陶毅明，金榮仲，朱 華，馬義麗，劉青波（桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院，廣西 桂林 541004）

菠蘿蜜過氧化物酶活性部位的研究

陶毅明，金榮仲，朱 華，馬義麗，劉青波
（桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院，廣西 桂林 541004）

以菠蘿蜜果肉過氧化物酶（peroxidase，POD）為研究對象，用丁二酮、碳化二亞胺（N-ethyl-N’-3-dimethylaminopropyl carbodiimide，EDC）、N-乙酰咪唑（N-acetylimidazole，NAI）、β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol，MT）、對-氯汞苯甲酸（parachloro-mercuri-benzoate，pCMB）和焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate，DEPC）對POD進(jìn)行化學(xué)修飾，研究酶活性必需基團(tuán)。結(jié)果表明，丁二酮、EDC和NAI對酶活力無顯著影響，說明精氨酸、羧基和酪氨酸與酶活力無關(guān)；pCMB、DEPC和β-巰基乙醇強(qiáng)烈抑制酶活性，說明半胱氨酸和組氨酸是酶活性的必需基團(tuán)，二硫鍵對酶活性有重要貢獻(xiàn)。動力學(xué)分析和底物保護(hù)實驗表明，DEPC為POD的競爭性抑制劑，組氨酸位于酶活中心。

過氧化物酶；菠蘿蜜；酶活中心；必需基團(tuán)；化學(xué)修飾

菠蘿蜜（Artocarpus heterophyllus）為?？颇静ぬ}屬植物，又稱木菠蘿，其果肉含豐富的糖類、蛋白質(zhì)、檸檬酸和多種維生素[1]。成熟的菠蘿蜜采后一星期會發(fā)生褐變現(xiàn)象，影響果肉的品質(zhì)和銷售[2]。

過氧化物酶（peroxidase，POD）是一種以H2O2作為電子受體的催化底物氧化的酶。POD廣泛分布于植物體不同的組織、器官及生長發(fā)育的不同時期[3]，參與活性氧清除[4]、吲哚乙酸降解[5]、木質(zhì)素合成[6]等生理功能，也是除多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和苯丙氨酸解氨酶（phenylalaninammonialyase，PAL）之外，參與褐變的重要酶類[7]。在H2O2存在下，POD能催化酚類等物質(zhì)氧化，與PPO和PAL共同作用，使果蔬發(fā)生褐變，導(dǎo)致果皮變色、營養(yǎng)散失、品質(zhì)與口味不佳[8]。

有關(guān)POD催化機(jī)理和酶活中心的報道以辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）為主，研究表明HRP酶活中心的組氨酸通過酸堿催化等機(jī)制參加反應(yīng)[9]。一些其他來源的POD結(jié)構(gòu)也得到解析，如擬南芥、大麥、花生和大豆POD以及酶-底物中間產(chǎn)物已通過X射線晶體衍射或定點突變等方法得到大量關(guān)于酶空間結(jié)構(gòu)和酶活必需基團(tuán)的信息[9-10]。

化學(xué)修飾法是研究酶活中心的一種常用方法，因其簡便，不需要制備酶晶體，被廣泛使用。這些氨基酸化學(xué)修飾劑在特定的pH值條件下與酶分子中特定氨基酸發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致酶活力的改變，為相關(guān)研究提供酶活中心的信息[11-12]。研究POD酶活中心必需氨基酸，能為控制果蔬酶促褐變提供理論依據(jù)，也為菠蘿蜜采后保鮮和貯藏運輸提供參考。因此，本實驗用化學(xué)修飾劑研究菠蘿蜜POD酶活中心必需基團(tuán)，并用紫外光譜法和動力學(xué)法初步探討了組氨酸在POD酶活中的貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

成熟菠蘿蜜果肉 市售。

1.2 試劑與儀器

OctylSepharose 4 Fast Flow、Sephacryl S-200 美國GE公司；碳化二亞胺（N-ethyl-N’-3-dimethylaminopropyl carbodiimide，EDC）、焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC） 美國Sigma公司；對-氯汞苯甲酸（diethyl pyrocarbonate，pCMB） 德國Karl Roth公司；愈創(chuàng)木酚 德國科密歐公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1510酶標(biāo)儀 美國Thermo Fisher公司；3K15冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司。

