胞合成的蝦青素含量更高［12—14］。因此，以高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)蝦青素為目標進行紅球藻培養(yǎng)時，獲得最大密度且高活力的綠色細胞是產(chǎn)量與質(zhì)量的基礎(chǔ)保障［15］。但是，生產(chǎn)實踐中一個關(guān)鍵的瓶頸即是綠色游動細胞生物量低［16，17］，細胞密度一般都低于5.0×105cells/ mL［18］。其原因與紅球藻細胞對環(huán)境條件變化異常敏感有關(guān)，常造成培養(yǎng)過程中的細胞分裂速度慢、活力低。因此，如何優(yōu)化綠色細胞增殖條件獲得最大最優(yōu)化細胞產(chǎn)出是第一步生產(chǎn)的關(guān)鍵。

光強和光質(zhì)都對細胞分裂、細胞狀態(tài)及其周期間轉(zhuǎn)化產(chǎn)生影響［19］。紅色光質(zhì)能促進雨生紅球藻綠色細胞生長已被大多數(shù)研究者所接受并不斷進行其條件優(yōu)化的研究［14，20，21］。吳霞等將紅色轉(zhuǎn)光膜應(yīng)用于紅球藻養(yǎng)殖，發(fā)現(xiàn)生物量明顯得到了改善，比普通聚乙烯塑料薄膜提高了8.8%以上［22］。在綠色細胞培養(yǎng)階段，增加紅色光質(zhì)比例可以明顯利于綠色細胞增殖［23］。王建沅等［24］研究了紅光下紅球藻增殖過程受營養(yǎng)鹽調(diào)節(jié)特征發(fā)現(xiàn)，由于起始營養(yǎng)鹽濃度對初期增殖、細胞最大產(chǎn)量以及增殖時間都有影響，認為半連續(xù)培養(yǎng)是適宜紅球藻綠色細胞生長的一種培養(yǎng)方式。雖然不少研究已經(jīng)證明，光質(zhì)在紅球藻生產(chǎn)蝦青素全程具有重要的作用，尤其是兩步培養(yǎng)法工藝中分別提供紅、藍單色光質(zhì)可有效提高階段目標培養(yǎng)物產(chǎn)量，并且LED光照技術(shù)也為優(yōu)化工藝提供了條件。但是，分段分光質(zhì)方法尚未廣泛應(yīng)用到實際生產(chǎn)中、紅球藻不同株系特征及其各種養(yǎng)殖條件常各不相同，要保障成功且可持續(xù)優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)，尚需大量綜合研究與分析。

本研究針對雨生紅球藻綠色細胞培養(yǎng)階段的優(yōu)化調(diào)節(jié)進行研究，分析紅光條件下幾種培養(yǎng)方式對細胞增殖及其過程的影響。主要比較了批次培養(yǎng)和半連續(xù)培養(yǎng)的過程差異； 批次培養(yǎng)方式下，不同初始接種密度對細胞增殖過程的影響； 以及批次培養(yǎng)中補充CO2對細胞增殖過程及細胞粒徑的影響，以期為紅球藻生產(chǎn)工藝優(yōu)化提供理論參考。

1　材料與方法

1.1藻種與培養(yǎng)基

雨生紅球藻購于中科院水生所，品系為797。于寧波大學(xué)微藻種質(zhì)室保種，保種及實驗所用培養(yǎng)基為BG11或NMB3#培養(yǎng)基［24］。

1.2實驗方法與條件設(shè)置

紅光條件下，紅球藻的半連續(xù)培養(yǎng)與批次培養(yǎng)過程比較取預(yù)培養(yǎng)至指數(shù)期藻液，接種至6個裝有新鮮配制NMB3#培養(yǎng)基的錐形瓶中，初始接種密度為3.2×104cells/mL，體積為400 mL。各取3瓶設(shè)置批次培養(yǎng)和半連續(xù)培養(yǎng)目標。半連續(xù)培養(yǎng)方式下，待各組增殖至平臺期時，進行更新處理，每次更新20%，共進行3次間隔時間為6d的更新（F1、F2、F3）。各組均置于溫度為23℃、紅色LED光照為36 μmol/（m2·s）（L∶D=12∶12）的培養(yǎng)室中。在培養(yǎng)過程中，隔天分別取樣，檢測葉綠素?zé)晒鈪?shù)、細胞密度、氮磷營養(yǎng)鹽濃度變化以及細胞中性脂變化。用Water-PAM葉綠素?zé)晒鈨x檢測葉綠素?zé)晒鈪?shù)。細胞密度以浮游植物計數(shù)框計數(shù)（北京普利特儀器公司）。氮磷濃度以Smartchem 全自動化學(xué)分析儀200分析，實驗中取水樣凍存，待全部實驗結(jié)束后低溫避光解凍后檢測。細胞中性脂檢測參考王金娜等［25］的方法，以尼羅紅試劑進行細胞染色后，檢測吸光值進行分析。

