李書(shū)丹，宋　娜，李曉東，于曉紅

(1.齊齊哈爾中醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161000；2.哈爾濱市兒童醫(yī)院，哈爾濱 150010;3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040)

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紅樹(shù)莓原液對(duì)D-半乳糖模型小鼠抗衰老作用

李書(shū)丹1，宋娜2，李曉東1，于曉紅3*

(1.齊齊哈爾中醫(yī)院，黑龍江 齊齊哈爾 161000；2.哈爾濱市兒童醫(yī)院，哈爾濱 150010;3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040)

目的從抗氧化及免疫調(diào)節(jié)機(jī)制探討紅樹(shù)莓原液對(duì)D-半乳糖模型小鼠抗衰老作用。方法觀察測(cè)定紅樹(shù)莓原液對(duì)D-半乳糖模型小鼠的治療作用；應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)小鼠血清IL-2、IL-10水平，取小鼠肝臟測(cè)其丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)。結(jié)果紅樹(shù)莓原液可上調(diào)D-半乳糖模型小鼠IL-2的表達(dá)，下調(diào)IL-10的表達(dá)水平，可以提高GSH-Px水平，降低MDA水平。結(jié)論紅樹(shù)莓原液可以通過(guò)調(diào)節(jié)D-半乳糖模型小鼠的免疫狀態(tài)，從而起到抗衰老的作用。

紅樹(shù)莓原液；IL-2；IL-10；丙二醛；谷胱甘肽過(guò)氧化物酶

紅樹(shù)莓為半灌木性聚合漿果植物，富含多種維生素和礦質(zhì)元素，尤其富含SOD，鞣質(zhì)酸等抗癌、抗疲勞物質(zhì)，美國(guó)人稱(chēng)之為“生命之果”，是中藥覆盆子家族的一員，俗稱(chēng)“托盤(pán)”“刺莓”等[1]。藥典記載:覆盆子甘、酸、溫；歸肝、腎、膀胱經(jīng)；有益腎固精縮尿，養(yǎng)肝明目之效。民間紅樹(shù)莓也被廣泛食用，其果實(shí)柔嫩多汁，酸甜可口，具有止渴、活血及抗腫瘤等功效，已被人們作為良好的防病保健水果。遂選用D-半乳糖模型小鼠作為研究對(duì)象，研究探討其抗衰老作用。本實(shí)驗(yàn)從基因角度,通過(guò)觀察紅樹(shù)莓原液對(duì)D-半乳糖模型小鼠的IL-2、IL-10表達(dá)的影響及對(duì)D-半乳糖模型小鼠MDA、GSH-PX的影響來(lái)進(jìn)一步探討紅樹(shù)莓抗氧化的機(jī)制及其免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制，以期獲得紅樹(shù)莓抗氧化、免疫調(diào)節(jié)作用的全面認(rèn)識(shí)，為紅樹(shù)莓的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)和全面可靠的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的基礎(chǔ)資料[2]。

1　材料

1.1動(dòng)物及分組選用健康昆明系小鼠60只(購(gòu)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào):黑醫(yī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單項(xiàng)準(zhǔn)第61號(hào)。)雌雄各半，體質(zhì)量(18±2.0)g，采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、維生素E組、紅樹(shù)莓原液低劑量組(10 g/kg)、紅樹(shù)莓原液中劑量組(20 g/kg)、紅樹(shù)莓原液高劑量組(40 g/kg)，共6組，每組10只。

1.2藥物紅樹(shù)莓原液： 紅樹(shù)莓采摘于黑龍江省尚志市帽兒山，鮮果洗凈、自然干燥、搗碎(不添加蒸餾水)、抽濾去滓，獲得濃度為1.1 g/mL紅樹(shù)莓原液。臨用時(shí)倍比稀釋成不同濃度的紅樹(shù)莓原液。環(huán)磷酰胺注射液 ：購(gòu)于江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司(批號(hào)：H32026196)。甘露聚糖肽： 購(gòu)于貴州神奇制藥有限公司(批號(hào)：H52020862)。

1.3試劑小鼠IL-2、IL-10檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)R&D公司，丙二醛和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶試劑盒購(gòu)于南京建成科技有限公司，D-半乳糖、維生素E、蒸餾水、生理鹽水等均購(gòu)于哈爾濱博潤(rùn)生物科技公司。