1.3 酶的提取純化

稱量5 g菠蘿蜜果肉，于25 mL預(yù)冷的pH7.2 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液中（含0.5%聚乙烯吡咯烷酮和少量二氧化硅），在研缽中充分研磨，研缽周圍放置冰塊。之后，4 ℃靜置過夜。次日研磨液4 ℃、10 000 r/min離心15 min，棄沉淀，留上清，緩慢添加硫酸銨粉末至飽和度為80%，沉淀蛋白質(zhì)。4 ℃靜置2 h后，10 000 r/min、4 ℃離心15 min，收集沉淀。蛋白質(zhì)沉淀用4 mL上述磷酸緩沖液重新溶解后，經(jīng)OctylSepharose 4 Fast Flow疏水柱和Sephacryl S-200分子篩層析，最后得到純化的POD。

1.4 POD酶活力測定

取50 μL酶液加入150 μL用50 mmol/L磷酸鹽緩沖液配制的底物溶液中（pH6.0，含愈創(chuàng)木酚21.7 mmol/L，過氧化氫52.2 mmol/L），室溫下反應(yīng)15 min后在酶標(biāo)儀上測定吸光度（A470nm）[13]。

1.5 POD的化學(xué)修飾

配制濃度為200 mmol/L丁二酮、EDC、N-乙酰咪唑（N-acetylimidazole，NAI）、β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol，MT）、pCMB和DEPC母液。pCMB和DEPC母液用無水乙醇配制，在實驗濃度范圍內(nèi)，乙醇（終體積分?jǐn)?shù)為0.5%～3%）對酶活力無顯著影響。其余母液用蒸餾水配制。取50 μL酶液、50 μL不同pH值緩沖液和一定體積修飾劑母液，并用蒸餾水補(bǔ)足至200 μL，得到不同濃度的修飾劑體系。酶與修飾劑在25 ℃水浴反應(yīng)20 min后，取50 μL修飾后的酶液，與150 μL底物溶液室溫下反應(yīng)，測定POD剩余酶活力。未經(jīng)修飾劑的酶活力定為100%。各修飾劑體系中使用的緩沖液如下：丁二酮為pH 8.0硼酸-硼砂緩沖液，EDC為pH 4.5醋酸-醋酸鈉緩沖液，β-巰基乙醇為pH 8.0 Tris-HCl緩沖液，pCMB為pH 5.8醋酸-醋酸鈉緩沖液，DEPC為pH 6.5磷酸鹽緩沖液。各緩沖液濃度均為0.2 mol/L[14-16]。每組3個重復(fù)。

1.6 底物保護(hù)實驗

取50 μL 43.4 mmol/L愈創(chuàng)木酚（pH6.0）與50 μL酶液混合，在25 ℃恒溫水浴作用10 min后，取出50 μL混合液，與100 μL修飾劑作用15 min后，測定剩余酶活力。

1.7 DEPC與POD作用的紫外光譜掃描

取1 mL未經(jīng)修飾或經(jīng)修飾過的酶液，于石英比色皿中，用酶標(biāo)儀掃描220～300 nm波長范圍內(nèi)的吸光度。

1.8 DEPC對POD的抑制機(jī)制

在不同濃度DEPC溶液中，改變底物愈創(chuàng)木酚的濃度，測定A470nm。以吸光度的倒數(shù)1/A470nm對底物濃度的倒數(shù)1/[S]作圖，即Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖。每組3個重復(fù)。

1.9 數(shù)據(jù)處理

每組實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 精氨酸、酪氨酸殘基與羧基的化學(xué)修飾

丁二酮在避光條件下，在pH 8.0硼酸-硼砂緩沖液中，能特異性地與精氨酸胍基反應(yīng)[14]。NAI能與酪氨酸的酚羥基反應(yīng)[12]。水溶性的EDC在偏酸條件下，可與蛋白質(zhì)中的酸性氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）的羧基或蛋白質(zhì)C端羧基發(fā)生反應(yīng)[15]。這3 種化學(xué)修飾劑與POD作用后，酶活性變化不顯著（表1），說明精氨酸、酪氨酸殘基和羧基與酶活力無關(guān)，不是酶活性的必需基團(tuán)。

