童依婷，晏冬華，彭文煊，黃靜華，黃洪濱，易潤(rùn)華

（廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東　湛江　524088）

朱蕉葉枯病菌的鑒定及生物學(xué)特性

童依婷，晏冬華，彭文煊，黃靜華，黃洪濱，易潤(rùn)華

（廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣東湛江524088）

通過(guò)致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)特性和系統(tǒng)發(fā)育分析，確定引起朱蕉葉枯病的病原菌為輪狀鐮刀菌 Fusarium verticillioides （Saccardo） Nirenberg。研究表明，在測(cè)試的7種培養(yǎng)基中，PDA最有利于病原菌生長(zhǎng)，PSCA最有利于產(chǎn)孢。以蜂蜜為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，產(chǎn)孢量最大，而以檸檬酸鈉作碳源時(shí)生長(zhǎng)最慢，產(chǎn)孢量最??； 以蛋白胨為氮源時(shí)生長(zhǎng)最快，而以酵母膏為氮源時(shí)產(chǎn)孢量最大。病原菌的最適生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的溫度為25℃，在pH值為8時(shí)生長(zhǎng)速率最快，pH值為7時(shí)產(chǎn)孢量最大。光照對(duì)病原菌生長(zhǎng)影響差異顯著，對(duì)產(chǎn)孢量影響差異不顯著。

朱蕉；葉枯病；輪狀鐮刀菌；生物學(xué)特性

朱蕉（Cordyline fruticosa Chevalier 1919），別稱(chēng)鐵樹(shù)，為龍舌蘭科（Laxmanniaceae）朱蕉屬（Cordyline）灌木植物，在亞洲、澳大利亞、太平洋島嶼、南美等地區(qū)及我國(guó)廣東、廣西、海南、臺(tái)灣等省種植廣泛。朱蕉莖高約1～3m，不分枝或很少分枝，葉淡紅色至紫色，株形美觀(guān)，色彩鮮艷，花色誘人，是一種觀(guān)賞價(jià)值極高的植物，其葉可用于服飾、庭院裝飾和食品包裝等［1］。朱蕉也是一種藥用植物［2］，可治療腹瀉等疾病［3］，葉片含有甾體皂苷，具有很好的抗菌和抑制腫瘤細(xì)胞的作用［4］。在種植中，出現(xiàn)一種葉枯病，導(dǎo)致葉片枯萎，植株中下部的葉片枯萎死亡，嚴(yán)重影響觀(guān)賞價(jià)值。為確定引起朱蕉葉枯病的病原菌，本研究從廣東海洋大學(xué)校區(qū)發(fā)病植株中分離出病原菌，對(duì)其進(jìn)行致病性測(cè)定，根據(jù)形態(tài)學(xué)和ITS序列分析確定病原菌的分類(lèi)地位，并研究病原菌生物學(xué)特性，以期為該病害防治提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病原菌 從朱蕉病葉上分離得到。

1.1.2培養(yǎng)基（1）馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）；（2）察氏培養(yǎng)基（CDM）；（3）燕麥培養(yǎng)基（OMA）；（4）馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基（PSA）；（5）燕麥培養(yǎng)基（OMA）：燕麥片30.0g，瓊脂20.0g，H2O 1000mL；（6）葡萄糖蛋白胨酵母膏培養(yǎng)基（GTYA）：蛋白胨2.0g，酵母菌1.0g，葡萄糖10.0g，瓊脂20.0g，H2O 1000mL；（7）馬鈴薯蔗糖朱蕉葉培養(yǎng)基（PSCA）：馬鈴薯200.0g，蔗糖20.0g，朱蕉葉50.0g，瓊脂20.0g，H2O 1 000 mL。

1.1.3主要儀器OLYMPUS BX5顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；Nikon DXM 1200F數(shù)碼顯微成像系統(tǒng)（日本Nikon公司）；ABI-9700 PCR儀（美國(guó)ABI公司）。

1.2方法

1.2.1病原菌的分離采集朱蕉葉枯病病害標(biāo)本，清水沖洗干凈，剪取葉片病健交界處5mm × 5mm大小的組織，用無(wú)菌水清洗后，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇洗1min，無(wú)菌水沖洗3次，以1g/L的升汞消毒40～50 s，無(wú)菌水沖洗3次后，將組織塊接種到PDA平板培養(yǎng)基，置 30℃倒置培養(yǎng)。長(zhǎng)出菌絲后挑取菌絲先端接種純化。產(chǎn)孢后，進(jìn)行單孢分離獲取病原菌的純培養(yǎng)。

