劉　坤，胡建功，張連城，肖震心，潘艷穎，楊寶旺，馬　妍，郭富斌，王占奎

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津300150；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193；3.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，長春130021）

針刺對急性腦梗死大鼠海馬區(qū)Cx43蛋白表達(dá)的影響

劉坤1，胡建功1，張連城1，肖震心1，潘艷穎1，楊寶旺1，馬妍2，郭富斌3，王占奎1

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津300150；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193；3.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，長春130021）

目的觀察針刺對缺血再灌注大鼠海馬區(qū)縫隙連接蛋白Cx43蛋白表達(dá)的影響。方法將Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、非穴位針刺組及針刺組。采用改良的線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈局灶性腦缺血再灌注模型，模型組、非穴位針刺組及針刺組內(nèi)分設(shè)4個(gè)亞組，即缺血再灌注30 min組、缺血再灌注60 min組、缺血再灌注180 min組、缺血再灌注360 min組，每組10只。針刺組電針大鼠頂中線和頂旁線；非穴位針刺組取患側(cè)肋下髂嵴上10 mm的固定點(diǎn)作為針刺點(diǎn)；模型組不予任何處理。采用免疫組化法測Cx43蛋白表達(dá)情況。結(jié)果針刺組不同時(shí)間腦缺血再灌注后行為障礙（Bederson’s）評分與非穴位針刺組和模型組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。模型組、針刺組和非穴位針刺組不同時(shí)間腦缺血再灌注后海馬Cx43灰度值與正常組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。針刺組不同時(shí)間腦缺血再灌注后海馬Cx43灰度值與模型組和非穴位針刺組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論針刺可以阻斷Cx43的過度表達(dá)，干預(yù)大腦神經(jīng)元缺血再灌注損傷，在缺血性腦損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

針刺療法；腦梗死；缺血再灌注；Cx43；大鼠；電針

腦卒中是當(dāng)今人類死亡率最高的三大疾病之一，是人類致殘的主要原因。缺血性腦卒中源于腦血流減少和缺血性腦損傷，2006年Thompson RJ等［1］研究發(fā)現(xiàn)缺血缺氧條件能誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞膜半通道的開放。腦缺血時(shí)連接蛋白43（Cx43）半通道的開放對神經(jīng)元的影響已成為醫(yī)學(xué)界關(guān)注的焦點(diǎn)。在特特條件下（缺血、缺氧、機(jī)械刺激等因素［2-3］），半通道可以被激活開放，導(dǎo)致各種物質(zhì)通過該通道進(jìn)出細(xì)胞，引起神經(jīng)細(xì)胞的損傷。目前Cx43半通道已成為防治腦梗死時(shí)神經(jīng)細(xì)胞死亡的一個(gè)重要的干預(yù)靶標(biāo)，為腦梗死的診治開辟了一個(gè)全新的研究方向。

本研究以Cx43為切入點(diǎn)，通過針刺干預(yù)大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型，采用免疫組化檢測Cx43在大鼠腦缺血再灌注實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械鞍妆磉_(dá)情況，探討其在早期腦缺血時(shí)的分布規(guī)律以及針刺對大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)Cx43蛋白表達(dá)的干預(yù)作用，為針刺早期治療急性腦梗死提供一項(xiàng)重要指標(biāo)及理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物模型制備及分組

健康清潔級雄性Wistar大鼠，體重250～300 g。按Longa改良的線栓法［4］制備動(dòng)物腦缺血再灌注模型，缺血1 h后拔出線栓實(shí)現(xiàn)再灌注。采用Zausinger6分法［5］對其神經(jīng)功能進(jìn)行評分，判斷模型成功與否。根據(jù)SPSS13.0生成的隨機(jī)表，隨機(jī)分為正常組、模型組、非穴位針刺組及針刺組。模型組及針刺組再分設(shè)4個(gè)亞組，即再灌注30 min組（I/R-30 min）、再灌注60 min組（I/R-60 min）、再灌注180 min組（I/R-180 min）和再灌注360 min組（I/R-360 min）。每組10只。

