王文濤，仇建華，段紅，常巧呈，路義鑫，王春仁，彭博

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶　163319；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院）

貝氏貝諾孢子蟲巢式PCR檢測方法的建立

王文濤1，2，仇建華1，段紅1，常巧呈1，路義鑫2，王春仁1，彭博

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶163319；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院）

根據(jù)GenBank上發(fā)表的貝氏貝諾孢子蟲核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列，在傳統(tǒng)PCR方法的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)一對(duì)特異性內(nèi)引物，提取病牛血液中貝氏貝諾孢子蟲基因組DNA，建立了貝氏貝諾孢子蟲巢氏PCR檢測方法并進(jìn)行臨床樣品檢測。結(jié)果表明，建立的巢式PCR檢測方法能檢測到貝氏貝諾孢子蟲DNA的最低濃度為24.3 ag·μL-1，剛地弓形蟲、犬新孢子蟲、牛巴貝斯蟲、環(huán)形泰勒蟲、邊緣無漿體DNA檢測均為陰性。196份臨床血液樣本，檢測出3份陽性，陽性率為1.53%。由此可見，研究所建立的巢氏PCR檢測方法具有較高的特異性和敏感性，可用于牛貝諾孢子蟲病的早期臨床診斷。

貝氏貝諾孢子蟲；巢氏PCR；檢測；核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)

牛貝諾孢子蟲?。˙ovine besnoitiosis），又稱牛球孢子蟲?。˙ovine cutaneous globidiosis）或橡皮?。╡lephant skin disease），是由住肉孢子蟲科（Sarcocystidae）、貝諾孢子蟲屬（Besnoitia）的貝氏貝諾孢子蟲（Besnoitia besnoiti）寄生于牛眼、皮膚和生殖系統(tǒng)等部位引起的一種原蟲?。?］。該病主要引起牛皮膚增厚、龜裂，母牛流產(chǎn)、產(chǎn)奶量下降，公牛精液質(zhì)量下降，嚴(yán)重時(shí)引起死亡，給養(yǎng)牛業(yè)造成很嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［2］。貝氏貝諾孢子蟲（Besnoitia besnoiti）1912年首次由Besnoit和Robin在法國南部發(fā)現(xiàn)并報(bào)道［3］，2010年歐盟食品安全委員會(huì)（EFSA）將牛貝諾孢子蟲病列為重要的新興疾?。?］。中國的北京、吉林、黑龍江、內(nèi)蒙古等地有該病流行的報(bào)道［1，5-7］。該病的診斷主要依賴于臨床癥狀和病原檢查，但此時(shí)急性期已過，失去了治療價(jià)值。目前雖然國外也建立了血清學(xué)和分子生物學(xué)診斷方法，但是抗原或檢測時(shí)間及其他原因，國內(nèi)還未見商品化診斷試劑盒。因此，研究擬建立一種牛貝諾孢子蟲巢式PCR檢測方法，用于牛貝諾孢子蟲急性感染和早期診斷，為該病的臨床檢測、流行病學(xué)調(diào)查等提供了一種新型的可靠的檢測方法。

1　材料與方法

1.1待檢材料與對(duì)照蟲株

待檢材料采自黑龍江省大慶市、哈爾濱市、齊齊哈爾市、農(nóng)墾北安地區(qū)的奶牛群，無菌采集外周血樣196份，-20℃保存；貝諾孢子蟲DNA由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室保存，對(duì)照蟲株剛地弓形蟲、犬新孢子蟲、牛巴貝斯蟲、環(huán)形泰勒蟲和邊緣無漿體DNA由國內(nèi)兄弟院所惠贈(zèng)。

1.2主要試劑

全血DNA使用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒提取，按照使用說明操作；Ex Taq DNA聚合酶、pMD18-T載體、dNTP mixture（25 mmol each）、DNA Marker等為大連寶生物（Takara）公司產(chǎn)品；其余常規(guī)試劑為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品；制備感受態(tài)細(xì)胞所用的菌種大腸桿菌JM109由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)寄生蟲研究室保存。