1.2.2致病性測(cè)定將病原菌接種到 PDA培養(yǎng)基黑暗培養(yǎng)3 d后備用。選取朱蕉健康葉片用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇消毒后，用針稍微刺傷葉片，接種孢子濃度為105～106個(gè)/mL的孢子懸浮液和5mm的菌餅，用無(wú)菌水和瓊脂塊對(duì)照。接種后用塑料袋包好保濕。致病性測(cè)定在室外和室內(nèi)進(jìn)行。

1.2.3病原菌鑒定形態(tài)學(xué)觀(guān)察：參考 Leslie和Summerell方法［5］，觀(guān)察病原菌在PDA培養(yǎng)基25℃黑暗培養(yǎng)7天的菌落大小和形態(tài)特征。將培養(yǎng)基放入凹玻片中，接種孢子懸浮液后，置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)1～3 d，觀(guān)察產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和孢子形態(tài)，測(cè)量孢子大小等。

ITS序列分析：將病原菌接種到PDA培養(yǎng)基，25℃下恒溫黑暗培養(yǎng)3d，用無(wú)菌牙簽挑取少許菌絲放入 PCR反應(yīng)管中，按照 LU等［6］方法進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增ITS序列。引物為ITS 4（TCC TCC GC TTA TTG ATA TGC）和ITS 5（GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G）［8］。用TaKaRa公司的MightyAmp DNA Polymerase Ver.2試劑盒配置PCR反應(yīng)體系，含1×MightyAmp Buffer，0.2μM上下游引物，1.25U MightyAmp DNA聚合酶體積50μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?8℃預(yù)變性，2min；98℃變性10 s；56℃退火15 s；68℃延伸 1min；35個(gè)循環(huán)。PCR 產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。所得序列在GenBank進(jìn)行BLAST，比較其與近緣種的同源性。

在GengBank中選取16個(gè)與病原菌親緣關(guān)系較近的近緣種序列，用MEGA 6.0軟件［7］的Clustal W模塊進(jìn)行序列比對(duì)后，采用鄰接法（Neighbor -joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，采用自舉法（Bootstrap）進(jìn)行1 000次循環(huán)檢測(cè)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的可信度。比對(duì)后的序列矩陣用jModelTest V2.1.4［8］分析，根據(jù)BIC準(zhǔn)則（Bayesian information criterion，BIC）選擇核苷酸替換最優(yōu)模型（TPM2+G），MrBayes3.2軟件［9］進(jìn)行貝葉斯分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。分析程序?yàn)椋簂set nst = 6 rates = invgamma； unlink statefreq =（all）revmat =（all）shape =（all）pinvar =（all）；prset applyto =（all）ratepr = variable；mcmcp ngen = 10000000 relburnin = yes burninfrac = 0.25 printfreq = 1000 samplefreq = 1000 nchains = 4 savebrlens = yes。用馬爾科夫鏈蒙特卡羅法（Markov Chain Monte Carlo method，MCMC）計(jì)算后驗(yàn)概率（Posterior probability）［10］，評(píng)價(jià)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的可信度。

1.2.4生物學(xué)特性測(cè)定培養(yǎng)基、碳源、氮源、pH、溫度和光照等因素對(duì)病原菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響。

菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量測(cè)定：將病原菌接種到PDA平板培養(yǎng)基中，25℃黑暗培養(yǎng)3 d，取7mm菌餅接種至直徑9cm的平板培養(yǎng)基培養(yǎng)4 d，采用十字交叉法測(cè)量菌落生長(zhǎng)直徑，6 d后，用無(wú)菌水將每個(gè)培養(yǎng)皿的病原菌孢子洗出，適當(dāng)稀釋后測(cè)量孢子數(shù)量。在測(cè)量不同培養(yǎng)基、碳源、氮源和pH對(duì)病原菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢影響時(shí)，培養(yǎng)條件為25℃黑暗。