在紅光條件下不同初始接種密度對紅球藻批次培養(yǎng)細胞增殖及其過程的影響取預(yù)培養(yǎng)至平臺初期紅球藻液，密度約為5.0×104cells/mL，以新鮮配制NMB3#培養(yǎng)液進行稀釋，形成不同稀釋度的4組初始接種密度，稀釋比例分別為：密度Ⅰ（藻液/培養(yǎng)液=1∶5）、密度Ⅱ（藻液/培養(yǎng)液=1∶10）、密度Ⅲ（藻液/培養(yǎng)液=1∶15）、密度Ⅳ（藻液/培養(yǎng)液= 1∶20）。實驗水體200 mL，設(shè)置3個平行實驗。置于溫度為25℃、紅色LED光照為65 μmol/（m2·s）（L∶D=12∶12）的培養(yǎng)室中。每日上下午各搖瓶一次。隔天分別取樣檢測細胞密度和葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化。

添加CO2對批次培養(yǎng)細胞增殖過程及其細胞大小的影響取預(yù)培養(yǎng)至指數(shù)期的藻液（1.5×105cells/ mL） 500 mL，接種至1000 mL BG11培養(yǎng)液中（3000 mL錐形瓶，培養(yǎng)水體體積1500 mL），初始密度為5.0×104cells/mL。為了比較復(fù)合白色光源和紅色LED光源下微藻受CO2影響的差異，本研究于相同光強的白光與紅光條件下，分別設(shè)置CO2添加組與不加CO2的對照組，形成紅光實驗組（加CO2）RLED+ CO2和對照組RLED以及白光實驗組（加CO2）CWh+ CO2及其對照組CWh。各3平行，置于溫度為25℃，光照強度為30 μmol/（m2·s）（L ：D=12 ：12）的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，每日定期搖瓶三次。采用4L CO2鋼瓶，通過磁力閥以及CO2細化器，通入微量細化CO2，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，CO2添加組的添加量設(shè)為0.3 mL/min，晝通夜關(guān)。每12h 取樣檢測培養(yǎng)液pH，隔天檢測葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm。為了分析細胞大小在培養(yǎng)過程中的相應(yīng)變化，本實驗隔天取樣，以CASY顆粒計數(shù)儀（Innovatis，Germany）檢測細胞數(shù)和細胞粒徑。

1.3數(shù)據(jù)分析

其中：N為T天時的細胞濃度，N0為初始細胞濃度。

細胞生產(chǎn)力［cells/（mL·d）］按以下公式計算［26］：細胞生產(chǎn)力=，

其中：Ct1與Ct2分別為t1、t2所對應(yīng)的細胞密度。

氮磷營養(yǎng)鹽消耗速率的計算方法：r（%/d）=

數(shù)據(jù)采用Excel 2003軟件進行制圖，采用SPSS 13.0單因素方差分析（one way ANOVA）執(zhí)行Duncan檢測分析條件的顯著性（P＜0.05說明條件影響顯著）。采用Bivariate過程pearson相關(guān)系數(shù)雙邊檢驗進行數(shù)據(jù)分析（P＜0.05說明相關(guān)性顯著，P＜0.01說明變量之間相關(guān)性極顯著）。

2　結(jié)果

2.1在紅光條件下紅球藻的半連續(xù)培養(yǎng)與批次培養(yǎng)過程比較

細胞密度變化紅球藻在實驗設(shè)置的光照條件下能維持穩(wěn)定的細胞增殖，并且在進入平臺期后，批次培養(yǎng)及半連續(xù)方式下，藻細胞均能較長時間維持于綠色游動細胞狀態(tài)而不下沉。細胞增殖情況如圖1A所示。對半連續(xù)方式實驗組，分別在培養(yǎng)的第18、第24、第30天進行20%更新。由圖中結(jié)果可以看出，在細胞增殖至平臺初期后，進行第1次更新時（18d），細胞密度回落至2.2×105cells/mL，但能在2d內(nèi)增殖至更新前相同水平（3.3×105cells/mL），而從相似密度的指數(shù)增長期細胞（10d）批次培養(yǎng)增殖至該密度時需要8d時間。從細胞生產(chǎn)力角度的分析結(jié)果（圖1B）可以看出，半連續(xù)培養(yǎng)方式可以顯著提高細胞生產(chǎn)力：其細胞生產(chǎn)力顯著大于批次培養(yǎng)平臺期的細胞生產(chǎn)力（P＜0.05）。由批次培養(yǎng)最后收獲（36d，3平行總計）的細胞數(shù)為2.1×108cells，半連續(xù)培養(yǎng)下總計收獲的細胞數(shù)為3.3×108cells，提高57%。從圖1B還可以看出，進行半連續(xù)培養(yǎng)時，3次不同更新時間下細胞增殖能力有所不同，平臺初期更新細胞的增殖恢復(fù)最快，細胞生產(chǎn)力最高，平臺后期更新時，細胞生產(chǎn)力顯著降低（P＜0.05）。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化由圖2可以看出，在半連續(xù)培養(yǎng)方式下，更新培養(yǎng)液能顯著提高細胞的光合能力。批次培養(yǎng)至平臺后期時，F(xiàn)v/Fm和qP均下降，說明此時細胞光合能力相對下降，電子傳遞速率也趨于下降。而在半連續(xù)培養(yǎng)方式下，更新培養(yǎng)液后的Fv/Fm、qP和ETR均恢復(fù)至高于批次培養(yǎng)組，說明其細胞光合能力提高。從NPQ的變化特征來看，指數(shù)增殖及平臺前期和中期細胞的NPQ值相對穩(wěn)定且數(shù)值較低，批次培養(yǎng)至平臺后期時NPQ值顯著增加，半連續(xù)培養(yǎng)在第3次更新后期NPQ值也相對增加，說明細胞提高光保護響應(yīng)。半連續(xù)培養(yǎng)方式下NPQ提高的時間較批次培養(yǎng)時間推遲，顯示細胞響應(yīng)變化延后。