1.3引物設(shè)計(jì)

對(duì)GenBank上發(fā)表的貝氏貝諾孢子蟲ITS基因序列進(jìn)行比對(duì)，尋找到保守區(qū)間設(shè)計(jì)引物。根據(jù)相關(guān)研究選擇（B1：5'-TGA CAT TTA ATA ACA ATC AAC CCT T-3［8］和B2：5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3［9］）作為外引物；應(yīng)用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)內(nèi)引物（B3：5'-CCA CCT CCT CAC TCT GCT AT-3，B4：5'-TCC TCT GTG TTC ATT ATT CC-3）。外引物預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段為1 000 bp，內(nèi)引物預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段為400 bp，均由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4DNA的提取

利用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒，按照使用說明操作提取貝氏貝諾孢子蟲基因組DNA。

1.5巢氏PCR擴(kuò)增

以提取的DNA為模板，利用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行擴(kuò)增，第一輪PCR用外引物B1和B2。反應(yīng)體系為：10× Ex Taq buffer 2.5 μL，dNTP mixture（2.5 mmol each）2 μL，上、下游引物（25 mM）各0.5 μL，模板DNA 1 μL，Ex Taq（5 U·μL-1）0.2 μL，加水至25 μL。反應(yīng)條件為94℃5 min，94℃1 min，54.6℃1 min，72℃1 min，35個(gè)循環(huán)，72℃10 min，-20℃保存。第二輪PCR用內(nèi)引物B3和B4擴(kuò)增，以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，反應(yīng)體系為：10×Ex Taq buffer 2.5 μL，dNTP mixture（2.5 mmol each）2 μL，上、下游引物（25 mM）各0.5 μL，模板DNA 1 μL，Ex Taq（5 U·μL-1）0.2 μL，加水至25 μL。反應(yīng)條件為：94℃5 min，94℃1 min，49.8℃1 min，72℃30 s，35個(gè)循環(huán)，72℃10 min，-20℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)產(chǎn)物5 μL，加入1 μL的6×Loading buffer，混勻后于1%瓊脂糖凝膠（EB濃度為5 μg·mL-1）中100 V電壓下電泳30 min，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。

1.6擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆及鑒定

用DNA膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收與純化，與pMD18-T于16℃過夜連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞JM109，在氨芐抗性平板上篩選出可疑陽性克隆株，送上海生工生物工程公司測序。

1.7特異性實(shí)驗(yàn)

以貝氏貝諾孢子蟲、剛地弓形蟲、犬新孢子蟲、牛巴貝斯蟲、環(huán)形泰勒蟲和邊緣無漿體總基因組DNA為模板，進(jìn)行巢氏PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照。

1.8敏感性試驗(yàn)

將測定濃度的貝氏貝諾孢子蟲DNA按1∶10連續(xù)倍比稀釋，分別以不同稀釋度DNA為模板進(jìn)行巢氏PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照。

1.9重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

隨機(jī)抽取隨機(jī)3個(gè)陽性樣品和2個(gè)陰性樣品，應(yīng)用建立的巢氏PCR方法進(jìn)行3次重復(fù)擴(kuò)增。

1.10樣品檢測

應(yīng)用所建立的巢氏PCR方法對(duì)黑龍江省部分地區(qū)196份奶牛血液樣品提取DNA并進(jìn)行檢測。

2　結(jié)果

2.1目的基因的序列測定

回收的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接成功，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞JM109，對(duì)陽性克隆進(jìn)行測序鑒定，獲得800 bp的目的片段，與GenBank收錄的貝氏貝諾孢子蟲（GenBank NO.AY833646.1）相應(yīng)片段的同源性為100%。

2.2特異性試驗(yàn)

兩輪PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%凝膠電泳觀察，發(fā)現(xiàn)只有貝氏貝諾孢子蟲在393 bp位置有單一條帶，并且與預(yù)期的條帶相符，其余樣品均無條帶（圖1，2），表明該方法具有良好的特異性。

