孔松芝，李東東，李繼城，溫莎莎，李鴻祥，佘燕敏

（廣東海洋大學理學院，廣東 湛江 524088）

羥基紅花黃色素A對Aβ25-35誘導PC12細胞凋亡的保護作用

孔松芝，李東東，李繼城，溫莎莎，李鴻祥，佘燕敏

（廣東海洋大學理學院，廣東 湛江 524088）

為探討羥基紅花黃色素A（HSYA）對β-淀粉樣蛋白（Aβ）25-35誘導的神經元樣PC12細胞凋亡的影響，并闡明其可能的作用機制，采用Aβ25-35（20μmol/L）誘導PC12細胞凋亡建立AD細胞模型，以不同濃度HSYA（20，40，80μmol/L）對抗干預，使用形態(tài)學觀察法及Hoechst染色法檢測各組PC12細胞凋亡形態(tài)，MTT法檢測各組細胞存活率，Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測細胞凋亡率，同時應用RT-PCR檢測細胞PUMA mRNA的表達變化。結果表明，HSYA可維持PC12細胞及其突觸的正常形態(tài)，提高細胞存活率，明顯抑制細胞凋亡，下調促凋亡蛋白PUMA mRNA的表達，與Aβ25-35組差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.01）。HSYA可明顯對抗Aβ引發(fā)的神經元樣PC12細胞損傷，其保護作用機制與下調PUMA mRNA的表達量有關。

羥基紅花黃色素A；阿爾茨海默?。籄β25-35；PC12 細胞；凋亡

阿爾茲海默?。ˋlzheimer's disease，AD）即通常所謂的老年癡呆癥，是一種與年齡甚為相關的慢性、進行性中樞神經系統(tǒng)退行性疾?。?-2］。AD的病因至今尚未十分明確，當前其最受認可的發(fā)病機制是淀粉樣沉積說（Amyloid cascade hypothesis）；簡而言之，氧化應激、炎癥以及遞質代謝異常等病變因素均可導致β淀粉樣蛋白（amyloid beta protein，Aβ）的異常裂解及代謝紊亂，使Aβ生成增多并異常沉積，進而形成神經炎性斑、誘導神經元凋亡，從而導致AD的發(fā)生及發(fā)展［3-4］。因此，Aβ，尤其是其毒性片段Aβ25-35（由Aβ的第25-35位氨基酸組成），常被應用于AD細胞模型的構建。此外，大鼠腎上腺嗜鉻細胞株（Pheochromocytoma，PC12細胞株）因除擁有神經內分泌細胞的典型特性外，還具有類型單一、可傳代培養(yǎng)、細胞特性穩(wěn)定等優(yōu)勢，而被廣泛應用于研究神經細胞的病理、生理學研究［5-6］。因此，利用毒性片段Aβ25-35與神經元樣PC12細胞作用建立的細胞模型，已成為迄今為止國際上公認的體外AD細胞研究模型?；诖?，本研究以PC12細胞為載體，利用Aβ25-35構建AD細胞模型。

羥基紅花黃色素A（Hydroxysafflor yellow A，HSYA）來源于菊科植物紅花 Carthamus tinctorius L.的干燥花，是紅花活血化瘀的主要效應成分［7-9］。目前，已被大量藥理研究證實具有良好抗腦缺血、抗氧化、清除自由基、減輕腦組織水腫等作用［10-12］，并且對缺血神經元線粒體的損傷有十分明顯的保護作用［13］；然而，至今仍鮮有其抗AD活性方面的直接報道。因此，本研究選HSYA為處理因素，采用上述經典AD細胞模型，觀察HSYA對Aβ25-35誘導PC12細胞凋亡的影響并對其機制進行初步研究，旨在為HSYA用于AD 的防治提供基礎藥理學依據(jù)。

1　實驗材料

1.1供試細胞株

大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞（PC12細胞）（低分化型），由香港中文大學中醫(yī)學院林志秀教授惠贈。

1.2藥物與主要試劑

羥基紅花黃色素A（純度：HPLC≥98%）由山西華輝凱德制藥有限公司惠贈，DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、馬血清（HS）、胰蛋白酶購自美國Gibco公司，Aβ25-35、神經生長因子（NGF）由美國Sigma公司提供，Hoechst 33342、四甲基偶氮唑鹽（MTT）購于河北博海生物工程公司，臺盼藍購自上?；瘜W試劑總廠，AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒由美國Genzyme公司提供，總RNA提取試劑盒（TRIzol法）、RT-PCR試劑、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）均購于 Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒，由美國Applied Biosystems 公司提供。