培養(yǎng)液氮磷營養(yǎng)鹽消耗特征在實驗設(shè)置的營養(yǎng)鹽條件下，營養(yǎng)鹽消耗迅速，8—10d 后，氮磷營養(yǎng)鹽均消耗至低水平（圖3A，B），細胞增殖進入平臺前期。批次培養(yǎng)時，進入平臺期后，氮磷營養(yǎng)鹽維持低值，細胞數(shù)量穩(wěn)定。在半連續(xù)培養(yǎng)方式下，更新培養(yǎng)液后，對氮的消耗迅速，3次更新的每日消耗率依次為42%、40%和33%，前面的兩次更新后，氮濃度迅速均回復(fù)低水平。第3次更新時，氮的消耗速率降低，后續(xù)消耗率維持在16%—22%，顯示隨著更新次數(shù)增加，對營養(yǎng)鹽消耗速率降低。指數(shù)增殖期對磷的消耗率與氮消耗有相似的特點，指數(shù)期最高（圖3C，D），批次培養(yǎng)進入平臺期后，仍然有磷元素的吸收消長。在半連續(xù)更新培養(yǎng)中，磷的消耗速率較氮消耗速率低（P＜0.05）。

圖1　半連續(xù)培養(yǎng)與批次培養(yǎng)中雨生紅球藻細胞密度及細胞生產(chǎn)力變化Fig. 1　The cell growth and productivity in batch culture and fed-batch culture

圖2　半連續(xù)培養(yǎng)與批次培養(yǎng)過程中細胞葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化Fig. 2　The change of chlorophyll fluorescence parameters in batch culture and fed-batch culture

圖3　半連續(xù)培養(yǎng)與批次培養(yǎng)方式下氮磷營養(yǎng)鹽消耗特征Fig. 3　Nitrogen and phosphorus consumptions in batch culture and fed-batch culture

細胞中性脂變化以尼羅紅熒光染料對紅球藻細胞中性脂進行染色，通過檢測細胞熒光強度變化，分析細胞增殖過程中中性脂的相對變化特征，結(jié)果如圖4所示。從圖中可以看出，在整個培養(yǎng)過程中，單位細胞中性脂的熒光值變化處于最低4最高10的相對區(qū)間中，全程平均為6.0 FI/cell，且培養(yǎng)始末的中性脂水平相當（7.0 FI/cell）； 從接種初始到細胞指數(shù)增殖時期至平臺前期（0—16d），細胞中性脂含量呈規(guī)律升降波動狀態(tài)，進入平臺期后，升降變化消失，單位細胞中性脂含量相對穩(wěn)定。雖然圖4顯示平臺后期批次培養(yǎng)的單位細胞中性脂低于半連續(xù)培養(yǎng)組，但因指數(shù)期時即顯示該特征，可能與兩種培養(yǎng)方式無關(guān)。在3次更新中，細胞中性脂沒有顯著的變化（P＞0.05）。

圖4　半連續(xù)培養(yǎng)與批次培養(yǎng)方式下紅球藻細胞中性脂的相對變化Fig. 4　The variation of cellular neutral fatty acid in batch culture and fed-batch culture

2.2在紅光條件下，不同初始接種密度對紅球藻批次培養(yǎng)細胞增殖過程影響

細胞密度的變化不同初始密度下藻細胞增殖情況如圖5所示。從圖中可以看出，在本研究的接種密度下，細胞迅速增殖沒有停滯期。初始密度高的藻細胞其增殖速率越低，呈反相關(guān)關(guān)系（圖6）。在增殖結(jié)束后，較低密度的Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ組最終生物量無顯著差異（P＞0.05）。

圖5　不同初始接種密度下雨生紅球藻的細胞增殖Fig. 5　The cell proliferation from different initial cell densities

葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化不同初始密度接種時，初始密度高的藻細胞光合活性明顯低于初始密度低的光合活性，表現(xiàn)為初始密度高的密度Ⅰ組Fv/Fm和ETR在培養(yǎng)全程處于相對低水平，F(xiàn)v/Fm僅在其初始狀態(tài)以下波動； 而初始密度相對較低的密度Ⅲ和密度Ⅳ組，F(xiàn)v/Fm和ETR較初始水平有一定的提升。這說明初始密度差異可影響細胞光合能力，初始接種密度低有利于提高細胞光合能力。但是NPQ和qP各組之間全程沒有顯著性差異（P＞0.05）。