各組于相應(yīng)操作后1 h觀察動(dòng)物行為障礙的程度，參考Bederson JB等［6］評分標(biāo)準(zhǔn)記分。①動(dòng)物有不停地向一側(cè)轉(zhuǎn)圈者，記1分。②提鼠尾離開地面30 cm，觀察前肢屈曲情況，如雙前肢對稱伸向地面，記為0分；如手術(shù)對側(cè)前肢出現(xiàn)腕屈曲、肘屈曲、肩內(nèi)旋或既有腕、肘的屈曲又有肩內(nèi)旋者，分別記為1、2、3、4分。③將大鼠兩前肢置一金屬網(wǎng)上，觀察大鼠兩前肢的肌張力，雙側(cè)肌力對等且有力者記為0分，同樣根據(jù)手術(shù)對側(cè)前肢肌張力下降程度不同記為1、2、3分。④將大鼠放于平地上，分別推其雙肩向?qū)?cè)移動(dòng)，檢查阻力，如雙側(cè)對等且有力，記為0分；當(dāng)向手術(shù)對側(cè)推動(dòng)時(shí)阻力下降者，可根據(jù)下降程度不同分為輕、中、重3度，分別記為1、2、3分。

1.2實(shí)驗(yàn)主要儀器和試劑

SFC-12體視顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）；FluoView?FV1000型共聚焦激光掃描顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；HPIAS-1000彩色圖像分析系統(tǒng)（同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)千屏影像工程公司）；紅四氮唑（TTC，Sigma公司產(chǎn)）；APES粘片劑、高效切片石蠟、蘇木素、伊紅（天津瑞科生物技術(shù)有限公司）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1治療方法

針刺組取頂中線（MS5，百會(huì)向至前頂）、頂旁線（相當(dāng)于國標(biāo)頂旁2線MS9，承靈與正營連線）作為針刺穴位［7］。造模成功后，將大鼠固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，用長25 mm的毫針沿皮刺入大鼠頂中線和頂旁線，然后接電針儀（KWD-8081，長城牌），用疏密波，頻率為2/15 Hz，電流強(qiáng)度為1 mA，強(qiáng)度以肢體輕微抖動(dòng)為宜，留針10 min。非穴位針刺組選取患側(cè)肋下髂嵴上10 mm的固定點(diǎn)作為針刺點(diǎn)。正常組和模型組同樣抓取，不作其他處理。

1.3.2切片制備

(2)察汗烏蘇河地區(qū)1∶25 000地球化學(xué)測量圈定綜合異常60個(gè)，顯示異常元素種類多，元素組合明顯，異常強(qiáng)度高，濃集中心明顯，為后期找礦工作提供了較為詳實(shí)的地球化學(xué)資料。

大鼠于規(guī)定時(shí)間點(diǎn)斷頭取腦。去掉小腦和低位腦干，將待檢測缺血側(cè)腦組織在前聯(lián)合水平沿冠狀切面切下厚約2 mm的腦片，置于4%多聚甲醛中固定。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。用切片機(jī)行連續(xù)冠狀切片，厚5 μm，行HE和免疫組化染色。分別在低倍和高倍顯微鏡下觀察腦組織缺血區(qū)（海馬）病理變化，每張切片在缺血側(cè)半影區(qū)隨機(jī)選取5個(gè)視野，用HPIAS-100多媒體彩色病理圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，光鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化。

1.3.3HE染色步驟

將石蠟切片放于60℃恒溫培養(yǎng)箱烘烤2 h，取出后至室溫；二甲苯透明脫蠟各10 min；梯度乙醇脫水各1 min；蘇木素染色5 min，清水沖洗1 min；乙醇分色1 min，清水沖洗1 min；伊紅染料復(fù)染20 s至1 min；梯度乙醇脫水各1 min；二甲苯透明，中性樹膠封片；光鏡下觀察腦組織染色情況。

1.3.4免疫組化具體步驟

將石蠟包塊切成厚度為5 μm連續(xù)組織切片，貼于經(jīng)多聚賴氨酸處理過的載玻片上，60℃烘烤1 h。將切片先后用二甲苯脫蠟、乙醇常規(guī)至水化。切片放入盛有檸檬酸鹽的緩沖液中，再放入微波爐內(nèi)用中高檔進(jìn)行抗原修復(fù)8 min，自然冷卻至室溫。1%甲醇雙氧水，室溫10 min，消除內(nèi)源性過氧化酶活性，PBS洗3次，每次5 min。滴加10%山羊血清封閉液，室溫20 min，勿洗。滴加一抗，4℃過夜，PBS洗3次，每次5 min。滴加生物素化二抗（IgG），37℃孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min。切片上滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP），37℃20 min，PBS洗3次，每次5 min。DAB顯色使用DAB顯色試劑盒，1 mL蒸餾水加顯色劑A、B、C各1滴，混勻，滴加至切片上，光學(xué)顯微鏡下觀察，以棕黃色為陽性表達(dá)，顯色約10 min，自來水沖洗終止顯色。蘇木素復(fù)染1 min，自來水返藍(lán)。經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明及中性樹脂封片，再通過顯微鏡觀察，進(jìn)行顯微照相（×400）。