2　方法

2.1動(dòng)物模型的制備本實(shí)驗(yàn)采用D-半乳糖亞急性人工衰老模型，即小鼠頸部皮下注射D-半乳糖劑量1 mg/(10 g·d),連續(xù)6周。觀察小鼠狀態(tài)，小鼠出現(xiàn)毛色灰暗、失去光澤、形態(tài)瘦弱、行動(dòng)緩慢、精神萎靡不振、體質(zhì)量下降，呈現(xiàn)明顯衰老體征，證明D-半乳糖衰老模型建立成功。2.2給藥方法及劑量空白組：蒸餾水灌胃0.18 mL/(10 g·d)，頸背部皮下注射生理鹽水0.1 mL/(10 g·d)。模型組：蒸餾水灌胃0.18 mL/(10 g·d)，頸背部皮下注射D-半乳糖1 mL/(10 g·d)。維生素E組：維生素E灌胃0.5 mg/(10 g·d)，頸背部皮下注射D-半乳糖1 mL/(10 g·d)。低劑量組：紅樹(shù)莓灌胃0.1 g/(10 g·d)，頸背部皮下注射D-半乳糖1 mL/(10 g·d)。中劑量組：紅樹(shù)莓灌胃0.2 g/(10 g·d)，頸背部皮下注射D-半乳糖1 mL/(10 g·d)。高劑量組：紅樹(shù)莓灌胃0.4 g/(10 g·d)，頸背部皮下注射D-半乳糖1 mL/(10 g·d)。

2.3 標(biāo)本采集及檢測(cè)

2.3.1肝臟稱(chēng)重小鼠自由進(jìn)食3 d，適應(yīng)環(huán)境。第3天稱(chēng)重，按以上劑量給藥。1次/d，連續(xù)6周。自給藥第1天起，每7 d稱(chēng)重調(diào)整給藥劑量。末次給藥后，禁食12 h，稱(chēng)重，摘眼球取血，頸椎脫臼處死，以75%乙醇浸泡消毒后取肝臟。

2.3.2小鼠血清中IL-2和IL-10含量的測(cè)定具體步驟按照所購(gòu)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，分離各組小鼠血清，應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)各組血清中IL-2和IL-10。

2.3.3小鼠肝臟中MDA和GSH-Px的測(cè)定取經(jīng)75%乙醇浸泡消毒后的肝臟，加入生理鹽水，用玻璃勻漿器充分研磨使組織漿化，制成10%勻漿。3 000 r/min離心10～15 min，取上清液。然后按照MDA和GSH-Px試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

3　結(jié)果

3.1紅樹(shù)莓原液對(duì)D-半乳糖模型小鼠IL-2和IL-10的影響見(jiàn)表1。

組　別IL?2IL?10空白組5．75±1．67　　3．94±1．19　　模型組3．04±0．88　　6．86±1．58　　維生素E組4．99±1．88##4．64±1．76##低劑量組4．48±2．30#　4．45±1．60##中劑量組4．54±1．66#　4．31±1．13##高劑量組4．21±1．92　　4．45±1．60##

注：與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

3.2紅樹(shù)莓原液對(duì)D-半乳糖模型小鼠GSH-Px、MDA的影響見(jiàn)表2。

組　別GSH?PXMDA空白組349．04±61．17　　0．76±0．160　　模型組221．12±54．91　　1．16±0．250　　維生素E組323．49±80．14##0．80±0．160##低劑量組296．14±118．65#　0．92±0．260#　中劑量組322．40±87．16#　0．85±0．240##高劑量組290．89±59．38##0．90±0．280#　