培養(yǎng)基：將病原菌分別接種到PDA、OMA、SCS、GTY、PSA、PSCA、CDM 7種培養(yǎng)基。

碳源：用等質(zhì)量的D-麥芽糖、蜂蜜、肌醇、甘油、可溶性淀粉、檸檬酸鈉、纖維素鈉、乳糖、甘露醇、葡糖糖分別代替察氏培養(yǎng)基中的蔗糖作為碳源。

氮源：用等質(zhì)量的甘氨酸、胰蛋白胨、酵母膏、氯化銨、尿素、L-苯丙氨酸、硫酸銨、硝酸鉀、水解乳蛋白和牛肉浸膏分別代替察氏培養(yǎng)基中的硝酸鈉作為氮源。

pH：將PDA培養(yǎng)基的pH調(diào)至2、3、4、5、6、7、8、9和10。

溫度：將病原菌接種至PDA培養(yǎng)基，置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃和45℃培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)。

光照：將病原菌接種至PDA培養(yǎng)基，置于25℃培養(yǎng)箱，分別用24h 黑暗，12h光照 + 12h黑暗和24h光照處理。

1.2.5數(shù)據(jù)分析用SPSS 19.0軟件進(jìn)行顯著性和Duncan新復(fù)方差分析。

2　結(jié)果與分析

2.1朱蕉葉枯病病癥與致病性測(cè)定

朱蕉葉枯病一般發(fā)生在葉緣或葉部表面，病害多從植株中上部葉片的葉緣發(fā)生，病斑多不規(guī)則，黑褐色，中間淺褐色至白色，病斑逐步擴(kuò)大蔓延整個(gè)葉片，導(dǎo)致葉片干枯死亡（圖1 A）；在葉片表面發(fā)病初期出現(xiàn)小點(diǎn)，后形成水漬狀病斑，病斑圓形或橢圓形，隨著病害發(fā)展，病斑變淺黃褐色，病斑邊緣形成黃色暈圈（圖1 B），后期病斑不規(guī)則，邊緣黃褐色，中間白色（圖1 C）。

將從病斑中分離到的菌株孢子或菌絲接種到健康朱蕉葉片，3～5 d后在室內(nèi)和室外的接種葉片均出現(xiàn)水漬狀病斑，15 d后室外接種的葉片發(fā)病癥狀與自然發(fā)病的癥狀一致（圖1 D）。從人工接種的發(fā)病葉片中分離得到同樣的菌，證實(shí)所接種的菌株為朱蕉葉枯病菌。

圖1　朱蕉葉枯病癥狀Fig 1　Symptoms of leaf blight on ti plant

2.2病原菌鑒定

形態(tài)學(xué)特征：病原菌在 PDA培養(yǎng)基中生長(zhǎng)迅速，氣生菌絲棉絮狀、濃密發(fā)達(dá)，形成繩狀或束梗狀，不產(chǎn)生分生孢子座；菌落表面白色至淺紫色，背面淺紫色（圖2 A和B）。分生孢子梗從氣生菌絲中長(zhǎng)出，不分枝或呈輪枝狀分枝，單瓶梗產(chǎn)孢，分生孢子排列呈鏈狀或形成假頭狀（圖2 C，D和E）。產(chǎn)兩種分生孢子（圖2 F和G），大孢子少見(jiàn)，鐮刀形，細(xì)長(zhǎng)，中部較直，兩端略彎，3～5分隔，（20.24～35.01）×（2.98～4.35）μm；小孢子豐富，形狀多樣，卵形至棍棒狀，0～1分隔（圖2 H-P），（4.78～12.63）×（2.03～3.52）μm。無(wú)厚垣孢子形成。朱蕉葉枯病菌與輪狀鐮刀菌 Fusarium verticillioides的形態(tài)特征一致［5，11-12］。

用通用引物擴(kuò)增朱蕉葉枯菌得到的ITS序列，長(zhǎng)度為 555 bp（KX119132），在 NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST，結(jié)果顯示，朱蕉葉枯病菌的 TS序列與GenBank中的輪狀鐮刀菌F.verticillioides（有性型Gibberella moniliformis），藤倉(cāng)鐮孢F.fujikuroi（有性型G.fujikuroi），尖孢鐮刀菌F.oxysporum和層出鐮刀菌 F.proliferatum 的同源性為 100%。從Genebank選取近緣種構(gòu)建鄰接樹(shù)和貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，朱蕉葉枯病菌與它們處于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的同一分支（圖3），其形態(tài)學(xué)差異見(jiàn)表1。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，將朱蕉葉枯病菌鑒定為輪狀鐮刀菌Fusarium verticillioides （Saccardo） Nirenberg。

圖2　病原菌形態(tài)特征Fig.2　Morphologic characteristic of F.verticillioides causing leaf blight on ti plant

圖3　基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig 3.Phylogenetic tree of Fusarium species reconstructed by neighbor-joining （NJ） and Bayesian inference （BI） using ITS sequence dataset

表1　朱蕉葉枯病菌與其近緣種形態(tài)特征比較Table 1　Morphological comparison of pathogen of leaf blight on ti plant with the relative Fusarium spp.

