林集端，趙珺，2

（1華僑大學(xué)化工學(xué)院生物工程與技術(shù)系，福建 廈門 361021；2華僑大學(xué)油脂及天然產(chǎn)物研究所，福建 廈門 361021）

PEG/α-環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷水凝膠與BSA相互作用的光譜學(xué)研究

林集端1，趙珺1，2

（1華僑大學(xué)化工學(xué)院生物工程與技術(shù)系，福建 廈門 361021；2華僑大學(xué)油脂及天然產(chǎn)物研究所，福建 廈門 361021）

聚乙二醇（PEG）與環(huán)糊精（CD）自組裝形成的準(zhǔn)聚輪烷水凝膠可作為蛋白緩釋載體。在此三元體系中，PEG、CD和蛋白質(zhì)之間可能存在一定的相互作用。本文以牛血清白蛋白（BSA）為模型蛋白，通過紫外-可見吸收光譜，熒光光譜，X射線粉末衍射（XRD）和NOESY譜分析等技術(shù)，研究BSA在PEG/α-CD準(zhǔn)聚輪烷水凝膠中結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果表明BSA對(duì)水凝膠的生成速率具有顯著的影響。通過熒光光譜和同步熒光光譜分析可知，BSA在水凝膠中其三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生輕微變化，致使最大熒光發(fā)射波長發(fā)生紅移，而Trp和Tyr殘基在水凝膠中其微環(huán)境發(fā)生了微小變化。這些變化隨著BSA濃度的提高而趨于顯著。對(duì)比XRD譜圖發(fā)現(xiàn)，水凝膠在加入BSA前后，2θ = 6.56°、11.54°、12.06°、20.56°、22.04°、26.04°這些衍射角位置的譜峰發(fā)生明顯變化，說明BSA對(duì)PEG/α-CD準(zhǔn)聚輪烷的晶型有一定的改變，反映了BSA與水凝膠不只是單純的混合，而且存在形成復(fù)合物而改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的可能性。2D NOESY譜圖也表明BSA與PEG/α-CD準(zhǔn)聚輪烷之間存在氫原子的相互耦合作用，證明了兩者之間的相互作用。

準(zhǔn)聚輪烷水凝膠；牛血清白蛋白；環(huán)糊精；聚乙二醇；光譜；X射線粉末衍射

自從HARADA等［1-2］首次報(bào)道了基于聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）和環(huán)糊精（cyclodextrin，CD）的超分子組裝體以來，此類超分子組裝體在納米器件、傳感器、分子轉(zhuǎn)換器、體內(nèi)給藥釋放系統(tǒng)、基因釋放載體以及組織工程支架材料等方面得到了多方面的應(yīng)用［3-4］。在這一組裝體中，PEG穿過α-CD的空腔，形成準(zhǔn)聚輪烷［5］，并依靠氫鍵、疏水相互作用等次級(jí)鍵形成亞穩(wěn)態(tài)的凝膠狀物。這類水凝膠可作為蛋白質(zhì)或酶的緩釋載體，例如HIGASHI等［6-7］將PEG修飾胰島素或溶菌酶，而后分別與α-或γ-CD混合，制備出一種固相載藥緩釋體系。他們還報(bào)道了PEG/α-CD水凝膠對(duì)血清免疫球蛋白IgG分子具有穩(wěn)定化作用［8］。

到目前為止，盡管PEG/α-CD準(zhǔn)聚輪烷水凝膠的合成與應(yīng)用方面有很多研究，但在研究三元體系中蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的變化及其影響方面卻鮮有報(bào)導(dǎo)。探索準(zhǔn)聚輪烷水凝膠與蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，以及PEG/α-CD對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及活性的影響，對(duì)其在緩釋給藥方面的應(yīng)用具有重要意義。白蛋白是血漿中最豐富的蛋白質(zhì)，其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)早已為人們所知，它可作為許多內(nèi)源性和外源性化合物的存放和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，對(duì)生命活動(dòng)有著十分重要的作用，因此本研究將牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）作為模型蛋白，通過紫外吸收光譜、熒光光譜、X射線粉末衍射（XRD）等技術(shù)，研究PEG/α-CD準(zhǔn)聚輪烷水凝膠和BSA之間的相互作用。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1主要原料