1.3主要儀器

超凈工作臺SW-CJ-1F（江蘇蘇凈集團），倒置熒光顯微鏡 1X70（日本 Olympus公司），F(xiàn)ACSCalibur 流式細胞儀（美國Becton Dickinson 公司），CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國SHELLAB公司），實時熒光定量PCR 儀（RT-PCR，德國 EPPENDORF 公司）。

2　實驗方法

2.1聚集態(tài)Aβ25-35的配制

精密稱取Aβ25-35粉末溶于去離子雙蒸水中，配成1 mmol/L的儲存液，0.22 μm濾膜過濾除菌后，于37°C環(huán)境中孵育7 d，以使其形成聚集態(tài)Aβ25-35，分裝，-20°C避光保存，使用時根據(jù)需要稀釋于DMEM培養(yǎng)基中。

2.2細胞培養(yǎng)及分化

PC12 細胞培養(yǎng)于含有 10% 胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基中，置37℃、5% CO2的恒溫箱中培養(yǎng)，第2 天加入NGF（終濃度為50μg/L），2-3 d后細胞分化為神經元樣細胞。

2.3實驗分組及處理

收集神經元樣PC12細胞后調整細胞濃度，并將該細胞以適當?shù)拿芏冉臃N于96孔（約2×104個/孔）、24孔（約1×105個/孔）或6孔（約1×106個/孔）培養(yǎng)板中，按處理方式不同分為：空白對照組（Control組）、20μmol /L Aβ25-35處理組（Aβ組）、20μmol/L HSYA+Aβ組、40μmol/L HSYA +Aβ組以及80μmol/L HSYA+Aβ組，根據(jù)測定指標的不同每組設置3或6個復孔。細胞貼壁培養(yǎng)24h后，吸棄DMEM完全培養(yǎng)液，Control組和Aβ組更換為無血清DMEM培養(yǎng)液，其余3組分別更換為含相應劑量的HSYA的無血清培養(yǎng)液。以上各組換液培養(yǎng)2h后，除Control組外其余各組再給予Aβ25-35處理，繼續(xù)培養(yǎng)24h。細胞培養(yǎng)結束后，按要求對其進行各項指標的檢測。

2.4顯微鏡觀察PC12細胞的形態(tài)變化

收集PC12細胞，將其以1×106個/孔的密度接種于6 孔培養(yǎng)板上，按2.3所示的方法分組培養(yǎng)并處理細胞，每組設3個復孔，培養(yǎng)結束后，用倒置熒光顯微鏡對各組細胞進行形態(tài)學觀察分析。

2.5MTT法檢測PC12細胞的活性

收集PC12細胞，將其以2×104個/孔的密度接種于96 孔培養(yǎng)板上（每孔100μL），按2.3所示的方法分組培養(yǎng)并處理細胞，每組設6個復孔，培養(yǎng)結束后，每孔加入20μL MTT溶液（5 mg/mL），37℃孵育4h后，小心吸棄各孔內液體，每孔再加入150μL 二甲基亞砜（DMSO），避光振蕩 10～15min，全自動酶標儀測定570 nm波長處各孔吸收值（D）。細胞存活率按以下公式計算：

細胞存活率= D實驗組/ D對照組×100%

2.6Hoechst 33342 染色法檢測細胞凋亡

收集PC12細胞，以1×105個/孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板中，按2.3所示的方法分組培養(yǎng)并處理細胞，每組設3個復孔。培養(yǎng)結束后，吸去培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定10min，磷酸緩沖液（PBS）輕柔漂洗3min×2 次后，向各孔加入0.5 mL新鮮配制的Hoechst 33342 染色工作液（終濃度10μg/mL），避光孵育5min，PBS 輕柔漂洗 5min×3 次后，各孔均隨機選取視野，利用倒置熒光顯微鏡觀察細胞內熒光著色情況并攝片記錄。

2.7Annexin-Ⅴ/PI雙染流式細胞儀檢測凋亡

收集PC12細胞，將其以1×106個/孔的密度接種于6 孔培養(yǎng)板上，按2.3所示的方法分組培養(yǎng)并處理細胞，每組設6個復孔，培養(yǎng)結束后，加入不含EDTA的胰酶消化、離心收集細胞于離心管內，PBS沖洗2次，棄上清，每管加入500μL的Binding Buffer懸浮細胞，并將其移入流式管中，加入5μL的Annexin V-FITC以及5μL Propidium Iodid混勻；避光反應10min，用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況（激發(fā)波長λx=488 nm；發(fā)射波長λm=530 nm）。

正常細胞（Annexin V-/PI-）、凋亡細胞（凋亡早期Annexin V+/PI-+ 凋亡晚期Annexin V+/PI+）以及死細胞（Annexin V-/PI+）。