2.3病原菌的菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量

2.3.1培養(yǎng)基病原菌在7種培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)速度與產(chǎn)孢量差異顯著（P＜0.05）（圖 4）。菌落直徑依次為：PDA ＞PSCA ＞PSA ＞SCS ＞CDM ＞ OMA＞GTYA，其中在PDA、PSCA和PSA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)差異不顯著，在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，菌落直徑為61.5mm；產(chǎn)孢量依次為：PSCA ＞PSA ＞PDA＞CDM ＞SCS ＞GTYA ＞OMA，其中PSCA培養(yǎng)基最有利于病原菌產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量為 5.17×108個(gè)/皿，而OMA、SCS和GTYA培養(yǎng)基不利于病原菌產(chǎn)孢，OMA產(chǎn)孢量最低，僅為4.0×106個(gè)/皿。

2.3.2碳、氮源朱蕉葉枯病菌在含不同碳、氮源的培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)與產(chǎn)孢量差異顯著（P＜0.05）（表2）。病原菌在以蜂蜜、蔗糖、肌醇、甘露醇、淀粉、葡萄糖、乳糖和麥芽糖為碳源時(shí)，菌絲生長(zhǎng)差異不顯著，但以蜂蜜為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，產(chǎn)孢量也最大，菌落直徑和產(chǎn)孢量分別為54.5mm和10.94×108個(gè)/皿，而以檸檬酸鈉作碳源生長(zhǎng)最慢，產(chǎn)孢量最小，菌落直徑和產(chǎn)孢量分別為28.8mm和1.3×107個(gè)/皿；在以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，而以硫酸銨為氮源生長(zhǎng)最慢，4 d后菌落直徑分別為60.7mm和32.5mm；以酵母膏為氮源時(shí)，病原菌的產(chǎn)孢量最大，為5.04×108個(gè)/皿，在缺乏氮源時(shí)，不產(chǎn)生孢子。

2.3.3溫度與pH病原菌在5℃以下，35℃以上不生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，在10～30℃范圍內(nèi)可生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，適合生長(zhǎng)的溫度范圍20～30℃，最適生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的溫度為25℃，菌落直徑和產(chǎn)孢量分別為52.3mm和5.92×108個(gè)/皿（表3）。病原菌在pH值為2～10的PDA培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，pH值為8時(shí)生長(zhǎng)速度最快，菌落直徑為57.2mm，pH值為7時(shí)最有利于產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量為6.40×108個(gè)/皿。

圖4　培養(yǎng)基對(duì)朱蕉葉枯病菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響Figure 4　Effect of different medium on mycelia growth and sporulation of pathogen causing leaf blight on ti plant

2.3.4光照在不同光照條件下病原菌生長(zhǎng)差異顯著（P＜0.05），用24h 黑暗、12h光照+12h黑暗和24h光照處理后，菌落直徑分別為 51.5，45.0和41.3mm，在黑暗條件下生長(zhǎng)最快；光照處理對(duì)產(chǎn)孢量沒(méi)有顯著影響（P＞0.05），在24h 黑暗、12h光照+12h黑暗和24h光照條件下，產(chǎn)孢量分別為4.38×108，4.00×108和3.77×108個(gè)/皿。

表2　碳、氮源對(duì)朱蕉葉枯病菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響Table 2　Effect of carbon sources and nitrogen sources on the mycelial growth and sporulation of pathogen causing leaf blight on ti plant

表3　溫度和pH對(duì)朱蕉葉枯病菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響Table 3　Effect of temperatures and pH values on the mycelial growth and sporulation of pathogen causing leaf blight on ti plant