1.3.5圖像分析

每個(gè)組別選取3張切片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)完整而不重疊的高倍鏡視野（×400），經(jīng)過微機(jī)程序處理進(jìn)行測定，測量值為每個(gè)視野下陽性反應(yīng)的平均光密度。背景值為同一張切片上胼胝體的平均光密度值，用前者減去后者可以得到矯正的平均光密度值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1各組大鼠癥狀體征及神經(jīng)功能評價(jià)

實(shí)驗(yàn)過程中共有7只動(dòng)物在術(shù)中或術(shù)后死亡，死亡率為5.8%。死亡后大鼠斷頭取腦發(fā)現(xiàn)4只為腦出血，另3只行TTC染色發(fā)現(xiàn)手術(shù)同側(cè)大面積腦梗死，甚至對側(cè)也出現(xiàn)梗死，并有嚴(yán)重腦水腫，部分已經(jīng)液化。上述動(dòng)物未列入行為障礙評分分析。另取7只大鼠造模后，補(bǔ)充入相應(yīng)組內(nèi)。正常組無大鼠死亡。

大鼠蘇醒后，除正常組動(dòng)物外，各組動(dòng)物多有不同程度的神經(jīng)癥狀體征表現(xiàn)，主要為一般精神狀態(tài)較差，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍。鼠毛蓬亂豎起，動(dòng)作緩慢或活動(dòng)減少，行動(dòng)不協(xié)調(diào)，屈曲姿勢，表現(xiàn)為不同程度的手術(shù)對側(cè)前肢內(nèi)收、屈曲，力弱，爬行時(shí)向一側(cè)轉(zhuǎn)圈，嚴(yán)重者不能前行、原地轉(zhuǎn)圈或偏癱（不能站立和行走）。針刺組不同時(shí)間腦缺血再灌注后行為障礙（Bederson’s）評分與非穴位針刺組和模型組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表1。

2.2各組HE染色腦組織病理變化情況

正常組各時(shí)間點(diǎn)顯微鏡下可見各區(qū)域腦組織結(jié)構(gòu)致密，層次清晰，細(xì)胞輪廓正常，核居中，細(xì)胞排列規(guī)則，核仁清楚，神經(jīng)細(xì)胞及毛細(xì)血管周圍間隙正常，毛細(xì)血管內(nèi)可見紅細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞無腫脹、核深染。模型組I/R-30 min亞組可見梗死區(qū)腦組織水腫，局灶性細(xì)胞核固縮，小部分神經(jīng)細(xì)胞腫脹，細(xì)胞輪廓模糊，神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞明顯減少；模型組I/R-60 min亞組可見神經(jīng)細(xì)胞變性、凋亡、壞死，排列無規(guī)則，神經(jīng)元脫失嚴(yán)重，神經(jīng)細(xì)胞腫脹，部分細(xì)胞核固縮深染；模型組I/R-180 min亞組缺血中心區(qū)神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和血管大量壞死顯著，神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，極向不清，有空泡變，核結(jié)構(gòu)不清，細(xì)胞骨架消失或嚴(yán)重破壞；模型組I/R-360 min亞組上述現(xiàn)象進(jìn)一步加重，周圍可見較多凋亡細(xì)胞，病灶中心可見大量固縮核和核碎片，表現(xiàn)為神經(jīng)元壞死、變性、胞核濃縮、濃染、胞漿腫脹。針刺組各亞組神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)恢復(fù)程度等方面與同時(shí)間點(diǎn)模型組亞組比較，改善明顯。非穴位針刺組各亞組對以上結(jié)構(gòu)損傷沒有改善作用。

2.3各組Cx43陽性細(xì)胞變化情況

正常組可見棕黃色著色顆粒，均有Cx43陽性表達(dá)，分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞膜及周圍突起；模型組各亞組海馬區(qū)均有Cx43陽性表達(dá)，較正常組著色顆粒明顯減少，分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞膜及周圍突起，隨缺氧、缺血后時(shí)間的推移，Cx43陽性表達(dá)有逐漸增加的趨勢；針刺組各亞組著色顆粒隨時(shí)間的延長而逐漸增加，與模型組比較，Cx43陽性表達(dá)呈逐漸降低的趨勢；非穴位針刺組各亞組對Cx43陽性表達(dá)無明顯改善。詳見圖1。