聚乙二醇（PEG），相對(duì)分子質(zhì)量1000，分析純，西亞試劑有限公司；α-環(huán)糊精（α-CD），分析純，南京奧多福尼生物科技有限公司；牛血清白蛋白（BSA），阿拉丁試劑有限公司；二水合磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；去離子水為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2主要儀器設(shè)備

UV1800型紫外/可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；FLS920型全功能熒光光譜儀，英國Edinburgh公司；X射線粉末衍射儀，日本理學(xué)株式會(huì)社；冷凍干燥機(jī)，日本愛朗公司；500MHz/AVANCE Ⅲ型高分辨率核磁共振波譜儀，瑞士Bruker公司。

1.3準(zhǔn)聚輪烷水凝膠生成動(dòng)力學(xué)考察

用pH7.4的磷酸鹽緩沖液配制濃度為0.02g/mL的PEG溶液和0.09g/mL的α-CD溶液，并將1.6 mL α-CD溶液和0.8mL PEG溶液相混合（A液）；用上述PEG溶液配制濃度為6mg/mL的BSA溶液（B液），按一定配比加入A液混勻，并控制溶液中BSA濃度分別為0、0.33mg/mL、0.66mg/mL、1.00mg/mL、1.33mg/mL、1.66mg/mL、2.00mg/mL，用UV1800型紫外/可見分光光度計(jì)在600nm波長下測(cè)定準(zhǔn)聚輪烷水凝膠生成過程中濁度隨時(shí)間的變化曲線，即動(dòng)力學(xué)曲線，檢測(cè)時(shí)間為20min。對(duì)數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行曲線擬合，而后求導(dǎo)，取拐點(diǎn)處的導(dǎo)數(shù)值為最大生成速率vmax，并將此點(diǎn)對(duì)應(yīng)的時(shí)刻記為臨界時(shí)間tc。

1.4水凝膠中BSA的熒光光譜分析

用上述磷酸鹽緩沖液配制濃度為8×10-6mol/L的BSA溶液。在25℃下，將PEG/α-CD準(zhǔn)聚輪烷水凝膠與BSA混合，常溫放置2h，測(cè)定溶液的熒光光譜。其中，BSA溶液2mL，準(zhǔn)聚輪烷的加入量分別為0、10μL、20μL、40μL、80μL、160μL、320μL。以290nm為激發(fā)波長，在FLS920型全功能熒光光譜儀上記錄300～500nm波長范圍內(nèi)的發(fā)射光譜。同時(shí)測(cè)定溶液的同步熒光光譜，即激發(fā)和發(fā)射單色器同時(shí)進(jìn)行掃描，保持發(fā)射波長λem與激發(fā)波長λex之間的波長差Δλ=20nm，測(cè)定不同濃度水凝膠中BSA的發(fā)射峰強(qiáng)度和峰位的變化。

1.5X射線粉末衍射分析

取0.09g/mL的α-CD溶液和0.02g/mL的PEG按體積比2∶1混合，靜置2h，生成準(zhǔn)聚輪烷水凝膠后，冷凍干燥24h，制得粉末狀樣品。按同樣方法，在準(zhǔn)聚輪烷水凝膠中加入BSA，控制BSA濃度為5mg/mL，靜置2h后冷凍干燥制樣。XRD測(cè)試條件為：發(fā)射源CuKα（λ=0.154056 nm，40kV，30mA），步長0.02°，掃描速度（2θ）為5°/min。

1.6NOESY譜分析BSA結(jié)構(gòu)的變化

用D2O配置0.09g/mL的α-CD和0.02 g/mL的PEG溶液按體積比2∶1混合，加入BSA，使其濃度為60mg/mL，靜置2h，生成準(zhǔn)聚輪烷后，測(cè)NOESY譜。另外，測(cè)準(zhǔn)聚輪烷BSA的NOESY譜。2D NOESY譜采用90°脈沖序列（90°-T1-90°-Tm-90°-T2），混合時(shí)間為200ms，采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)陣2048×256；實(shí)驗(yàn)溫度為30℃。