3　討論與結(jié)論

鐮刀菌Fusarium在世界范圍分布廣，可產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物，人、動(dòng)物和植物的很多病害都是由鐮刀菌引起［5］。鐮刀菌通常以形態(tài)學(xué)特性分類(lèi)，但是有時(shí)兩個(gè)種的形態(tài)差異非常微小，很難區(qū)分。根據(jù)家系一致系統(tǒng)發(fā)育種識(shí)別（Genealogical concordance phylogenetic species recognition，GCPSR）原理，利用多位點(diǎn)序列分型（Multilocus sequence typing，MLST）可有效確定物種間的親緣關(guān)系，區(qū)分微生物的物種和姊妹種［13］。復(fù)合種（Species complex）是指形態(tài)學(xué)特征差異微小，親緣關(guān)系相近的種的集合，O'Donnell等利用MLST-GCPSR將鐮刀菌分成20個(gè)復(fù)合種和9個(gè)單型系（Monotypic lineages）［14］。朱蕉葉枯病菌具輪枝狀分枝的特征與 Gibberella fujikuroi復(fù) 合 種 的 輪 狀 鐮 刀 菌 Fusarium verticillioides一致，與其它種明顯不同［12］。本研究通過(guò)致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)特征和系統(tǒng)發(fā)育分析，確定引起朱蕉葉枯病的病原菌為輪狀鐮刀菌Fusarium verticillioides。

輪狀鐮刀菌F.verticillioides（異名：串珠鐮刀菌F.moniliforme）在全球分布廣泛，可侵染32科61屬約116650種植物，大多數(shù)是重要糧食作物［15］，如侵染玉米苗、莖桿和玉米穗而嚴(yán)重影響玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)［16］，侵染水稻和甘蔗［17］、玉米的野生近緣種（Zea spp.）［18］、蘆筍（Asparagus spp.）［19］等。輪狀鐮刀菌F.verticillioides侵染人或動(dòng)物引起角膜炎、皮膚炎和腹膜炎等疾病［20］，也侵染農(nóng)業(yè)昆蟲(chóng)［21-23］。筆者發(fā)現(xiàn)輪狀鐮刀菌 F.verticillioides可侵染朱蕉引起葉枯病。

生物學(xué)特性研究表明病原菌在25℃時(shí)生長(zhǎng)速度快，產(chǎn)孢量最大，朱蕉葉枯病在廣東湛江地區(qū)常年發(fā)生，10—11月氣溫利于病原菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，導(dǎo)致病害發(fā)生嚴(yán)重。多菌靈、百菌清、三唑酮和甲基托布津?qū)啝铉牭毒?F.verticillioides的生長(zhǎng)、產(chǎn)孢和分生孢子萌發(fā)有抑制效果［24］，在田間使用烯哇醇對(duì)由輪狀鐮刀菌F.verticillioides引起的玉米穗腐病有85.8%的防效［25］。這些藥劑在發(fā)病初期可用于朱蕉葉枯病的防治。

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（責(zé)任編輯：陳莊）

Identification and Biological Characteristics of Fusarium verticillioides（Saccardo）Nirenberg Causing Leaf Blight on Ti Plant（Cordvline fruticosa Chevalier）

TONG Yi-ting，YAN Dong-hua，PENG Wen-xuan，HUANG Jing-hua，HUANG Hong-bin，YI Run-hua
（Agricultural College，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China）

The pathogen of leaf blight on ti plant（Cordyline fruticosa Chevalier）was recognized as Fusarium verticillioides（Saccardo）Nirenberg according to the pathogenicity tests，the biological characteristics and phylogenetic analysis.The results of biological characteristics showed that among the seven tested media，the pathogen grew fastest and sporulated richest on potato dextrose agar（PDA）medium and potato sugar Cordyline fruticosa leaf agar（PSCA）； the Czapek-Dox medium（CDM）with equal quality of honey to substitute as carbon source was most favorable for the mycelial growth and sporulation of F.verticillioides，while with sodium citrate was most unfavorable among the eleven tested carbon sources； the best nitrogen source for the mycelial growth and sporulation were peptone and yeast extract respectively among the tested nitrogen sources； the temperature 25℃ was optimum for the mycelial growth and sporulation； the mycelial growth was encouraged by pH 8.0 and the sporulation was by pH 7.0； light treatments had no significant effect on the sporulation but it had significant on the mycelial growth of the pathogen of leaf blight on ti plant.

Ti plan（tCordvline fruticosa）；leaf blight；Fusarium verticillioides；biological characteristics

S436.8

A

1673-9159（2016）04-0089-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.04.015

2016-04-22

國(guó)家級(jí)和廣東海洋大學(xué)學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目【校教務(wù)〔2012〕31號(hào)CXXL12026】

童依婷（1991—），女，2015屆植物保護(hù)專(zhuān)業(yè)。

易潤(rùn)華，男，博士，副教授，從事植物病理學(xué)研究。E-mail：scibyrh@163.com