表1　各組大鼠行為障礙（Bederson’s）評分比較（x±s，分）

圖1　各組大鼠腦缺血再灌注后海馬Cx43陽性細(xì)胞變化

表2　各組大鼠腦缺血再灌注后海馬Cx43陽性細(xì)胞平均灰度值比較（x±s，個(gè)/半側(cè)切面）

模型組、針刺組和非穴位針刺組不同時(shí)間腦缺血再灌注后海馬Cx43灰度值與正常組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。針刺組不同時(shí)間腦缺血再灌注后海馬Cx43灰度值與模型組和非穴位針刺組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表2。

3　討論

間隙連接是一個(gè)低電阻的細(xì)胞間通道，參與信號的傳遞和保持代謝的連續(xù)性。間隙連接的基本結(jié)構(gòu)是連接蛋白，大腦中星形膠質(zhì)細(xì)胞間具有廣泛的間隙連接，主要由Cx43構(gòu)成。Cx43形成的通道主要有半通道和間隙連接通道［8］。在正常生理情況下，間隙連接通道處于開放狀態(tài)，允許細(xì)胞間通訊，而半通道則處于關(guān)閉狀態(tài)［9］。半通道是目前認(rèn)為相鄰細(xì)胞間唯一能直接進(jìn)行能量、物質(zhì)和信息交換的一種特特通道，廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，在神經(jīng)細(xì)胞的分化、發(fā)育和生理功能的調(diào)節(jié)中起重要的作用［10］。在缺血缺氧等因素下，半通道可被激活開放，導(dǎo)致各種物質(zhì)通過該通道進(jìn)出細(xì)胞，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的損傷。半通道的基本結(jié)構(gòu)單位為連接蛋白，Cx43是神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的主要連接蛋白，在哺乳動(dòng)物腦組織中表達(dá)最強(qiáng)，且在神經(jīng)系統(tǒng)信號傳遞及各種反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。大腦缺血再灌注損傷常對病灶周圍的神經(jīng)元造成不可逆的損傷，危害極大。Cx43參與大腦的缺血再灌注損傷，在腦缺血再灌注損傷的不同階段都發(fā)揮重要作用。在腦缺血再灌注過程中半通道的開放是一個(gè)隨著時(shí)間而遞增的過程。有研究［11］表明，缺血初期半通道僅有少量開放，之后開放量有顯著增加，尤其是再灌注初期，刺激誘導(dǎo)更大量的半通道開放。隨著Cx43的表達(dá)增強(qiáng)，間隙連接產(chǎn)生跨細(xì)胞膜信號，加劇神經(jīng)細(xì)胞損傷。其機(jī)制可能為缺血缺氧后，早期產(chǎn)生的一系列代謝應(yīng)激信號如鈣流、氧自由基、興奮性氨基酸等毒性物質(zhì)通過增強(qiáng)的Cx43半通道迅速跨膜傳導(dǎo)進(jìn)入周邊細(xì)胞，使病變范圍擴(kuò)大，加重半暗區(qū)的凋亡，加重腦損傷［12］。因此，阻斷Cx43半通道表達(dá)可減少神經(jīng)元的獨(dú)立生存能力，而合理調(diào)控Cx43的表達(dá)可預(yù)防大腦神經(jīng)元缺血再灌注損傷。

針刺作為一種天然的“阻滯劑”在干預(yù)Cx43在大腦缺血再灌注損傷的過程中起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組各時(shí)間點(diǎn)海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的Cx43表達(dá)均較正常組明顯增強(qiáng)，腦損傷后30 min Cx43表達(dá)已開始增加，隨著時(shí)間變化逐漸增強(qiáng)至360 min最為明顯，這種變化規(guī)律與腦組織病理改變嚴(yán)重程度、神經(jīng)細(xì)胞凋亡的時(shí)間框架是相吻合的，并且Cx43發(fā)生變化開始時(shí)間早于細(xì)胞凋亡出現(xiàn)的時(shí)間，說明星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43表達(dá)的增強(qiáng)參與了大鼠急性腦損傷的病理形成過程。而針刺能明顯改善急性腦梗死大鼠形態(tài)學(xué)的變化，如減輕神經(jīng)細(xì)胞水腫狀態(tài)、減小梗死區(qū)域、抑制炎性細(xì)胞的浸潤等。這與針刺可以阻斷Cx43的過度表達(dá)，干預(yù)大腦神經(jīng)元缺血再灌注損傷有關(guān)。

［1］Thompson RJ，Zhou N，Macvicar BA.Ischemia opens neuronal gap junction hemichannels［J］.Science，2006，312（5775）:924-927.