圖6　不同初始接種密度下的紅球藻細胞增殖速率Fig. 6　The cell growth rate of different initial cell densities

2.3添加CO2對批次培養(yǎng)細胞增殖過程及細胞大小的影響

細胞密度及細胞粒徑變化本實驗采用對靜置培養(yǎng)的雨生紅球藻液以細化散氣的方式添加純CO2，研究白色日光燈光源和紅色LED光源條件下，添加CO2對綠色細胞增殖過程的影響。結(jié)果顯示：添加CO2有助于紅球藻綠色細胞的增殖，具體表現(xiàn)為延滯期顯著縮短、細胞分裂速率提高（圖8a，b）。其中，紅光和白光下通氣組細胞增殖速率分別為：0.223/d、0.198/d，無添加的對照組分別為：0.168/d、0.190/d，添加CO2對紅光下的增殖速率促進作用明顯。從細胞大小變化來看，紅光下添加CO2實驗組細胞粒徑顯著小于對照組（P＜0.05）（圖8c）。其中，實驗組平均粒徑為（14.6±2.4） μm，對照組為（17.6±2.6） μm。在 白光下添加CO2比對照組細胞粒徑雖有降低但無顯著性差異（P＞0.05）（圖8d）。對細胞生產(chǎn)力分析結(jié)果也顯示（圖9），在紅光下添加CO2對細胞生產(chǎn)力有顯著促進作用（P＜0.05），在白光下則無穩(wěn)定的促進作用，其后期的對照組細胞生產(chǎn)力大于實驗組。

藻液pH及藻細胞光合能力（Fv/Fm）變化兩種光照條件無添加C O2情況下，p H維持在10.0±0.5的較高水平，并呈現(xiàn)出“晝升夜降”的穩(wěn)定波動（圖10A，B）。在添加CO2的實驗組中，培養(yǎng)液pH均顯著下降，在本實驗中添加細化后的純CO2，pH可維持在7—8，使紅球藻處于最適pH環(huán)境。

在不同光照條件下，以細化散氣方式添加純CO2對光系統(tǒng)Ⅱ的最大光合效率Fv/Fm的影響主要體現(xiàn)在細胞增殖后期，此期紅光下與白光下實驗組的Fv/Fm均顯著大于無CO2對照組（P＜0.05）（圖10C，D）。說明添加CO2可有助于提升紅球藻綠色細胞的光合作用活力。

圖7　不同初始接種密度下的紅球藻細胞增殖過程中的葉綠素?zé)晒鈪?shù)變化Fig. 7　The variation of chlorophyll fluorescence parameters during cell proliferation from different initial cell densities

圖8　紅光與白光條件下通入CO2對細胞增殖與細胞粒徑變化的影響Fig. 8　The cell growth and cell size under red and white light conditions with CO2bubbling in or not

3　討論

獲得最大生物量是雨生紅球藻生產(chǎn)中的第一要務(wù)。提升生物量的前提需提升紅球藻綠色細胞活力［27］。因為，雖然蝦青素的含量及合成速率在紅球藻各個生活周期中顯著不同，但蝦青素的積累速率在游動細胞和不動細胞中是相同的，游動細胞中蝦青素含量低是因為它的合成速率遠低于細胞的分裂速率［6］。所以，任何可限制細胞分裂的因素都會導(dǎo)致細胞分裂速率下降，從而導(dǎo)致個體細胞內(nèi)蝦青素的快速累積。因此在紅球藻的培養(yǎng)中可著眼于游動細胞活力的提升。

圖9　紅光與白光條件下添加CO2對細胞生產(chǎn)力的影響Fig. 9　The cell productivity under red and white light conditions with CO2bubbling in or not

圖10　添加CO2差異條件下培養(yǎng)液pH與藻細胞Fv/Fm變化Fig. 10　The variation of pH and Fv/Fmin different CO2condition