2.3敏感性實(shí)驗(yàn)

圖1　貝氏貝諾孢子蟲常規(guī)PCR特異性檢測擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1Agarose gel electrophoresis of PCR products of specificity of B.besnoiti samples

單獨(dú)使用B1/B2引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，在泳道1-7均能擴(kuò)增出800 bp的單一條帶，表明病原檢測的最低濃度為24.3 fg·μL-1（圖3）。使用引物B3和B4進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，在泳道1-6均能擴(kuò)增出393 bp的條帶，表明該次檢測的病原最低濃度為24.3 ag·μL-1。結(jié)果顯示，研究的巢式PCR檢測靈敏度是單獨(dú)使用引物B1/B2進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增檢測靈敏度的1 000倍（圖4）。

圖2　巢式PCR特異性檢測擴(kuò)增結(jié)果Fig. 2Agarose gel electrophoresis of nested PCR products of specificity of B.besnoiti samples

圖3　貝諾孢子蟲常規(guī)PCR敏感性檢測擴(kuò)增結(jié)果Fig.3Agarosegel electrophoresis of PCR products of sensitivity of B.besnoiti samples

2.4重復(fù)性試驗(yàn)

隨機(jī)抽取的3份陽性和2陰性樣本，用所建立的巢氏PCR方法擴(kuò)增后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳顯示，陽性樣本約在393 bp位置處出現(xiàn)了目的基因片段，陰性無條帶，重復(fù)操作3次后得到的結(jié)果完全一致。

圖4　貝諾孢子蟲巢式PCR敏感性檢測擴(kuò)增Fig.4Agarose gel electrophoresis of nested PCR products of sensitivity of B.besnoiti samples

2.5臨床樣品的檢測

應(yīng)用所建立的巢氏PCR方法對(duì)黑龍江省部分地區(qū)奶牛貝諾孢子蟲感染情況進(jìn)行調(diào)查。共檢測196份血液樣品，結(jié)果檢出3份陽性樣本，感染率為1.53%，但北安地區(qū)5個(gè)牛場和哈爾濱地區(qū)4個(gè)牛場均未檢出陽性樣本，詳見表1。檢出的3頭陽性奶牛均出現(xiàn)了急性或臨床癥狀，有2頭還檢出了包囊，因此陽性符合率為100%。

表1　黑龍江省部分地區(qū)牛貝諾孢子蟲的感染情況Table 1The infection of Besnoitia besnoiti at some regions in Heilongjiang Province

3　討論

與其它重要的寄生蟲如弓形蟲、瘧原蟲、錐蟲等相比，目前對(duì)貝諾孢子蟲病的研究還停留在初級(jí)階段，尤其近幾年以來該病在世界范圍內(nèi)又出現(xiàn)再次爆發(fā)的現(xiàn)象，歐盟食品安全委員會(huì)（EFSA）認(rèn)為該病是“新興的疾病”［4］，盡管每年采取撲殺病牛的措施，但仍然無法根治該病。我國的黑龍江省部分地區(qū)也有再次出現(xiàn)的跡象，給畜牧業(yè)造成很大損失。所以建立一種快速、敏感、特異的診斷方法，用于病畜篩選和流行病學(xué)調(diào)查，具有重要意義。

目前對(duì)牛貝氏貝諾孢子蟲的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要有病原學(xué)檢查、血清學(xué)檢查和分子生物學(xué)診斷。病原學(xué)診斷學(xué)方法是通過觀察包囊內(nèi)的緩殖子以及血液中的速殖子形態(tài)結(jié)合臨床癥狀進(jìn)行診斷；血清學(xué)方法主要有間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和免疫印跡（Western Blot）等方法［2］，但這些方法應(yīng)用的抗原都是貝諾孢子蟲的蟲體抗原，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。國外雖然也建立了熒光定量PCR檢測牛貝諾孢子蟲方法［10-11］，但也仍然處于研究階段，還未見商品用診斷試劑盒。本研究所建立的牛貝諾孢子蟲巢式PCR診斷方法DNA來源于血液，血液中速殖子的出現(xiàn)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于皮膚包囊，因此該診斷方法具有早期的特點(diǎn)。同時(shí)巢式PCR診斷方法不但提高了PCR反應(yīng)的特異性，同時(shí)也提高了反應(yīng)的敏感性，檢測最低濃度為24.3 ag·μL-1，比普通PCR的敏感性高達(dá)1 000倍，適合用來檢測病牛感染初期較低拷貝數(shù)的模板。因此，研究所建立的巢氏PCR診斷方法具有快速、敏感、特異等優(yōu)點(diǎn)，適合對(duì)牛貝諾孢子蟲病的早期診斷。