2.8RT-PCR檢測PUMA mRNA的表達變化

收集PC12細胞，將其以1×106個/孔的密度接種于6 孔培養(yǎng)板上，按2.3所示的方法分組培養(yǎng)并處理細胞，以1×107個/組的量收獲PC12細胞，分別移入1.5 mL EP管中，根據(jù)Invitrogen公司生產的TRIzol 的操作手冊進行總 RNA 的提取。向RNAase-free 的PCR 管中，加入1.5μg RNA，按逆轉錄試劑盒（Applied Biosystems 公司）操作，進行第一鏈cDNA 的合成。引物序列如下：

表1　分析mRNA表達量的所用引物序列Table 1　Primers used for analysis of mRNA expression levels

取上述合成的 cDNA產物 1 μL作為模板，DEPC水13.9 μL、l0 × Taq Buffer 10 μL、25 mmol/L MgC12l.2 μL、l0 mmol/L dNTP mix 0.5 μL、Taq DNA聚合酶0.4 μL、上下游引物各0.5 μL，用水補足至50μL，混勻后置于RT-PCR擴增儀上。PCR擴增條件為：95℃ 5min，94℃ 30 s，54℃ 40 s，72℃30 s，30 cycles，72℃ 7min。

反應結束后，采用相對定量法比較各基因的表達差異，以GAPDH作為內參基因，以循環(huán)閾值（C）作為計算各樣本中 mRNA的相對表達量。計算公式：

2.9統(tǒng)計方法

采用 SPSS17.0 統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料以平均值 ± 標準誤差表示，各組間差異比較用單因素方差分析（One-Way ANOVA），方差齊時組內兩兩多重比較采用LSD法，方差不齊時組內兩兩多重比較采Dunnett's T3法，以P ＜ 0.05為差異有顯著性。

3　實驗結果

3.1HSYA對Aβ25-35損傷PC12細胞形態(tài)的影響

不同濃度的HSYA和/或Aβ25-35干預細胞結束后，于倒置光學顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)。結果如圖1所示，正常組PC12細胞呈多角型貼壁狀態(tài)生長（貼附良好）、胞體飽滿并帶有數(shù)個伸展充分的突起（如圖1箭頭所示）；與Control組細胞相比，Aβ組（20μmol/L for 24h）細胞的狀態(tài)明顯變差，部分細胞胞體腫脹變圓，突起變短、變細甚至消失，細胞間連接變稀疏，視野內可見較多的脫落細胞及其碎片（如圖1圈內細胞）。除20μmol/L HSYA對Aβ?lián)p傷細胞的保護作用不明顯外，HSYA （40，80μmol/L）保護組對Aβ?lián)p傷細胞均有一定程度的保護作用，神經元樣PC12細胞生長狀態(tài)良好，細胞腫脹減少且立體感較好，細胞突起基本存在，少見脫落細胞及其碎片。即 40μmol/L及 80μmol/L的HSYA對Aβ25-35損傷的 PC12 細胞形態(tài)具有明顯改善作用。

圖1　HSYA對Aβ25-35損傷PC12細胞形態(tài)的影響 （200×）Fig.1　Effect of HSYA on cellular morphology of Aβ25-35-treated PC12 cells （200×）

3.2HSYA對Aβ25-35損傷PC12細胞活性的影響

本實驗采用MTT法檢測HSYA（20、40、80 μmol/L）對PC12細胞活性的影響。結果如圖2所示，Aβ?lián)p傷組與空白對照組相比較細胞存活率顯著降低（P ＜ 0.001）；20μmol/L HSYA保護組的細胞存活率與Aβ?lián)p傷組相比有一定程度的增高，但未顯示出統(tǒng)計學差異（P ＞ 0.05）；40～80μmol/L HSYA藥物保護組與Aβ?lián)p傷組相比，細胞存活率顯著升高（P＜0.01），表明HSYA具有拮抗Aβ對PC12細胞毒性的作用。

圖2　HSYA對Aβ25-35損傷PC12細胞活性的影響Fig.2　Effect of HSYA on cell viability in Aβ25-35-treated PC12 cells