［2］劉泰槰，Ross G Johnson，Judson D Sheridan.機(jī)械刺激在間隙連接半通道活動(dòng)中的作用［J］.生物物理學(xué)報(bào)，2000，16（3）:468-474.

［3］Burra S，Jiang JX.Connexin 43 hemichannel opening associated with Prostaglandin E（2）release is adaptively regulated by mechanical stimulation［J］.Communicative&Integrative Biology，2009，2（3）: 239-240.

［4］Longa EZ，Weinstein PR，Carison S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）: 84-91.

［5］Zausinger S，Hungerhuber E，Baethmenn A，et al.Neurological impairrment in rats after transient middle cerebral artery occlusion:a comparative study under various treatment paradigms［J］.Brain Res，2000，863（1-2）:94-105.

［6］Bederson JB，Pitts LH，Tsuji M，et a1.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination［J］.Stroke，1986，17（3）:472-476.

［7］華興邦，周浩良.大鼠穴位圖譜的研制［J］.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，1991，1（1）:13-15.

［8］陳曉靜，謝敏杰.星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43及其介導(dǎo)的半通道與縫隙連接通訊在腦缺血損傷中的作用［J］.神經(jīng)損傷與功能重建，2013，8（1）:46-50.

［9］Decrock E，Vinken M，De Vuyst E，et al.Connexin-related signaling in cell death:to live or let die？［J］.Cell Death Differ，2009，16（4）: 524-536.

［10］Sáez JC，Contreras JE，Bukauskas FF，et al.Gap junction hemichannels in astrocytes of the CNS［J］.Acta Physiol Scand，2003，179（1）:9-22.

［11］Majoul IV，Onichtchouk D，Butkevich E，et al.Limiting transport steps and novel interactions of Connexin-43 along the secretory pathway［J］.Histochem Cell Biol，2009，132（3）:263-280.

［12］Liu X，Hashimoto-Torii K，Torii M，et al.Gap junctions/hemichannels modulate interkinetic nuclear migration in the forebrain precursors［J］.J Neurosci，2010，30（12）:4197-4209.

Effect of Acupuncture on Cx43 Protein Expression in the Hippocampal Region in Rats with Acute Cerebral Infarction

LIU Kun1，HU Jian-gong1，ZHANG Lian-cheng1，XIAO Zhen-xin1，PAN Yan-ying1，YANG Bao-wang1，MA Yan2，GUO Fu-bin3，WANG Zhan-kui1.1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine Second Hospital，Tianjin 300150，China；2.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；3.Changchun University of Traditional Chinese Medicine Hospital，Changchun 130021，China

ObjectiveTo investigate the effect of acupuncture on gap junction protein Cx43 expression in the hippocampal region in ischemia/reperfusion rats.MethodsWistar rats were randomized into normal，model，non-point acupuncture and acupuncture groups.A rat model of focal cerebral ischemia/reperfusion was made by modified middle cerebral artery thread occlusion.The model，non-point acupuncture and acupuncture groups were separately divide into four subgroups:30，60，180 and 360 min ischemia/reperfusion，10 rats each.The middle and lateral lines of vertex were given electroacupuncture in the acupuncture group of rats.A subcostal fixed point 10 mm above the iliac crest on the affect side was selected as an acupuncture point in thenon-pointacupuncturegroup.Themodelgroupwasnottreated.Cx43proteinexpressionwasdeterminedby an immunohistochemical method.ResultsThere was a statistically significant difference in the behavior disorder（Bederson’s）score between the acupuncture group and the non-point acupuncture or model group after different times of cerebral ischemia/ reperfusion（P＜0.05）.There was a statistically significant difference in hippocampal Cx43 content between model，acupuncture or non-point acupuncture group and the normal group and between the acupuncture group and the model or non-point acupuncture group after different times of cerebral ischemia/reperfusion（P＜0.05）.ConclusionsAcupuncture can inhibit the overexpression of Cx43，intervene in cerebral ischemia-reperfusion injury and produce a neuroprotective effect in ischemic brain injury.

Acupuncture therapy；Cerebral infarction；Ischemia/reperfusion；Cx43；Rats；Electroacupuncture

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2016.01.0090

1005-0957（2016）01-0090-04

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81102640）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃（14JCZDJC36800）

劉坤（1978-），女，檢驗(yàn)醫(yī)師

王占奎（1977-），男，主治醫(yī)師，Email:wzk21cn@163.com

2015-09-03