2　結(jié)果與討論

2.1準(zhǔn)聚輪烷水凝膠生成動(dòng)力學(xué)及BSA的影響

準(zhǔn)聚輪烷水凝膠形成過程的動(dòng)力學(xué)曲線如圖1所示。PEG與α-CD混合后，經(jīng)過一段時(shí)間后，濁度快速上升，而在達(dá)到拐點(diǎn)后濁度上升的速率逐漸減緩，最終達(dá)到極值，表現(xiàn)出“S”形曲線。圖1表明，隨著水凝膠中BSA濃度的增加，達(dá)到同樣濁度所需的時(shí)間逐漸變長，表明水凝膠的生成速率下降。通過曲線擬合及求導(dǎo)而得不同BSA濃度下vmax和tc的值及其變化情況，如圖2所示。從圖2中可看出，隨著BSA濃度的提高，vmax逐漸下降，而tc逐漸延長。這一現(xiàn)象說明BSA與水凝膠之間存在一定的相互作用，BSA的存在將延緩PEG與α-CD的自組裝。這一方面可能是由BSA與α-CD的相互作用所致，主要表現(xiàn)為BSA的局部疏水性區(qū)域的芳香族氨基酸殘基（如苯丙氨酸Phe、色氨酸Trp、酪氨酸Tyr等）被未反應(yīng)的α-CD所占據(jù)，導(dǎo)致BSA與PEG的競(jìng)爭反應(yīng)致使反應(yīng)速率降低［9-10］。另一方面，BSA與PEG也存在相互作用，當(dāng)PEG分子量大到一定程度時(shí)，會(huì)與蛋白質(zhì)相互纏繞，將蛋白質(zhì)包裹住，使BSA無形中阻礙了PEG的自由度，導(dǎo)致PEG與CD的碰撞概率降低［11］。

圖1　BSA對(duì)準(zhǔn)聚輪烷形成的影響

圖2　不同BSA濃度下準(zhǔn)聚輪烷形成的Vmax與tc

2.2準(zhǔn)聚輪烷水凝膠對(duì)BSA熒光強(qiáng)度的影響

BSA是一種熒光較強(qiáng)的蛋白質(zhì)，每個(gè)BSA分子含有26個(gè)Phe殘基，19個(gè)Tyr殘基和2個(gè)Trp殘基，這3種氨基酸殘基自身都具有熒光性。在測(cè)定蛋白質(zhì)的熒光光譜時(shí)，通常Phe和Tyr的能量會(huì)轉(zhuǎn)移到Trp上，因此，大多數(shù)蛋白質(zhì)（包括BSA）所顯現(xiàn)的熒光幾乎都是Trp的熒光。在BSA中，2個(gè)Trp殘基分別位于134位和213位，而熒光主要是由213位的Trp殘基引起的［12］。在2.1節(jié)中提到BSA與準(zhǔn)聚輪烷發(fā)生了相互作用，為了進(jìn)一步的說明這種相互作用的存在，測(cè)定了在不同量的準(zhǔn)聚輪烷存在下的BSA的熒光光譜。圖3為在加入不同量的準(zhǔn)聚輪烷水凝膠時(shí)BSA的熒光光譜。從圖3可知，水凝膠自身并不具有熒光性，但是當(dāng)加入量增大到一定程度時(shí)，BSA的熒光強(qiáng)度隨著水凝膠濃度的增加逐漸降低。作者認(rèn)為這可能是由于準(zhǔn)聚輪烷水凝膠形成的過程中，逐漸把蛋白質(zhì)包裹在其中，當(dāng)凝膠的量大時(shí)，在物理結(jié)構(gòu)上會(huì)顯得比較硬，使得蛋白質(zhì)分子被束縛在其中，空間上變得“擁擠”，分子運(yùn)動(dòng)受到一定限制，甚至?xí)斐扇?jí)結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致Trp殘基周圍微環(huán)境的變化，從而使BSA的熒光強(qiáng)度降低。但是在水凝膠濃度比較低時(shí)，其結(jié)構(gòu)較松軟，對(duì)BSA的束縛程度小，所以熒光強(qiáng)度的降低并不明顯。另外，據(jù)RAWAT等［13］的報(bào)道，聚乙二醇會(huì)和BSA發(fā)生相互作用，當(dāng)BSA分子的三級(jí)結(jié)構(gòu)在溶液中稍微發(fā)生解折疊時(shí)，Trp殘基會(huì)逐漸暴露在溶液中并與聚乙二醇發(fā)生相互作用，致使BSA熒光強(qiáng)度降低并紅移。在本實(shí)驗(yàn)中，BSA的熒光光譜也發(fā)生了5nm的輕微紅移，這與RAWAT等的結(jié)論一致。