表1 POD經(jīng)丁二酮、NAI和EDC修飾后的剩余酶活力Table 1 Residual activity of POD after modifi cation by diacetyl, NAI and EDC

2.2 半胱氨酸殘基的化學(xué)修飾

有機(jī)汞是常用的巰基修飾劑。pCMB在pH 5.8條件下可與半胱氨酸巰基反應(yīng)[16]，結(jié)果如圖1所示：隨著pCMB濃度的增加，POD活性迅速下降，酶經(jīng)6 mmol/L pCMB修飾后，酶活力僅為原來的15.6%，說明半胱氨酸與酶活力密切相關(guān)。底物保護(hù)實驗表明，愈創(chuàng)木酚與酶的結(jié)合不能解除pCMB對酶的抑制作用，說明pCMB與酶的作用位點和愈創(chuàng)木酚與酶的結(jié)合位點不是同一個位點，即pCMB結(jié)合在酶活中心以外的地方。因此，推測半胱氨酸是菠蘿蜜POD的酶活性必需基團(tuán)，但是位于酶活中心之外。

圖1 1 pCMB對POD的修飾作用Fig. 1 Modifi cation of POD by pCMB

2.3 二硫鍵對酶活力的影響

二硫鍵在維系蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定方面起著重要作用。β-巰基乙醇是常用的還原劑，它可打開二硫鍵，將其還原成游離的巰基。在pH 8.0 Tris-HCl緩沖液中，與巰基乙醇保溫后，檢測剩余酶活力，結(jié)果如圖2所示。POD經(jīng)β-巰基乙醇處理后，酶活性迅速降低，這與pCMB的修飾結(jié)果類似。6 mmol/L β-巰基乙醇導(dǎo)致80%酶活力喪失，且底物沒有保護(hù)作用。因此，認(rèn)為二硫鍵對于維持POD酶活力極為重要，菠蘿蜜POD可能由兩條或以上的肽鏈組成，可能存在鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵，當(dāng)二硫鍵被還原后，亞基解開，酶分子也就喪失了催化活性。

圖2 2 β-巰基乙醇對POD的修飾作用Fig. 2 Modifi cation of POD by β-mercaptoethanol

2.4 組氨酸殘基的化學(xué)修飾

DEPC是一種廣泛使用的組氨酸修飾劑。在pH 6.5條件下，DEPC主要和組氨酸咪唑基反應(yīng)，同時可能與酪氨酸發(fā)生副反應(yīng)[17]。紫外光譜分析結(jié)果（圖3）表明，未經(jīng)修飾作用POD在278 nm波長處有一特征吸收峰，這也是蛋白質(zhì)的特征吸收峰，主要是蛋白質(zhì)分子中組氨酸和酪氨酸的貢獻(xiàn)。POD與DEPC作用后，在242 nm波長處有一新特征峰生成，這是因為DEPC與組氨酸咪唑基發(fā)生乙酯基化作用[18]。在278 nm波長處吸收峰沒有變化，表明在本實驗條件下，DEPC主要和組氨酸反應(yīng)，DEPC與酪氨酸的副反應(yīng)很少。

圖3 POD經(jīng)DEPC修飾后的紫外光譜Fig. 3 UV spectrum of POD after modifi cation by DEPC

POD與DEPC保溫后，檢測剩余酶活力的結(jié)果如圖4所示。隨著DEPC濃度的升高，酶活力迅速下降，6 mmol/L DEPC處理后，POD酶活力為原來的30.3%，說明組氨酸是POD酶活的必需基團(tuán)。底物保護(hù)實驗表明，愈創(chuàng)木酚能有效保護(hù)酶活。POD與愈創(chuàng)木酚結(jié)合之后，再經(jīng)修飾劑處理，剩余酶活要遠(yuǎn)高于無底物保護(hù)的酶。底物結(jié)合后，再經(jīng)6 mmol/L DEPC處理，仍有75.7%酶活力，酶活力約為無底物保護(hù)的2.5倍。因此，推測組氨酸是POD酶活的必需基團(tuán)，且位于酶活中心。