3.1紅光下半連續(xù)培養(yǎng)利于提升細胞數(shù)量及細胞活力

光照影響雨生紅球藻營養(yǎng)生長和轉(zhuǎn)紅，也是光生物反應(yīng)器設(shè)計和開發(fā)過程中需要考慮的關(guān)鍵因素之一。紅球藻細胞對光的變化異常敏感，不同波長的光質(zhì)在生產(chǎn)兩個階段可能產(chǎn)生互逆的影響。綠色游動細胞階段提供適宜光強的紅光，消除了白光環(huán)境下因短波長光照對綠色游動細胞造成的脅迫，有利于其細胞維持長時間的綠色游動狀態(tài)，維持高光合潛能以及增殖活力，從而有利于實施半連續(xù)培養(yǎng)方式。本研究結(jié)果顯示，批次培養(yǎng)下平臺期維持較長時間，光合熒光參數(shù)顯示其細胞光合能力穩(wěn)定，中性脂沒有顯著累積。中性脂通常是細胞受到脅迫時大量累積［28］，說明細胞沒有受到相關(guān)脅迫。但中性脂含量在增殖過程中的波動與細胞色素組成變化是否有相關(guān)性值得深入研究。半連續(xù)培養(yǎng)的細胞產(chǎn)出較批次培養(yǎng)大。光合熒光參數(shù)在每次更新時能恢復(fù)至批次培養(yǎng)時的水平，同期中性脂相對高于批次培養(yǎng)組，但未超出初始狀態(tài)。在培養(yǎng)后期，細胞密度仍然穩(wěn)定時，批次培養(yǎng)的NPQ值顯著增加，顯示細胞出現(xiàn)自我保護的代謝。半連續(xù)培養(yǎng)NPQ后期也顯著提高，說明此方式下細胞相應(yīng)的光保護代謝只是推遲但是仍然出現(xiàn)。Wang等［11］研究認為，以已經(jīng)開始脅迫保護的營養(yǎng)細胞進行脅迫轉(zhuǎn)紅，有利于保護更多的細胞不受損失并且能累積更大量的蝦青素。紅球藻增殖后的培養(yǎng)液中會累積抑制細胞進一步增殖或抑制細胞活力的物質(zhì)。因此，生產(chǎn)工藝上，是長期批次培養(yǎng)的綠色細胞還是半連續(xù)培養(yǎng)獲得的更多細胞更利于轉(zhuǎn)紅培養(yǎng)，尚待研究證明。

3.2補充CO2促進雨生紅球藻生長以及降低細胞粒徑

紅球藻培養(yǎng)過程中pH會不斷上升，常常達10.0以上。但大多數(shù)的研究顯示，紅球藻生長的最適pH在中性偏堿的環(huán)境［29］。本研究無CO2添加組最高pH可達10.7，但細胞仍能增殖，光合熒光參數(shù)亦無顯著下降，說明紅球藻對高pH環(huán)境有一定的耐受性，這與崔寶霞等［30］的研究結(jié)果相似。但是，單純調(diào)節(jié)pH變化對紅球藻增殖的影響不明顯，增殖過程中，通過酸堿調(diào)節(jié)pH在6.8—10.0，其增殖能力沒有顯著差異［13，14］。韋韜等［31］研究發(fā)現(xiàn)，較高濃度的CO2（600 cm3/m3）有利于綠色細胞光合作用的進行，同時維持培養(yǎng)液的pH在合適的范圍，從而促進紅球藻的快速生長。本研究發(fā)現(xiàn)，紅光下補充CO2不僅能使pH處于適宜范圍，還可以顯著影響細胞增殖和光合能力，并能降低細胞粒徑。

紅球藻細胞粒徑變化在生產(chǎn)工藝的改進上可能有重要意義。在綠色細胞培養(yǎng)中，因細胞年齡、不同遮光等原因，造成一次培養(yǎng)物中不同的細胞所含細胞色素各異，形成細胞均質(zhì)性差異大，是紅球藻綠色細胞高密度增殖局限的重要原因。不同于其他微型藻類，紅球藻群體中單細胞可獲得條件的優(yōu)化是一個重要環(huán)節(jié)。紅球藻細胞具有特征性的透明質(zhì)套狀的細胞壁，該細胞壁與原生質(zhì)體之間的距離隨條件變化有明顯的差異。即使不考慮該特征與處于培養(yǎng)水體中細胞與細胞間的空間競爭是否相關(guān)，其變化必然影響細胞的大小。相對而言，小粒徑細胞比大粒徑細胞更利于形成高密度且高活力細胞群體，從而為高質(zhì)高產(chǎn)的蝦青素提供細胞基礎(chǔ)。紅光下細胞粒徑與最大光合潛能（Fv/Fm）呈極其顯著的負相關(guān)。這說明細胞粒徑越小細胞的光合潛能越大、細胞生產(chǎn)力越高。Hata等［32］在小體積培養(yǎng)（500 mL）過程中能達到6.8 cells/（mL·d）的生產(chǎn)力。Kaewpintong等［33］在氣升式光生物反應(yīng)器（3000 mL）中的生產(chǎn)力為5.52 cells/（mL·d）。本研究在紅光下添加CO2時，細胞生產(chǎn)力可達5—15 cells/（mL·d）。

在實際生產(chǎn)中，充氣是一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，但是充氣的強度控制很重要，以防止氣泡剪切力的影響。紅球藻對剪切力敏感，因此有研究者認為氣升式光生物反應(yīng)器比機械攪動的反應(yīng)器更利于細胞存活和增殖［34］。氣升式供氣的同時補充一定比例的CO2

［26］。本研究提供CO2的方式為晝開夜關(guān)的細化的CO2，且為間歇式搖動的靜置培養(yǎng)。在紅光下細胞能維持相對穩(wěn)定的綠色游動細胞狀態(tài)，細胞的均質(zhì)性好，在白天增殖pH顯著上升的情況下補充CO2，使細胞沒有被過分干擾的情況下均勻增殖，細胞的均質(zhì)性好。CO2的通入可使得培養(yǎng)液中的無機碳源更多的以藻類光合作用易于吸收的自由CO2形式存在［35］，這一點在實驗結(jié)果中的最大光合潛能Fv/Fm得以體現(xiàn)，通氣組較不通氣組有顯著提升（P＜0.05）。同時，最大光合潛能Fv/Fm與細胞粒徑呈極其顯著的負相關(guān)（P＜0.01），即細胞粒徑越小細胞的光合作用效率越高。

