翟佳麗，陳　松，田家星，張旭東，劉　歡，劉川東，趙光濤

（濱州醫(yī)學(xué)院，煙臺(tái) 264003）

針刺對(duì)睡眠剝奪大鼠學(xué)習(xí)記憶功能及前額葉皮質(zhì)BDNF表達(dá)的影響

翟佳麗，陳松，田家星，張旭東，劉歡，劉川東，趙光濤

（濱州醫(yī)學(xué)院，煙臺(tái) 264003）

目的觀察針刺對(duì)睡眠剝奪（SD）大鼠學(xué)習(xí)記憶功能及前額葉皮質(zhì)BDNF表達(dá)的影響，為針刺療法用于臨床治療SD提供理論依據(jù)。方法將60只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和針刺組，每組20只。模型組大鼠通過(guò)水上站立法建立SD大鼠模型，針刺組通過(guò)針刺神門(mén)穴進(jìn)行干預(yù)治療，對(duì)照組大鼠不做任何處理。分別于SD24 h、72 h后利用Morris水迷宮方法檢測(cè)各組大鼠學(xué)習(xí)記憶功能，然后處死取腦，通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)大鼠前額葉皮質(zhì)BDNF表達(dá)量的變化。結(jié)果針刺組和模型組SD24 h、72 h后體重、定位航行時(shí)間、空間搜索實(shí)驗(yàn)結(jié)果及前額葉皮質(zhì)內(nèi)BDNF表達(dá)量與對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。針刺組SD24 h、72 h后定位航行時(shí)間和空間搜索實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。針刺組SD72 h后體重及前額葉皮質(zhì)內(nèi)BDNF表達(dá)量與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論針刺可明顯改善SD導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)記憶功能下降，并可改善大鼠前額葉皮質(zhì)因SD導(dǎo)致的BDNF表達(dá)下降。

針刺；睡眠剝奪；穴，神門(mén)；學(xué)習(xí)記憶功能；BDNF；大鼠

睡眠與人類(lèi)每一項(xiàng)生理活動(dòng)息息相關(guān)，其生理重要性與呼吸及心跳相等。睡眠能促進(jìn)個(gè)體的生長(zhǎng)發(fā)育，并具有易化學(xué)習(xí)、形成和維持記憶的功能。近年來(lái)，越來(lái)越多的動(dòng)物和臨床實(shí)驗(yàn)［1-3］表明，睡眠在學(xué)習(xí)、記憶進(jìn)程中發(fā)揮了重要作用。睡眠剝奪（sleep deprivation， SD）指由于各種原因引起的睡眠丟失狀態(tài)，可引起情緒、學(xué)習(xí)記憶、免疫功能等一系列改變［4］。有研究［5］顯示，SD超過(guò)20 h即可導(dǎo)致機(jī)體認(rèn)知及學(xué)習(xí)記憶功能下降。若長(zhǎng)期處于SD狀態(tài)，則會(huì)引起機(jī)體生理及心理狀態(tài)的改變。因此針對(duì)SD進(jìn)行有效治療方法的開(kāi)發(fā)是目前臨床研究的重點(diǎn)。

針刺是目前對(duì)各種病癥非常有效的治療方法之一，因其無(wú)副反應(yīng)、見(jiàn)效快而被廣泛應(yīng)用。本研究擬通過(guò)水上平臺(tái)法建立SD大鼠模型，然后選取神門(mén)穴進(jìn)行針刺治療，通過(guò)Morris水迷宮檢測(cè)針刺對(duì)SD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的改善，以期研究開(kāi)發(fā)針對(duì)SD的安全有效的臨床治療方法，并通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)大鼠前額葉皮質(zhì)BDNF表達(dá)變化，為SD發(fā)生機(jī)制及針刺治療機(jī)制的闡述提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雌性Wistar大鼠60只，體重為180～220 g，購(gòu)自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)SCXK（魯）20080002］。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

兔抗大鼠BDNF單克隆抗體（北京博奧森公司）；睡眠剝奪箱（自制）；一次性針刺針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）；Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（北京智多寶生物技術(shù)有限公司）；石蠟切片機(jī)（德國(guó)萊卡）；顯微鏡（德國(guó)萊卡）。