圖4 DEPC對POD的修飾作用Fig. 4 Modifi cation of POD by DEPC

為進(jìn)一步驗證組氨酸是否在酶活中心，采用雙倒數(shù)作圖，對DEPC抑制POD的機(jī)制做了進(jìn)一步分析，結(jié)果如圖5所示。在不同濃度DEPC溶液中，改變底物愈創(chuàng)木酚[S]，以1/A470nm對1/[S]雙倒數(shù)作圖，得到一組縱截距相同，橫截距不同的直線。隨著DEPC濃度增加，酶表觀Km增大，無DEPC時，Km為23.8 mmol/L，1 mmol/L DEPC時，Km為38.5 mmol/L，2 mmol/L DEPC時，Km為76.9 mmol/L，說明DEPC是POD的競爭性抑制劑，即DEPC與酶活中心結(jié)合。結(jié)合圖4，可進(jìn)一步推測，DEPC是與酶活中心的組氨酸結(jié)合，也證明了組氨酸是POD酶活中心的必需基團(tuán)。

圖5 雙倒數(shù)法判斷DEPC對POD的抑制機(jī)制Fig. 5 Determination of inhibition type of DEPC on POD by Lineweaver-Burk plot

3 討論與結(jié)論

過氧化物酶EC 1.11.1.7屬于氧化還原酶，含血紅素輔基，它以H2O2作為電子受體，多種底物作為電子供體，催化底物發(fā)生氧化作用，其作用的底物非常廣泛，包括抗壞血酸、谷胱甘肽、胺類和酚類等[19]。POD廣泛分布在果蔬中，參與果實成熟、色澤和風(fēng)味的形成，并能與多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶一起參與植物的酶促褐變[20-21]。

POD的酶活中心和作用機(jī)制研究較為透徹的是HRP。晶體結(jié)構(gòu)分析和定點突變都證明精氨酸、組氨酸和賴氨酸是HRP酶活必需基團(tuán)。HRP分子中，位于血紅素輔基附近的第38位精氨酸和第42位組氨酸，這2 個氨基酸都位于酶的疏水口袋內(nèi)，在催化反應(yīng)時，通過疏水作用和氫鍵與芳香類底物結(jié)合，同時還參與過氧化氫的異裂。HRP催化芳香類化合物氧化時，通過兩次單電子傳遞，形成中間復(fù)合物Ⅰ和Ⅱ[22-23]?；蛐蛄蟹治霰砻髟S多植物POD催化中心都含有精氨酸和組氨酸?；ㄉ鶳OD的X射線衍射結(jié)果顯示，第169位組氨酸位于酶活中心，其側(cè)鏈咪唑基上的一個氮原子與血紅素輔基的鐵離子形成配位鍵，另一個氮原子與第238位谷氨酸羧基形成氫鍵[24]。

晶體結(jié)構(gòu)解析能提供直觀準(zhǔn)確的關(guān)于酶的結(jié)構(gòu)與酶活中心的信息，但是實驗要求高，需要制備蛋白晶體，而化學(xué)修飾法通過修飾劑與氨基酸的特異性反應(yīng)來推斷酶活中心，雖然有一些局限，例如可能發(fā)生副反應(yīng)，但也能提供參考。通過化學(xué)修飾法，本實驗探討了菠蘿蜜POD酶活性必需基團(tuán)。丁二酮、NAI和EDC作用POD之后，酶活力沒有顯著變化，認(rèn)為精氨酸殘基、酪氨酸殘基和羧基與酶活無關(guān)。pCMB和巰基乙醇使酶活迅速下降，認(rèn)為半胱氨酸殘基即游離巰基和二硫鍵對酶活力有重要貢獻(xiàn)。當(dāng)二硫鍵被巰基乙醇破壞后，酶的空間結(jié)構(gòu)遭到破壞或者亞基解聚，失去了催化能力。POD經(jīng)DEPC修飾后，酶活力迅速下降，底物愈創(chuàng)木酚對DEPC導(dǎo)致的失活有緩解作用，說明組氨酸是POD酶活中心的必需基團(tuán)。對小麥草POD的化學(xué)修飾表明，組氨酸和酪氨酸是酶活必需基團(tuán)[25]。