3.3Hoechst 33342染色顯微鏡觀察細胞凋亡

Hoechst 33342 能夠和染色體結合，在熒光顯微鏡下可觀察到正常染色體和濃縮染色體，正常染色體核較大、呈圓形，均勻低強度藍色熒光；細胞凋亡時其染色質固縮，核斷裂并形成凋亡小體，呈致密濃染或碎塊狀致密濃染的藍色熒光。Hoechst 核染色實驗結果顯示，正常對照組PC12細胞僅有少量的染色體深染、核濃縮的凋亡細胞；與 Control組比較，Aβ組細胞出現(xiàn)明顯的核深染、核濃縮，凋亡細胞數(shù)目明顯增加（如圖3圈內細胞）；與Aβ組比較，各濃度HSYA組細胞凋亡數(shù)目均有所減少，且呈劑量依賴性趨勢。表明20μmol/L Aβ處理PC12細胞24h能夠誘導細胞大幅凋亡，HSYA對Aβ誘導的PC12細胞凋亡具有明顯的抑制作用。

圖3　Hoechst 33342染色法檢測HSYA對Aβ25-35誘導PC12細胞凋亡的影響 （400×）Fig.3　Effect of HSYA on the PC12 cells apoptosis staining with Hoechst 33342 induced by Aβ25-35（400 ×）

3.4HSYA對Aβ25-35損傷PC12細胞凋亡的影響

本研究采用 Annexin V/PI 雙染色法，利用流式細胞儀對PC12細胞的凋亡情況進行了定量分析。實驗結果如圖4所示，空白對照組細胞的凋亡率（凋亡細胞率 = E2+E4）為4.5%，Aβ25-35損傷組細胞的細胞凋亡率顯著增加至45.3%；加入HSYA（20、40、80 μmol）保護以后，各藥物處理組分別將Aβ25-35誘導的細胞凋亡率降至35.2%、19.1%、9.8%，與Aβ處理組相較均具有極顯著性差異（P ＜ 0.001）。以上研究結果提示：毒性片段 Aβ25-35可以引起明顯的PC12細胞凋亡，具有顯著的細胞毒性；而 HSYA能夠有效地抑制Aβ25-35對PC12細胞的毒性，表現(xiàn)出較強的神經保護作用。

圖4　Annexin V-FITC/PI雙染法流式細胞術檢測HSYA對Aβ25-35誘導PC12細胞凋亡的影響Fig.4　Effect of HSYA on apoptosis rate in Aβ25-35-treated PC12 cells

3.5HSYA對Aβ25-35損傷PC12細胞PUMA mRNA表達的影響

PUMA是屬于Bcl-2家族的一種促凋亡蛋白，具有強大的促凋亡作用。RT-PCR分析顯示（見圖5），與 Control組相比，Aβ組促凋亡蛋白 PUMA mRNA 的表達極顯著增加（P ＜ 0.001）；與Aβ25-35損傷組相比，HSYA 20μmol處理可降低細胞內PUMA mRNA 的表達水平，但無統(tǒng)計學差異（P ＞0.05）；而較高濃度HSYA（40、80μmol）干預后可不同程度的降低Aβ 誘導升高的PUMA mRNA 水平，其中80μmol HSYA作用極為顯著（P ＜ 0.001）。

圖5　HSYA對Aβ25-35損傷PC12 細胞PUMA mRNA表達水平的影響Fig.5　Effect of HSYA on Aβ25-35-induced PUMA gene expression in PC12 cells

4　討　論

羥基紅花黃色素 A（HSYA）是具有單查爾酮苷類結構的化合物，其分子質量為612 ku（分子式為 C27H32O16），屬于小分子水溶性物質，可以通過細胞的內吞作用、易化擴散進入細胞；此外，當前的市售產品注射用紅花黃色素（商品名：樂坦，國藥準字：Z20050146），其規(guī)格為50 mg/支（含羥基紅花色素A 35 mg），已被廣泛用于治療冠心病、心絞痛，然而其在腦部疾?。ㄓ绕涫钱斍案甙l(fā)的AD）中的研究鮮有報道［7，10］。本研究中，我們以神經元樣PC12細胞為載體，利用Aβ25-35構建AD細胞模型，并在此模型基礎上考察HSYA的神經保護作用，為HSYA用于AD 的防治提供初步基礎藥理學依據(jù)；同時，參照前人的研究設計方式，我們采用正常及模型對照對受試物的作用進行評價。本研究利用形態(tài)學觀察及 MTT法對其保護作用進行初步考察，檢測結果一致表明：HSYA能夠顯著提高Aβ25-35損傷細胞的細胞活性并維持其正常形態(tài)，提高受損細胞的存活率，有效對抗Aβ25-35誘發(fā)的神經細胞毒性。為進一步檢測HSYA的保護作用，本研究同時利用定性、定量手段對細胞凋亡狀況進行了系統(tǒng)分析。Hoechst染色后，凋亡細胞的核體明顯縮小，斷裂成凋亡小體，呈致密濃染的固縮形式或碎塊狀致密熒光。Hoechst常用的染色劑有Hoechst33258和Hoeehst33342兩種，本研究采用的Hoeehst33342細胞滲透性相對較高，具有更好的染色效果。實驗中我們在熒光顯微鏡下觀察到Aβ25-35可誘導PC12細胞產生明顯凋亡，視野下可見多數(shù)呈致密熒光的小核體；HSYA保護后受Aβ25-35誘導凋亡的PC12細胞明顯減少，鏡下大多為正常細胞核形態(tài)，呈均勻低強度藍色熒光。此外，我們又通過AimexinV-FITC/PI雙染流式細胞術對細胞凋亡狀況進行了定量分析，并對其凋亡周期進行了相應分析；結果顯示，20～80μmol的HSYA能夠有效地同時抑制Aβ25-35誘導神經元樣PC12細胞的早期及晚期凋亡，使其凋亡率劑量依賴性的大幅降低從而對抗Aβ引發(fā)的神經細胞毒性。