［1］胡力生，段自芳，湛萬山，等. 牛球孢子蟲病三例報(bào)告［J］.吉林畜牧獸醫(yī)，1981（5）：4.

［2］lvarez-Garc G，F(xiàn)rey CF，Mora LMO，et al.A century of bovine besnoitiosis：an unknown disease re-emerging in Europe［J］.Trends in Parasitology，2013，29，407-415.

［3］Besnoit C，Robin V. Sarcosporidiose cutanée chez une vache［J］. Revue vétérinaire，1912，37：649-663.

［4］European Food Safety Authority （EFSA）. Bovine Besnoitiosis：An emerging disease in Europe ［J］. European Food Safety Authority EFSA Journal，2010（2）：1499.

［5］劉爾翔. 在北京牛體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的貝氏貝諾孢子蟲［J］. 動(dòng)物學(xué)報(bào)，1957（3）：212-220.

［6］柳春華，楊毅昌，于亞強(qiáng)，等. 大慶地區(qū)發(fā)生奶牛貝諾孢子蟲病的報(bào)告［J］. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，1992（1）：30-33.

［7］劉文多，王祥生. 哲盟地區(qū)牛球孢子蟲病“厚皮病”的調(diào)查研究［J］. 中國獸醫(yī)雜志，1982（9）：10-12.

［8］Cortes H C E，Reis Y，Gottstein B，et al. Application of conventional and real-time fluorescent ITS1 rDNA PCR for detection of Besnoitia besnoiti infections in bovine skin biopsies［J］. Veterinary Parasitology，2007，146（3）：352-356.

［9］Schares G，Maksimov A，Basso W G. et al.Quantitative real time polymerase chain reaction assays for the sensitive detection of Besnoitia besnoiti infection in cattle［J］. Veterinary Parasitology 2011，178：208-216.

Establishment of Nested PCR Method for Besnoitia besnoiti

Wang Wentao1，2，Qiu Jianhua1，Duan Hong1，Chang Qiaocheng1，Lu Yixin2，Wang Chunren1，Peng Bo
（1.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University）

Based on the ITS rDNA sequence of Besnoitia besnoiti available in GenBank，two specific PCR primers were designed. Total genomic DNA for B.besnoiti was isolated from blood samples of the sick dairy cow，and the nested PCR method for B.besnoiti was established to detect clinical samples.The results showed that using the nested PCR method，the minimum detectable concentration was 24.3 ag·μL-1，and Toxoplasma gondii，Neospora caninum，Babesia bovis，Theileria annulata and Anaplasmataceae marginal pathogens were negative.The positive rate of B.besnoiti was 1.53%in 196 blood samples.The nested PCR method in this study had high sensitivity and specificity and could be used for early diagnosis of Bovine besnoitiosis.

Besnoitia besnoiti；nested PCR；detection；ITS rDNA

Q78

A

1002-2090（2016）02-0045-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.02.009

2015-09-15

黑龍江省科技攻關(guān)項(xiàng)目（GZ13B001）；黑龍江省農(nóng)墾總局科技攻關(guān)項(xiàng)目（HNK125B-11-4）；大慶市科技局計(jì)劃項(xiàng)目（SZDFY-2015-21）；黑龍江省動(dòng)物普通疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題（120101）。

王文濤（1987-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院2012級(jí)碩士研究生。

王春仁，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：chunrenwang@sohu.com。