由以上的分析可以得到BSA的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了輕微的變化，至少蛋白質(zhì)的部分部位發(fā)生了變化。為進(jìn)一步說明這種變化的存在，測(cè)定了BSA的同步熒光光譜，設(shè)定Δλ=20nm，考察另一種氨基酸殘基Tyr殘基微環(huán)境的變化，結(jié)果如圖4所示。從圖4中可以看到，隨著加入的水凝膠量的增加，熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸降低，并且發(fā)生輕微的藍(lán)移現(xiàn)象，說明Tyr殘基的微環(huán)境也發(fā)生了微小的變化。由此可以基本確定當(dāng)BSA中加入準(zhǔn)聚輪烷水凝膠時(shí)，蛋白結(jié)構(gòu)會(huì)有一定的變化，但變化幅度很小。HIGASHI等［6，12］所做的緩釋體系的研究結(jié)果也間接證明這一結(jié)論。

2.3BSA與PEG/α-CD準(zhǔn)聚輪烷在固相時(shí)的XRD衍射圖譜分析

為了探討B(tài)SA與PEG/α-CD體系在固相狀態(tài)下的相互作用，可采用XRD圖譜進(jìn)行比較分析。圖5為BSA與準(zhǔn)聚輪烷相互作用前后，BSA、準(zhǔn)聚輪烷及其三元水凝膠體系的XRD圖譜。比較準(zhǔn)聚輪烷與BSA/水凝膠的XRD圖，可以看到兩者的峰形大體上一致，但在6.56°、11.54°、13.16°、20.56°這些2θ值的位置，BSA/水凝膠具有一些新的峰，而在11.36°、13.08°、22.04°等處BSA/水凝膠不具有準(zhǔn)聚輪烷的衍射峰。比較BSA與BSA/準(zhǔn)聚輪烷的XRD圖可以看到，BSA在與準(zhǔn)聚輪烷混合前后峰形發(fā)生了很大的變化，BSA除了在22°和32°～34°的峰與BSA/水凝膠比較一致外，其余角度的BSA衍射峰在與準(zhǔn)聚輪烷混合后均消失。由此可以得出結(jié)論，BSA與準(zhǔn)聚輪烷不只是單純的混合，它們?cè)谌芤褐袝?huì)發(fā)生一定的相互作用，甚至可能生成復(fù)合物，致使水凝膠的晶型結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

圖3　不同準(zhǔn)聚輪烷濃度下BSA的熒光光譜

圖4　不同準(zhǔn)聚輪烷濃度下BSA的同步熒光光譜

圖5　X射線粉末衍射圖

2.4BSA與PEG/α-CD準(zhǔn)聚輪烷相互作用的NOESY譜

二維核磁共振中的NOESY譜是研究蛋白結(jié)構(gòu)變化的一種常用手段，可用于分析化合物內(nèi)所有空間距離相近的氫原子對(duì)。圖6為BSA與PEG/α-CD準(zhǔn)聚輪烷相互作用前后的NOESY譜。從圖中可以看出BSA與PEG/α-CD結(jié)合前后兩者部分基團(tuán)的化學(xué)位移都發(fā)生的一定的變化。比較圖6（a）和圖6（b），在BSA與準(zhǔn)聚輪烷結(jié)合前后，在化學(xué)位移1.3附近，BSA的氫原子發(fā)生了偏移，可歸屬為BSA中脂肪族氨基酸（纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸等）側(cè)鏈氫原子的峰［14］，說明BSA中脂肪族氨基酸側(cè)鏈與準(zhǔn)聚輪烷的空間距離近，可以發(fā)生一定的相互作用。BSA中芳香族氨基酸氫原子的特征峰出現(xiàn)在3～4.5附近，但與PEG/α-CD準(zhǔn)聚輪烷的峰存在交疊。比較圖6（a）和圖6（c）在3.4～4和5附近的峰，可以看出PEG/α-CD準(zhǔn)聚輪烷的峰發(fā)生了明顯的變化，說明PEG/α-CD準(zhǔn)聚輪烷氫原子與BSA中的氫原子之間產(chǎn)生了相互耦合作用?；谝陨嫌懻摽梢哉J(rèn)為，BSA與PEG/α-CD準(zhǔn)聚輪烷之間存在相互作用。