蝦青素累積階段是營養(yǎng)鹽脅迫有利還是營養(yǎng)鹽足夠有利，不同研究結(jié)果尚各執(zhí)一詞［13，14］。一方面是不同株造成的結(jié)果差異，另一方面也可能是還沒有抓住根本性的問題：保持細胞的完整性與活力。氮營養(yǎng)鹽缺乏比高光強對蝦青素合成影響更大，因為缺氮使細胞停止分裂［36］。初始接種或規(guī)模生產(chǎn)上的細胞更新過程，都涉及到最適細胞密度與最適營養(yǎng)鹽濃度的關(guān)系問題。雖然有高的細胞產(chǎn)出，但是過高的營養(yǎng)鹽抑制初始增長［25］。本研究發(fā)現(xiàn)，相對低的初始密度組有高的細胞增殖能力以及高的光合能力，可能與單個細胞受光能力有關(guān)、細胞間相互遮光影響小。

綜合本研究結(jié)果顯示，在以培養(yǎng)綠色游動細胞為目標的培養(yǎng)階段提供紅色光照，可獲得延長的平臺期，以有利于進行半連續(xù)方式的更新培養(yǎng)，從而獲得更高活力的細胞與更高生物量。但是，部分更新培養(yǎng)數(shù)次后，細胞呈現(xiàn)變化，采用間斷式半連續(xù)培養(yǎng)方式可能更有利于提升細胞活力與產(chǎn)出。更新比例和更新次數(shù)尚有待于根據(jù)不同條件不同品系進行針對性研究。

［1］Lorenz R T，Cysewskt G R. Commercial potential for Haematococcus microalgae as a natural source of astaxanthin ［J］. Trends in Biotechnology，2000，18（4）：160—167

［2］Olaizola M. Commercial development of microalgal biotechnology：from the test tube to the marketplace ［J］. Biomolecular Engineering，2003，20（4—6）：459—466

［3］Kaczor A，Baranska M. Structural changes of carote-noid astaxanthin in a single algal cell monitored in situ by raman spectroscopy ［J］. Analytical Chemistry，2011，83（20）：7763—7770

［4］Gong X D，Chen F. Influence of medium components onastaxanthin content and production of Haematococcus pluvialis ［J］. Process Biochemistry，1998，33（4）：385—391

［5］Johnson E A，An G H. Astaxanthin from microbial source［J］. Critical Reviews in Biotechnology，1991，11（4）：297—326

［6］Chen F，Jiang Y. Microalgae Biotechnology ［M］. Beijing：China Light Industry Press. 1999，195—196 ［陳峰，姜悅.微藻生物技術(shù). 北京：中國輕工業(yè)出版社. 1999，195—196］

［7］Fábregas J，Otero A，Maseda A，et al. Two stage cultures for the production of astaxanthin from Haematococcus pluvialis ［J］. Journal of Biotechnology，2001，89（1）：65—71

［8］Harker M，Tsavalos A J，Young A J. Factors responsible for astaxanthin formation in the chlorophyte Haematococcus pluvialis ［J］. Bioresource Technology，1996，55（3）：207—214

［9］Kobayashi M，Kakizono T，Nagai S. Enhanced carotenoids biosynthesis by oxidative stress in acetate induced cyst cells of a green unicellular alga，Haematococcus pluvialis ［J］. Applied and Environmental Microbiology，1993，59（3）：867—873

［10］Fábregas J，Domínguez A，Maseda A，et al. Interactions between irradiance and nutrient availability during astaxanthin accumulation and degradation in Haematococcus pluvialis ［J］. Applied Microbiology and Biotechnology，2003，61（5—6）：545—551

［11］Wang B B，Zhang Z，Hu Q，et al. Cellular capacities for high-light acclimation and changing lipid profiles across life cycle stages of the green alga Haematococcus pluvialis ［J］. PLoS One，2014，9（9）：1—12

［12］Lababpour A，Shimahara K，Hada K，et al. Fed-Batch culture under illumination with blue light emitting diodes（LEDs） for astaxanthin production by Haematococcus pluvialis ［J］. Journal of Bioscience and Bioengineering，2005，100（3）：339—342

［13］Lababpour A，Hada K，Shimahara K，et al. Effects of nutrient supply methods and illumination with blue light emitting diodes（LEDs） on astaxanthin production by Haematococcus pluvialis ［J］. Journal of Bioscience and Bioengineering，2004，98（6）：452—456

［14］Katsuda T，Lababpour A，Shimahara K，et al. Astaxanthin production by Haematococcus pluvialis under illumination with LEDs ［J］. Enzyme and Microbial Technology，2004，35（1）：81—86