1.3動(dòng)物分組及處理

將60只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和針刺組，每組20只。模型組根據(jù)文獻(xiàn)采用改良多平臺(tái)睡眠剝奪法（MMPM）建立睡眠剝奪模型。自制睡眠剝奪鼠箱（110 cm×60 cm×40 cm），10個(gè)直徑6.5 cm、高8.0 cm的平臺(tái)，平臺(tái)間隔15 cm，在平臺(tái)周邊注滿(mǎn)水，水溫保持在22℃，水面距平臺(tái)面約1.0 cm，鼠在平臺(tái)上可自行攝食飲水，并在平臺(tái)上活動(dòng)。當(dāng)大鼠進(jìn)入REM睡眠時(shí)，由于全身肌肉張力降低，導(dǎo)致軀體失衡而觸水驚醒，確保大鼠不能進(jìn)入REM睡眠期。針刺組大鼠于實(shí)驗(yàn)前1星期開(kāi)始針刺。取神門(mén)穴，穴位位于大鼠前肢內(nèi)側(cè)腕部橫紋尺骨邊緣。直刺1 mm，行平補(bǔ)平瀉，留針40 min，針刺時(shí)間為每日申時(shí)（下午15:00—17:00），直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。對(duì)照組不作任何處理。

1.4Morris水迷宮訓(xùn)練

采用Morris水迷宮檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶功能。各組大鼠于實(shí)驗(yàn)前4 d開(kāi)始水迷宮訓(xùn)練。每日4次，時(shí)間為上午9:00—10:00，下午15:00—16:00。每個(gè)時(shí)間段訓(xùn)練2次，每只大鼠訓(xùn)練間隔為30 s，并對(duì)其逃避潛伏期（從入水至找到安全平臺(tái)的時(shí)間）進(jìn)行記錄，測(cè)試時(shí)限定為60 s。水池上空架設(shè)1臺(tái)攝像機(jī)，通過(guò)與監(jiān)視器和計(jì)算機(jī)相連，水迷宮檢測(cè)軟件系統(tǒng)即會(huì)對(duì)大鼠進(jìn)入水池內(nèi)的運(yùn)動(dòng)軌跡和運(yùn)動(dòng)時(shí)間進(jìn)行自動(dòng)跟蹤及記錄。實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練結(jié)束后即開(kāi)始對(duì)模型組及針刺組大鼠進(jìn)行SD，分別SD24 h、72 h后對(duì)各組大鼠進(jìn)行學(xué)習(xí)行為學(xué)測(cè)試。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)項(xiàng)目為定位航行實(shí)驗(yàn)和空間搜索實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)時(shí)分別將大鼠面向池壁從4個(gè)入水點(diǎn)放入水池，并將大鼠從入水到至找到水下隱蔽平臺(tái)并站立于其上所用時(shí)間進(jìn)行記錄，作為潛伏期，用s表示，大鼠找到平臺(tái)后，讓其在平臺(tái)上站立10 s，同時(shí)將大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡進(jìn)行記錄，觀察各組大鼠找尋平臺(tái)運(yùn)動(dòng)軌跡規(guī)律。

1.5免疫組化

采用免疫組化方法檢測(cè)大鼠前額葉皮質(zhì)BDNF表達(dá)變化。水迷宮檢測(cè)結(jié)束后各組隨機(jī)取10只大鼠，全身灌注，取腦，固定于4%多聚甲醛，然后石蠟包埋，制作石蠟切片，切片厚度為5 μm。將石蠟切片常規(guī)脫水至蒸餾水，微波法抗原修復(fù)（修復(fù)條件為微波火力中檔，10 min，抗原修復(fù)液為EDTA），PBS洗3次，每次3 min；滴加3%雙氧水-甲醇液，完全覆蓋組織，濕盒內(nèi)室溫孵育10 min，PBS漂洗3次，每次3 min；滴加非免疫動(dòng)物血清，完全覆蓋組織，濕盒內(nèi)室溫孵育20 min，甩去非免疫動(dòng)物血清，不洗，滴加一抗（PBS稀釋?zhuān)琹:100），需完全覆蓋待檢組織，濕盒內(nèi)4℃孵育過(guò)夜；PBS洗3次，每次3 min；滴二抗工作液，完全覆蓋組織，濕盒內(nèi)室溫孵育20 min；PBS洗3次，每次3 min；滴辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液完全覆蓋組織，濕盒內(nèi)室溫孵育10 min；PBS洗3次，每次3 min；顯色劑顯色:每張切片滴加新鮮配制的DAB工作液完全覆蓋組織，顯微鏡下掌握顯色程度，自來(lái)水充分沖洗，清除殘余顯色劑，蘇木素復(fù)染5 min，自來(lái)水沖洗5 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，染色時(shí)設(shè)陰性對(duì)照，一抗用PBS代替，其它步驟相同。對(duì)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)行圖像分析，每組動(dòng)物選取3張切片，每張切片選取的位置盡量一致，同一部位選取3個(gè)視野，通過(guò)Imagep-Pro Plus6.0對(duì)圖像進(jìn)行累積吸光度值分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，治療前后采用配對(duì)t檢驗(yàn)，組間比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.13組大鼠外觀狀態(tài)比較