圖6　BSA與PEG/α-CD準(zhǔn)聚輪烷相互作用的NOESY譜

3　結(jié) 論

通過紫外-可見吸收光譜、熒光光譜、XRD、NOESY譜分析等技術(shù)對(duì)BSA和準(zhǔn)聚輪烷水凝膠混合物的分析，可以得出以下主要結(jié)論。

（1）在準(zhǔn)聚輪烷水凝膠體系中，隨著BSA濃度的提高，BSA會(huì)抑制PEG和α-CD的穿環(huán)反應(yīng)而使水凝膠的形成速率減緩。

（2）BSA與準(zhǔn)聚輪烷形成的三元體系中，它們的作用是相互的，不僅是BSA會(huì)影響準(zhǔn)聚輪烷的形成速率和晶型結(jié)構(gòu)，而且當(dāng)準(zhǔn)聚輪烷濃度逐漸增大時(shí)，BSA的構(gòu)象也會(huì)受到準(zhǔn)聚輪烷的影響而發(fā)生變化。

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Spectroscopic study of the interaction between PEG/α-cyclodextrin pseudopolyrotaxane hydrogel with BSA

LIN Jiduan1，ZHAO Jun1，2
（1Department of Bioengineering and Biotechnology，College of Chemical Engineering，Huaqiao University，Xiamen 361021，F(xiàn)ujian，China；2Institute of Oil and Natural Products，Huaqiao University，Xiamen 361021，F(xiàn)ujian，China）

Self-assembled pseudopolyrotaxane hydrogel formed by polyethylene glycol（PEG）and cyclodextrin（CD）can be used as a slow-release carrier for proteins. In this ternary system，there may be certain interactions between PEG，CD and proteins. With bovine serum albumin（BSA）as the model protein，the structure changes of BSA in the PEG/α-CD pseudopolyrotaxane hydrogel was studied by ultraviolet-visible absorption spectrum，fluorescence spectrum，powder X-ray diffraction（XRD）techniques，and NOESY spectra. The results showed that BSA had a significant effect on the formation rate of the hydrogel. The fluorescence and synchronous fluorescence spectrum analysis showed that the ternary structure of BSA had minor changes in the hydrogel，which led to red-shift of the maximum fluorescence emission wavelength，and the microenvironment of Trp and Tyr residues also changed slightly in the hydrogel. These changes became more significant with the increasing of BSA concentration. Moreover，when BSA was added，the diffraction angles in XRD spectra at 2θ = 6.56°，11.54°，12.06°，20.56°，22.04°and 26.04°showed remarkable changes compared with those of the pure pseudopolyrotaxane，demonstrating that the crystalline pattern of PEG/α-CD pseudopolyrotaxane was changed in the presence of BSA. The results reflected that BSA was not simply physically mixed with the PEG/α-CD pseudopolyrotaxane hydrogel，but that it might prefer to form complexes with the hydrogel. 2D NOESY spectra also showed that the presence of mutual coupling of hydrogen atoms between BSA and PEG/α-CD，demonstrated the interaction between them.

pseudopolyrotaxane hydrogel；bovine serum albumin；cyclodextrin；polyethylene glycol；spectroscopy；powder X-ray diffraction

O 636.1

A

1000-6613（2016）11-3590-05

10.16085/j.issn.1000-6613.2016.11.031

2016-01-28；修改稿日期：2016-06-15。

福建省自然科學(xué)基金（2013J05028）、華僑大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目（11BS408）及華僑大學(xué)研究生科研創(chuàng)新能力培育計(jì)劃項(xiàng)目。

林集端（1990—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)榄h(huán)糊精水凝膠。聯(lián)系人：趙珺，博士，講師。E-mail zhaojun@hqu.edu.cn。