［15］Kang C D，Han S J，Choi S P，et al. Fed-batch culture of astaxanthin-rich Haematococcus pluvialis by exponential nutrient feeding and stepwise light supplementation ［J］. Bioprocess and Biosystems Engineering，2010，33（1）：133—139

［16］Lorenz R T，Cysewski G R. Commercial potential for Haematococcus microalgae as a natural source of astaxanthin ［J］. Trends in Biotechnology，2000，18（4）：160—167

［17］Olaizola M. Commercial production of astaxanthin from Haematococcus pluvialis using 25，000-liter outdoor photobioreactors ［J］. Journal of Applied Phycology，2000，12（3）：499—506

［18］Zhang Z. Biological characteristics of Haematococcus pluvialis in high cell density system ［D］. Thesis for Master of Science. Institute of Oceanology，Chinese Academy of Sciences，Qingdao. 2003 ［張展. 雨生紅球藻生物學(xué)特性的高密度效應(yīng). 碩士學(xué)位論文，中科院海洋研究所，青島. 2003］

［19］Zheng J，Hu M J，Guo Y P. Regulation of photosynthesis by light quality and its mechanism in plants ［J］. Chinese Journal of Applied Ecology，2008，19（7）：1619—1624 ［鄭潔，胡美君，郭延平. 光質(zhì)對植物光合作用的調(diào)控及其機理. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2008，19（7）：1619—1624］

［20］Hou D M. Study on the photoinduction of Haematococcus pluvialis for highly-efficient astaxanthin production［D］. Thesis for Master of Sicence. East China University of Science and Technology，Shanghai. 2014 ［侯冬梅. 雨生紅球藻高產(chǎn)蝦青素的光誘導(dǎo)工藝研究. 華東理工大學(xué)，上海. 2014］

［21］Qi A X. Studies of cultures medium and cultures modes of Haematococcus pluvialis for enhanced production of astaxanthin ［D］. Thesis for Master of Sicence. Xiamen University，Xiamen. 2006 ［齊安翔. 高產(chǎn)蝦青素的雨生紅球藻培養(yǎng)基及培養(yǎng)模式的若干研究. 碩士學(xué)位論文，廈門大學(xué)，廈門. 2006］

［22］Wu X，Kang R J，Cong W，et al. Application of sun-light conversion film on the growth of Haematococcus pluvialis ［J］. The Chinese Journal of Process Engineering，2006，6（6）：969—972 ［吳霞，康瑞娟，叢威，等. 轉(zhuǎn)光膜在雨生紅球藻養(yǎng)殖上的應(yīng)用過程. 過程工程學(xué)報，2006，6（6）：969—972］

［23］Zhang R Q. Study on Haematococcus pluvialis transformational conditions and astaxanthin extraction ［D］. Thesis for Master of Sicence. Ocean University of China，Qingdao. 2012 ［張睿欽. 雨生紅球藻細胞轉(zhuǎn)化及蝦青素的提取，中國海洋大學(xué)，山東. 2012］

［24］Wang J Y，Zhou C X，Yan X J，et al. The characteristics of growth and nutrient consumption of Haematococcus pluvialis under red light ［J］. Acta Hydrobiologica Sinica，2014，38（6）：1135—1142 ［王建沅，周成旭，嚴小軍，等.雨生紅球藻在紅光下的生長及營養(yǎng)鹽消耗特征. 水生生物學(xué)報，2014，38（6）：1135—1142］

［25］Wang J N，Yan X J，Zhou C X，et al. Screening of oilproducing microalgae and detecting dynamics of neutral lipid accumulation ［J］. Acta Biophysica Sinica，2010，26（6）：472—480 ［王金娜，嚴小軍，周成旭，等. 產(chǎn)油微藻的篩選及中性脂動態(tài)積累過程的檢測. 生物物理學(xué)報，2010，26（6）：472—480］

［26］Kamonpan K，Artiwan S，Sorawit P，et al. Photoautotrophic high-density cultivation of vegetative cells of Haematococcus pluvialis in airlift bioreactor ［J］. Bioresource Technology，2007，98（2）：288—295

［27］Sun H，Kong Q，Geng Z Y，et al. Enhancement of cellbiomass and cell activity of astaxanthin-rich Haematococcus pluvialis ［J］. Bioresource Technology，2015，186（6）：67—73

［28］Yang J. Isolation of high-lipid microalgae and study on the properties of lipid production in reclaimed water ［D］. Thesis for Master of Sicence，Tsinghua University，Beijing. 2009 ［楊佳. 高油脂微藻的篩選及其在升水中的產(chǎn)油特性研究. 清華大學(xué)，北京. 2009］

［29］Zhang B Y ，Li Y G，Li Z K，et al. Effects of temperature，light intensity and pH on photosynthesis and growth rate of Haematococcus pluvialis ［J］. Oceanologia ET Limnologia Sinica，2003，34（5）：558—565 ［張寶玉，李夜光，李中奎，等. 溫度、光照強度和pH對雨生紅球藻光合作用和生長速率的影響. 海洋與湖沼，2003，34（5）：558—565］