3組大鼠在SD前皮毛順滑，有光澤，動(dòng)作靈敏，精神正常，無(wú)倦怠表現(xiàn)，進(jìn)食飲水正常；模型組大鼠SD24 h后皮毛開(kāi)始出現(xiàn)倒豎，光澤降低，出現(xiàn)倦怠表現(xiàn)，進(jìn)食飲水減少；SD72 h后皮毛無(wú)光澤，且倒豎現(xiàn)象嚴(yán)重，在平臺(tái)上站立不穩(wěn)，進(jìn)食飲水明顯減少，動(dòng)作遲緩，倦怠異常。針刺組大鼠皮毛光澤下降，出現(xiàn)倒豎現(xiàn)象，外觀與模型組差別不明顯。對(duì)照組大鼠在24 h和72 h時(shí)外觀并無(wú)較大變化。

表1　3組大鼠SD前后體重比較?。▁±s，g）

由表1可見(jiàn)，3組大鼠SD前體重比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。針刺組和模型組SD24 h、72 h后體重與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。針刺組SD72 h后體重與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.005）。

2.23組大鼠SD前后定位航行時(shí)間比較

定位航行實(shí)驗(yàn)用于測(cè)量大鼠對(duì)水迷宮學(xué)習(xí)和記憶的獲取能力。實(shí)驗(yàn)觀察和記錄大鼠尋找并爬上平臺(tái)的路線(xiàn)圖及所需時(shí)間，即記錄其潛伏期。

由表2、圖1可見(jiàn)，3組大鼠SD前定位航行時(shí)間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。針刺組和模型組SD24 h、72h后定位航行時(shí)間與對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。針刺組SD244 h、72 h后定位航行時(shí)間與模型組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表22　3組大鼠SD 前后定位航行時(shí)間比較（x±s，s）

圖1　3組大鼠定位航行結(jié)果示意圖

2.33組SDD前后空間搜索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較

空間搜索實(shí)驗(yàn)用于測(cè)量大鼠學(xué)會(huì)尋找平臺(tái)后，對(duì)平臺(tái)空間位置記憶的保持能力。定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，撤去平臺(tái)，記錄大鼠120s內(nèi)穿過(guò)原平臺(tái)位置的次數(shù)和在原平臺(tái)象限探索時(shí)間占總時(shí)間的百分比。

由表3可見(jiàn)，3組大鼠SD前空間搜索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。針刺組和模型組SD24 h、72h后空間搜索實(shí)驗(yàn)結(jié)果與對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。針刺組SD24 h、72 h后空間搜索實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜00.05）。

表3　3組SD 前后空間搜索實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較?。▁±s，%）

2.4免疫組化檢測(cè)3組大鼠前額葉皮質(zhì)BDNF表達(dá)結(jié)果

由表4、圖2可見(jiàn)，針刺組和模型組SD24 h、72 h后前額葉皮質(zhì)內(nèi)BDNF表達(dá)量與對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PP＜0.05）。針刺組SD72 hh后前額葉皮質(zhì)內(nèi)BDNF表達(dá)量與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表44　3組大鼠前額葉皮質(zhì)BDNFF 相對(duì)表達(dá)量比較（x±s，IOD）

4　討論

目前SD最好的治療方法為令其睡眠。藥物治療選擇的藥物主要為中樞興奮藥，這類(lèi)藥物多為精神藥物，依賴(lài)性、耐受性等副反應(yīng)較大［6］。因此探索一種安全有效、無(wú)副反應(yīng)、不易復(fù)發(fā)的治療方法成為目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

神門(mén)穴為手少陰心經(jīng)原穴，具有寧心安神的功能，臨床常用于治療失眠、健忘等癥狀。有研究［7］報(bào)道，通過(guò)針刺神門(mén)等穴，配合心理療法治療飛行員睡眠障礙67例，結(jié)果治愈52例，治愈率為77.6%。

圖2　各組大鼠前額葉皮質(zhì)BDNF免疫組化染色（×400）結(jié)果

Morris水迷宮是在1986年由Moorris等設(shè)計(jì)，用于測(cè)試大鼠的空間學(xué)習(xí)能力，現(xiàn)被廣泛使用［8］。SD可導(dǎo)致機(jī)體接受和語(yǔ)言表達(dá)、記憶以及復(fù)雜的口頭算數(shù)等能力下降［9］。葉晨靜等［10］研究發(fā)現(xiàn)SD可導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)反應(yīng)次數(shù)的錯(cuò)誤逐漸增加，在恢復(fù)一定時(shí)間的睡眠后，錯(cuò)誤反應(yīng)出現(xiàn)的次數(shù)漸漸下降，可見(jiàn)SSD可以影響動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力。劉國(guó)龍等［11］建立睡眠剝奪大鼠模型后，利用Morrris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，發(fā)現(xiàn)睡眠剝奪組大鼠的逃避潛伏期延長(zhǎng)，穿過(guò)原平臺(tái)位置次數(shù)和在原平臺(tái)象限探索時(shí)間百分率下降（P＜0.05）。本研究Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中定位航行及空間搜索結(jié)果顯示睡眠剝奪可導(dǎo)致大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能下降，而針刺神門(mén)穴進(jìn)行干預(yù)治療后可改善大鼠學(xué)習(xí)記憶功能。