注：與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

4　討論

紅樹(shù)莓原液主要是對(duì)免疫器官的影響和對(duì)體液及細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)，從而起到抗衰老作用[3]，提高人體免疫功能延緩人體的衰老過(guò)程。T淋巴細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)方面起一定主導(dǎo)作用,根據(jù)CD4+T細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞因子種類(lèi)及介導(dǎo)功能不同，可將其分為T(mén)h1、Th2和Tr細(xì)胞，Th1型細(xì)胞主要分泌IFN-γ、IL-2、IL-12及TNF-β/α等Th1型細(xì)胞因子,主要參與細(xì)胞免疫；Th2型細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6及IL-10等Th2型細(xì)胞因子,起到輔助體液免疫應(yīng)答作用；機(jī)體免疫功能正常狀態(tài)下Th1、Th2型細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子在數(shù)量上維持一種相對(duì)平衡狀態(tài)，共同參與協(xié)調(diào)、促進(jìn)機(jī)體免疫功能的發(fā)揮,這種生理平衡狀態(tài)的打破,即Th1/Th2漂移，將引發(fā)各種疾病。IL-2是重要免疫增強(qiáng)因子，主要由活化的Th1細(xì)胞產(chǎn)生[4-7]。具有促進(jìn)T細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)LAK細(xì)胞、促進(jìn)B細(xì)胞分泌抗體、促進(jìn)T細(xì)胞殺傷作用及增強(qiáng)NKC活性等作用，主要參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)。IL-10可通過(guò)多種途徑參與免疫抑制，IL-10能減少如NO、自由基和前列腺素等炎性調(diào)節(jié)因子的分泌。實(shí)驗(yàn)研究表明，用D-半乳糖造模之后，這個(gè)平衡被打破，出現(xiàn)了Th1/Th2失衡，而紅樹(shù)莓不同劑量組給藥后，小鼠的血清中不同程度的升高了IL-2水平，并可下調(diào)IL-10水平，從而形成一種自身的正反饋調(diào)節(jié)，使機(jī)體接近正常水平，改善機(jī)體的免疫狀態(tài)，延緩免疫器官機(jī)能的衰退，從而提高機(jī)體對(duì)外界病原體的抵抗能力來(lái)抗衰老[8-12]。

MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的主要產(chǎn)物之一，可間接反映機(jī)體受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，其不僅反映評(píng)價(jià)衰老的重要指標(biāo)，更重要的是可以反映組織氧化的程度和細(xì)胞損失的程度。GSH-Px是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的抗氧化酶，可以特異性催化還原GSH對(duì)過(guò)氧化氫的還原反應(yīng)，直接反應(yīng)機(jī)體氧化程度的生化指標(biāo)[13-15]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)造模之后，機(jī)體抗氧化酶活性降低及抗氧化劑減少，使機(jī)體總抗氧化能力下降，從而防御自由基能力降低，GSH-Px、MDA的濃度的變化直接證實(shí)D-半乳糖模型小鼠造模成功，增加機(jī)體對(duì)過(guò)氧化氫的還原能力，降低機(jī)體MDA濃度，降低組織和細(xì)胞的氧化水平，機(jī)體抗氧化酶活性提高，清除自由基的能力增強(qiáng)，使抗衰老能力也得到增強(qiáng)，用藥組接近正常小鼠氧化水平[16-18]。

上述實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，紅樹(shù)莓原液可以改善機(jī)體免疫狀態(tài)，提高免疫器官的機(jī)能，增強(qiáng)對(duì)外界病原體的抵抗能力，起到抗衰老作用。同時(shí)紅樹(shù)莓原液可以降低機(jī)體的氧化水平，提高機(jī)體抗氧化能力有效的起到抗衰老作用。本實(shí)驗(yàn)為紅樹(shù)莓的分離、提純有效成分，研究開(kāi)發(fā)其醫(yī)藥保健作用等后續(xù)研究提供了基礎(chǔ)依據(jù)。

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Red raspberry on aging mice induced by D-galactose

LI Shudan1,SONG Na2,LI Xiaodong1,YU Xiaohong3*

(1.Qiqihaer Hospital of Traditional Chinese Medicine,Qiqihaer 161000,Heilongjiang Province,China;2.Children's Hospital of Harbin,Harbin 150010,China;3.Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China)

ObjectiveTo research the antioxidant and immunomodulatory effects of red raspberry on aging mice induced by D-galactose.MethodsTreatment of red raspberry on D-galactose in mice,the serum levels of IL-2 and IL-10 were assayed with ELISA,and the levels of MDA and GSH-PX of livers were examined.ResultsRed raspberry significantly up-regulated the expression of IL-2 and dow-regulated the espression of IL-10.Red Raspberry obviously increased the level GSH-PX and lower the level of MDA.ConclusionRed raspberry is able to adjust the immune status of the D-galactose model mice.So as to play the role of antiaging.

Red raspberries;IL-2;IL-10;MDA;GSH-PX

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.05.008

李書(shū)丹(1982-)，女，碩士研究生，主管檢驗(yàn)師，主要從事免疫方面的研究。

于曉紅，女，教授，碩士研究生導(dǎo)師，電子信箱-hljyxh@sina.com

R285.5

A

2095-6258(2016)05-0902-03

2016-05-24)