隨著對AD神經元凋亡研究的日益深入，目前最公認的參與其凋亡的分子調控主要包括Bcl-2家族、caspase家族、P53家族等；其中Bcl-2基因家族是目前研究最為廣泛的一類AD神經元凋亡相關基因，其表達和調控水平在神經元凋亡信號轉導途徑中發(fā)揮著核心作用。而PUMA是屬于Bcl-2家族的一種具有強大促凋亡作用的促凋亡蛋白，僅有一個BH3結構域。通過該結構域，PUMA可與Bcl-2家族多種抗凋亡成員（如Bcl-2和Bcl-xl等）產生廣泛的相互作用，使原本結合于抗凋亡蛋白上的Bax解離并多聚化，進而轉位激活線粒體依賴的內源性凋亡通路，而發(fā)揮強大的促細胞凋亡作用［14-15］。鑒于以上論述，本研究又利用RT-PCR技術對細胞PUMA mRNA的水平進行檢測，以期初步闡明HSYA對Aβ?lián)p傷PC12細胞保護作用的機制。實驗結果證實 Aβ25-35可顯著上調促凋亡蛋白 PUMA mRNA的表達，從而誘導PC12細胞大量凋亡；而HSYA保護處理可明顯抑制Aβ25-35誘導的PC12細胞凋亡的發(fā)生，顯著改善Aβ引發(fā)的細胞內PUMA mRNA的異常表達，從而維持細胞的正常生理狀態(tài)。依據(jù)上述實驗結果，我們認為 HSYA能有效抑制Aβ25-35誘導的細胞凋亡，其作用機制與下調促凋亡因子PUMA mRNA及Bax的表達相關；然而，其中明確的分子關聯(lián)以及信號轉導途徑尚不清晰，亟待進一步的研究。

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（責任編輯：任萬森）

Protective Effect of Hydroxysafflor Yellow A on Aβ25-35-Induced Apoptosis in PC12 Cells

KONG Song-zhi，LI Dong-dong，LI Ji-cheng，WEN Sha-sha，LI Hong-xiang，SHE Yan-min
（College of Science，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China）

To investigate the protective effect of Hydroxysafflor yellow A （HSYA） on Aβ25-35-induced apoptosis in PC12 cells，the neuron-like cells，and to explore its possible mechanisms，in this study，the cells were pretreated with different concentrations （20，40 and 80μmol/L） of HSYA and then further treated with Aβ25-35（20μmol/L），which was used to establish the classical in vitro model of AD.The morphological observation and Hoechst staining method were applied to evaluate cell apoptosis morphology.MTT assay and flow cytometry were used to measure cell viability and cell apoptotic rate，respectively.Meanwhile，the mRNA expression of pro-apoptotic protein PUMA was detected by RT-PCR.The data showed that HSYA could maintain the normal morphology and structure of the cell as well as its synapses，significantly increased cell viability，and reduced its apoptosis rate and the mRNA level of PUMA.Based on these findings，HSYA could effectively inhibit the apoptosis of the neuron-like cells，PC12 cells，induced by Aβ25-35.The protective effect of this natural compound is，at least partially，associated with inhibiting the mRNA level of PUMA.

hydroxysafflor yellow A； alzheimer's disease； Aβ25-35； PC12 cells； apoptosis

R285.5

A

1673-9159（2016）04-0083-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2016.04.014

2016-03-13

廣東省自然科學基金-博士啟動項目（2015A030310360）； 廣東海洋大學優(yōu)秀青年骨干教師特別資助計劃項目（002014）；廣東海洋大學創(chuàng)新強校工程科研項目（GDOU2016050229）

孔松芝（1983—），女，博士，從事中藥新藥開發(fā)研究。Email：kongsongzhi@126.com