學(xué)習(xí)記憶是腦的高級(jí)功能之一，涉及多個(gè)腦區(qū)，其中前額葉皮質(zhì)是參與了學(xué)習(xí)記憶功能的重要腦區(qū)［12］，同時(shí)眾多研究表明BDNF與大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有密切的關(guān)系［13］，BDNF可改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力作用主要通過(guò)增加海馬和大腦皮層NNMDAR受體亞單位NR1和NR22B的磷酸化水平，進(jìn)而誘導(dǎo)LTTP形成和維持，并可增加神經(jīng)元數(shù)目或突觸數(shù)目，調(diào)節(jié)突觸可塑性，影響學(xué)習(xí)記憶功能。本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠在SD24 hh后BDNF表達(dá)呈升高趨勢(shì)，而在SD72 h后則迅速下降，可見(jiàn)在SD24 h后機(jī)體可能通過(guò)增加BDNF的表達(dá)來(lái)做出相應(yīng)的應(yīng)激保護(hù)反應(yīng)，在SD72h后表達(dá)迅速下降則表明長(zhǎng)期睡眠剝奪有可能超出了機(jī)體自我調(diào)節(jié)范圍，結(jié)合Morris水迷宮結(jié)果可以看出大鼠學(xué)習(xí)記憶功能在睡眠剝奪后迅速下降；針刺組大鼠在進(jìn)行干預(yù)治療后，其前額葉皮質(zhì) BDNNF表達(dá)明顯高于模型組，而在SD72 h后則呈現(xiàn)表達(dá)下降，但仍高于模型組，結(jié)合Morrris水迷宮結(jié)果可看出針刺可以改善大鼠學(xué)習(xí)記憶功能，而其作用可能是通過(guò)促進(jìn)前額葉皮質(zhì)BDNFF表 達(dá)而改善突觸可塑性實(shí)現(xiàn)。

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Influence of Acupuncture on Learning and Memorial Function and the Expression of BDNF in Prefrontal Cortex of Rats with Sleep Deprivation

ZHAI Jia-li, CHEN Song, TIAN Jia-xing, ZHANG Xu-dong, LIU Huan, LIU Chuan-dong, ZHAO Guang-tao.Binzhou Medical College,Yantai 264003,China

ObjectiveTo investigate the influence of acupuncture on learning and memorial function and the expression of BDNF in prefrontal cortex of rats with sleep deprivation (SD), for providing theoretical evidence for treating sleep deprivation with acupuncture. MethodSixty Wistar rats were randomly divided into a control group, a model group, and an acupuncture group, 20 rats in each group. SD models were established by the modified multiple platform methods; the acupuncture group was intervened by acupuncture at Shenmen (HT 7); while the control group was left intact. Respectively after SD for 24 h and 72 h, the learning and memorial function was tested by using Morris water maze. Ten the rats were sacrificed to collect brain for detecting the expression of BDNF in prefrontal cortex via immunohistochemical method. ResultThe body weight, learning and memorial function, and the expression of BDNF in prefrontal cortex of the acupuncture group and model group were significantly different from those of the control group after SD for 24 h and 72 h (P＜0.05). The learning and memorial function of the acupuncture group was significantly different from that of the model group after SD for 24 h and 72 h (P＜0.05). The body weight and expression of BDNF in prefrontal cortex of the acupuncture group were significantly different from those of the model group after SD for 72 h (P＜0.05). ConclusionAcupuncture can obviously improve the decline of the function of learning and memory of the SD rats, and also up-regulate the declined expression of BDNF in prefrontal cortex caused by SD.

Acupuncture; Sleep deprivation; Point, Shenmen (HT 7); Learning and memorial function; BDNF; Rats

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2016.01.0094

1005-0957（2016）01-0094-04

濱州醫(yī)學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)基金（BY2013DKCX082）

翟佳麗（1984 - ），女，講師

趙光濤（1984 - ），男，實(shí)驗(yàn)師，Email:zgt2727@sina.com

2015-09-28