為了排除DEPC與酪氨酸殘基的副反應(yīng)的干擾，本實驗分析了紫外光譜，結(jié)果表明，當(dāng)DEPC與POD結(jié)合后，240 nm波長處吸收峰增加，說明DEPC與組氨酸形成了新的化學(xué)鍵，而278 nm波長處吸收峰不變，說明DEPC與酪氨酸發(fā)生的副反應(yīng)很少，POD酶活力減少，是由于組氨酸的修飾引起的。動力學(xué)分析進(jìn)一步表明，DEPC是POD的競爭性抑制劑，與底物競爭和酶結(jié)合，DEPC與酶作用的位點就是底物與酶的結(jié)合位點——組氨酸，即組氨酸位于酶活中心。

[1] 毛琪, 葉春海, 李映志, 等. 菠蘿蜜研究進(jìn)展[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報, 2007, 23(3): 439-443. DOI:10.3969/j.issn.1000-6850.2007.03.097.

[2] 田春美, 鐘秋平. 木薯淀粉/殼聚糖可食性復(fù)合膜對鮮切菠蘿蜜的保鮮研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2007, 28(5): 130-133. DOI:10.3969/ j.issn.1005-6521.2007.05.043.

[3] MINIBAYEVA F, BECKETT P R, KRANNER I. Roles of apoplastic peroxidases in plant response to wounding[J]. Phytochemistry, 2015, 112: 122-129. DOI:10.1016/j.phytochem.2014.06.008.

[4] 侯媛媛, 朱璇, 王英, 等. 水楊酸處理對杏果實冷害及活性氧代謝的影響[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(4): 195-199. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201404040.

[5] 梁艷榮, 胡曉紅, 張穎力. 植物過氧化物酶生理功能研究進(jìn)展[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2003, 24(2): 110-113. DOI:10.3969/ j.issn.1009-3575.2003.02.026.

[6] 劉海進(jìn), 李呂木. 木質(zhì)素過氧化物酶的研究進(jìn)展[J]. 中國飼料, 2010(2): 20-22. DOI:10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.2010.02.001.

[7] 周丹, 李穎佳, 王建中, 等. 板栗酶促褐變過程中多酚氧化酶和過氧化物酶活性的變化[J]. 食品科技, 2014, 39(6): 47-50. DOI:10.13684/ j.cnki.spkj.2014.06.011.

[8] 丁薪源, 曹建康. 果蔬過氧化物酶酶學(xué)特性研究進(jìn)展[J]. 食品科技, 2012, 37(10): 62-66. DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2012.10.042.

[9] NIGEL C V. Structural determinants of plant peroxidase function[J]. Phytochemistry Reviews, 2004, 3: 3-18. DOI:10.1023/ B:PHYT.0000047799.17604.94.

[10] MIRZA O, HENRIKSEN A, ?STERGAARD L, et al. Arabidopsis thaliana peroxidase N, structure of a novel neutralperoxidase[J]. Acta Crystallographica D, 2000, 56(Pt 3): 372-375. DOI:10.1107/ S0907444999016340.

[11] 李冬霞, 夏文水. 米曲霉外切β-氨基葡萄糖苷酶活性部位研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2010, 31(10): 200-202. DOI:10.13386/ j.issn1002-0306.2010.10.046.

[12] 梁成欽, 周先麗, 徐慶. 羅漢果蛋白酶的化學(xué)修飾[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報, 2012, 31(2): 206-210. DOI:10.3969/ j.issn.1673-1689.2012.02.015.

[13] CAI Feng, YANG Chao’ou, DUAN Peipei, et al. Purification and characterization of a novel thermal stable peroxidase from Jatrophacurcas leaves[J]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2012, 77: 59-66. DOI:10.1016/j.molcatb.2011.12.002.

[14] 彭新湘, 李明啟. 乙醇酸氧化酶必需精氨酸殘基的化學(xué)修飾[J]. 植物生理學(xué)報, 1991, 17(4): 321-326.

[15] 孫芳, 王紅揚, 王潔, 等. 鴨心蘋果酸脫氫酶功能基團(tuán)的研究[J].食品科學(xué), 2014, 35(15): 212-215. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201415043.

[16] 張茜, 閆冰, 王勤, 等. 修飾劑對青霉菌葡萄糖氧化酶的效應(yīng)研究[J].廈門大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2010, 49(5): 707-710.