［30］Cui B X，Zhong F X. Comparative studies on the growth of Heamatacoccus Pluvialis 797 in different culture media ［J］. Journal of Wuhan Polytechnic University，2007，26（4）：14—16 ［崔寶霞，鐘方旭. 雨生紅球藻797在不同培養(yǎng)基上生長的研究. 武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報，2007，26（4）：14—16］

［31］Wei T，Gu W H，Li J，et al. Effects of carbon and nitrogen on the growth and astaxanthin accumulation of Haematococcus pluvialis ［J］. Marine Science，2012，34（11）：55—61 ［韋韜，顧文輝，李健，等.不同碳氮濃度對雨生紅球藻生長及蝦青素累積的影響. 海洋科學(xué)，2012，34（11）：55—61］

［32］Hata N，Ogbonna J C，Hasegawa Y，et al. Production of astaxanthin by Haematococcus pluvialis in a sequential heterotrophic-photoautotrophic culture ［J］. Journal of Applied Phycology，2001，13（5）：395—402

［33］Kamonpan K，Artiwan S，Sorawit P ，et al. Photoautotrophic high-density cultivation of vegetative cells of Haematococcus pluvialis in airlift bioreactor ［J］. Bioresource Technology，2007，98（2）：288—295

［34］Choi S L，Suh I S，Lee C G，et al. Lumostatic operation of bubble column photobioreactors for Haematococcus pluvialis cultures using a specific light uptake rate as a control parameter ［J］. Enzyme and Microbial Technology，2003，33（4）：403—409

［35］Xu H，Liu Z P，Yuan L，et al. Effect of pH on growth of several freshwater algae ［J］. Environmental Science & Technology，2009，32（1）：27—30 ［許海，劉兆普，袁蘭，等. pH對幾種淡水藻類生長的影響. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2009，32（1）：27—30］

［36］Fábregas J，Domínguez A，álvarez D G，et al. Induction of astaxanthin accumulation by nitrogen and magnesium deficiencies in Haematococcus pluvialis ［J］. Biotechnology Letters，1998，20（6）：623—626

EFFECTS OF CULTURE METHOD ON CELL PROLIFERATION AND CELL ACTIVITY OF HAEMATOCOCCUS PLUVIALIS GROWING UNDER RED LIGHT

LUO Jie，WANG Jian-Yuan，ZHOU Cheng-Xu，YAN Xiao-Jun，XU Ji-Lin，LUO Qi-Jun，MA Bin and WU Xiao-Kai
（School of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 315211，China）

The current study investigated methods culturing green motile cells of Haematococcus pluvialis under red light on cell density，cell growth rate and cell activity. In red light，the stationary growth phase in batch culture maintained for long time，and the cell photosynthetic activity maintained stable high. There was no neutral lipid accumulation in the cell growth in red light. Biomass yields from a semi-continuous culture of 20% medium renew rate was 57% higher than those from the batch culture. The variation of nutrient absorption rate and chlorophyll fluorescence parameter showed that cellular stress regulation started earlier in batch culture than those in semi-continuous cultures. The cell growth rate and photosynthetic activity were negatively related to the initial cell density in a batch culture. Culture of lower initial density had higher growth rate and higher photosynthetic activity. The effects of CO2on the cultures under red light or under white light were conditionally dependent. Adding CO2increased maximum biomass by 54%. The growth rates increased as while，however，that in the red light was higher（0.223/d） than that in white light（0.198/d）. The pH values were not related with the light quality under both red light and white light，and pH decreased to the suitable level of pH 78. Chlorophyll parameter Fv/Fmsignificantly increased by red light with CO2addition while it is not mediated by white light. Cell size significantly decreased by red light with CO2addition while it was no regulated by white light. These results revealed that the method of intermittent semi-continuous culture for green motile cells of H. pluvialis had higher cell yield with high activity，which is a plausible strategy in astanxanthin industry.

Haematococcus pluvialis； green motile cell； red light； culture method

Q178.1+1

A

1000-3207（2016）05-1041-10

10.7541/2016.135

2016-03-14；

2016-06-24

國家星火計劃項目（2015GA701001）； 海洋藥源生物種質(zhì)庫建設(shè)項目； 國家公益性行業(yè)（海洋）科研專項經(jīng)費項目（201105009）； 國家“萬人計劃”（財教［2014］412號）資助 ［Supported by the National Spark Program of National Ministry of Science and Technology（No. 2015GA701001）； National Collection of Marine Organisms for Medicine Resources； National Marine Research Special Funds for Public Welfare Projects（No. 201105009）； National High-Level Personnel of Special Support Program（No. 2014-412）］

羅杰（1992—），男，安徽壽縣人； 碩士； 主要從事微藻生理生態(tài)研究。E-mail：luojie315@outlook.com

周成旭，副研究員； 主要從事微型藻類的生物學(xué)、生理生態(tài)學(xué)、有害赤潮及生物質(zhì)應(yīng)用等研究。E-mail：zhouchengxu@nbu.edu.cn