[17] DING Shihua, LI Yingwen, ZHU Liquan. Identication of histidine residues at the active site of Megalobatrachus japonicus alkaline phosphatase by chemical modification[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2002, 1594(1): 100-108. DOI:10.1016/S0167-4838(01)00288-6.

[18] TAVAKOLI H, GHOURCHIAN H, MOOSAVI-MOVAHEDI A A, et al. Histidine and serine roles in catalytic activity of choline oxidase from Alcaligenes species studied by chemical modifications[J]. Process Biochemistry, 2006, 41(2): 477-482. DOI:10.1016/ j.procbio.2005.07.003.

[19] HAMID M, REHMAN K. Potential applications of peroxidases[J]. Food Chemistry, 2009, 115(4): 1177-1186. DOI:10.1016/ j.foodchem.2009.02.035.

[20] TERESA M C, FEDERICO P, JOSé M E. Purification and kinetic characterization of two peroxidases of Selaginella martensii Spring involved in lignifi cation[J]. Plant Physiology and Biochemistry, 2012, 52: 130-139. DOI:10.1016/j.plaphy.2011.12.008.

[21] GONG Zhiqing, LI Dajing, LIU Chunquan, et al. Partial purifi cation and characterization of polyphenol oxidase and peroxidase from chestnut kernel[J]. LWT-Food Science and Technology, 2015, 62(2): 1095-1099. DOI:10.1016/j.lwt.2014.10.012.

[22] GAJHEDE M, SCHULLER D J, HENRIKSEN A, et al. Crystal structure of horseradish peroxidase C at 2.15 ? resolution[J]. Nature Structural Biology, 1997, 4(12): 1032-1038. DOI:10.1038/nsb1297-1032.

[23] MOGHARRAB N, GHOURCHIAN H, AMININASAB M. Structural stabilization and functional improvement of horseradish peroxidase upon modification of accessible lysines: experiments and simulation[J]. Biophysical Journal, 2007, 92(4): 1192-1203. DOI:10.1529/biophysj.106.092858.

[24] SCHULLER D J, BAN N, van HUYSTEE R B, et al. The crystal structure of peanut peroxidase[J]. Structure, 1996, 4(3): 311-321. DOI:10.1016/S0969-2126(96)00035-4.

[25] LAI L S, WANG D J, CHANG C T, et al. Catalytic characteristics of peroxidase from wheat grass[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2006, 54(22): 8611-8616. DOI:10.1021/jf060888w.

Active Center of Peroxidase from Jackfruit Flesh

TAO Yiming, JIN Rongzhong, ZHU Hua, MA Yili, LIU Qingbo
(College of Biotechnology, Guilin Medical University, Guilin 541004, China)

In order to investigate the essential groups for peroxidase (POD) activity from jackfruit fl esh, diacetyl, N-ethyl-N’-3-dimethylaminopropylcarbodiimide (EDC), N-acetylimidazole (NAI), β-mercaptoethanol(MT), parachloro-mercuribenzoate (pCMB) and diethyl pyrocarbonate (DEPC) were used to modify the POD enzyme. The results revealed that diacetyl, EDC and NAI showed no significant impact on POD activity, indicating that Arg, carboxyl and Lys had no association with the enzyme activity. However, pCMB, DEPC and MT strongly inhibited POD activity, indicating that Cys and His were the essential groups for its activity, and disulfi de bond played a very important role in the enzyme activity. Enzymatic kinetics and substrate protection indicated that DEPC was a competitive inhibitor for POD, and the His residue was located at the enzyme active center.

peroxidase; jackfruit; enzyme activity center; essential group; chemical modifi cation

10.7506/spkx1002-6630-201611018

Q55

A

1002-6630（2016）11-0103-05

陶毅明, 金榮仲, 朱華, 等. 菠蘿蜜過氧化物酶活性部位的研究[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(11): 103-107. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201611018. http://www.spkx.net.cn

TAO Yiming, JIN Rongzhong, ZHU Hua, et al. Active center of peroxidase from jackfruit fl esh[J]. Food Science, 2016, 37(11): 103-107. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611018. http://www.spkx.net.cn

2015-07-24

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項目（31260214）

陶毅明（1981—），男，副教授，博士，主要從事生物化學(xué)與酶學(xué)研究。E-mail：yiming_tao@yahoo.com