剡 倩　張苗苗　郭曉鵬　李文建　陸 棟（中國科學(xué)院近代物理研究所　蘭州 730000）

2（中國科學(xué)院大學(xué)　北京 100049）

X射線誘變選育嗜酸氧化亞鐵硫桿菌及其對(duì)難處理金礦浸出的研究

剡 倩1，2張苗苗1郭曉鵬1，2李文建1陸 棟1
1（中國科學(xué)院近代物理研究所蘭州 730000）

2（中國科學(xué)院大學(xué)北京 100049）

為了探討嗜酸氧化亞鐵硫桿菌（Acidithiobacillus ferrooxidans， At.f）經(jīng)X射線誘變后對(duì)難處理金礦的預(yù)氧化效果和金浸出率的影響，采用不同劑量的 X射線誘變處理At.f，通過微生物學(xué)方法和相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定，獲得優(yōu)良的At.f菌株。結(jié)果顯示，經(jīng)X射線輻照至吸收劑量為450 Gy時(shí)，At.f對(duì)Fe的浸出率達(dá)50.24%，礦石預(yù)氧化效果比原始菌株提高44%，金浸出率可達(dá)86.68%，是直接氰化時(shí)金浸出率的2.1倍。X射線能使At.f發(fā)生明顯變異，使誘變菌的氧化活性、對(duì)難處理金礦的預(yù)氧化效果和金浸出率均得到提高。

嗜酸氧化亞鐵硫桿菌，X射線誘變，生物氧化，難處理金礦

CLCQ691.5， TL99

隨著社會(huì)發(fā)展和人們生活水平的提高，金的需求量逐年增加，易處理金礦逐漸減少，合理開發(fā)難處理金礦迫在眉睫［1］。雖然全球金礦儲(chǔ)量豐富，但大部分為難處理金礦，這一情況在中國尤其明顯。2014年對(duì)全國金礦進(jìn)行的系統(tǒng)調(diào)查表明，我國金礦儲(chǔ)量約為8 648.47 t［2］，其中30%為難處理金礦［1］。礦石預(yù)氧化是開發(fā)難處理金礦的核心技術(shù)，細(xì)菌氧化法是利用微生物對(duì)包裹金的硫化物等進(jìn)行生物氧化從而釋放金顆粒，具有工藝簡(jiǎn)單、易操作、投資少、對(duì)環(huán)境友好、能耗少等優(yōu)點(diǎn)［3-6］，在對(duì)低品位、難選冶金礦資源的開發(fā)利用方面有著廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景［7］。

嗜酸氧化亞鐵硫桿菌（Acidithiobacillus ferrooxidans， At.f）是細(xì)菌氧化法中最主要的菌種，屬于化能自養(yǎng)型微生物，可通過氧化二價(jià)鐵離子（Fe2+）和還原性硫化合物（S0）獲得能量，并利用自然環(huán)境的低pH值產(chǎn)生從Fe2+到煙酰胺嘌呤二核苷酸的反向電子流［8-10］。但是由于 At.f野生型菌株生長周期太長，對(duì)環(huán)境中各種離子較為敏感，從而嚴(yán)重制約了生物氧化的實(shí)際工業(yè)化應(yīng)用。因此，尋求有效的誘變技術(shù)，選育性狀優(yōu)良的菌種對(duì)于生物氧化法處理金礦具有重要的意義［11］。目前，較為常見的應(yīng)用于At.f的選育方法有紫外線、γ射線和亞硝基胍處理等［12-16］，而將X射線用于At.f誘變改良的研究尚未見報(bào)道。本研究使用X射線對(duì)嗜酸氧化亞鐵硫桿菌進(jìn)行誘變，通過對(duì)菌種氧化活性、預(yù)氧化效果和浸出率等指標(biāo)的測(cè)定，以期獲得 X射線輻照誘變At.f的最適物理參數(shù)，選育優(yōu)良At.f菌株，為高效生物浸礦菌種的獲得提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1At.f

At.f標(biāo)準(zhǔn)株ATCC19859由蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院惠贈(zèng)。

1.1.2培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：9 K培養(yǎng)基［17］為A、B混合液。

A液：（NH4）2SO43.0 g；MgSO4·7H2O 0.5 g；K2HPO40.5 g；KCl 0.1 g；Ca（NO3）20.01 g；去離子水600 mL，pH=1.8，121 ℃滅菌30 min。B液：FeSO4·7H2O 44.78 g；去離子水400 mL，pH=1.8，用孔徑為0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，滅菌后將A和B混合。

浸礦培養(yǎng)基：0 K培養(yǎng)基，同A液。

1.1.3礦石樣品

礦樣取自隴南陽山金礦，主要成分為硫化礦和黃鐵礦，粒度50目。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌培養(yǎng)方法

按10%接種量將At.f ATCC19859接種于種子培養(yǎng)基中，置150 r/min旋轉(zhuǎn)搖床上30 ℃振蕩培養(yǎng)至液體顏色變?yōu)樽丶t色即生長至對(duì)數(shù)期。

1.2.2無鐵細(xì)胞懸液制備

吸取種子菌液，于8 000 r/min條件下離心20 min，去上清液得到菌體沉淀，加無菌水以調(diào)節(jié)細(xì)菌濃度至108/mL，備用。

1.2.3X射線誘變處理及篩選

將無鐵細(xì)胞懸液置于直徑為 35 mm 的無菌平皿中，在瓦里安Varian Clinac 21EX Platinum 直線加速器（VARIAN，美國）上進(jìn)行輻照處理，輻照能量為6 MV，劑量率為6 Gy/min，靶源距100 cm，吸收劑量分別為 90、180、270、360、450、540、630和720 Gy。其中，對(duì)照組不做任何輻照處理。將經(jīng)過誘變處理的菌液立即置于 4 ℃冰箱中冷藏12 h，按體積分?jǐn)?shù)10%接種量分別接種到種子培養(yǎng)基中，在30 ℃、150 r/min的條件下培養(yǎng)至顏色變?yōu)樽丶t色（第一代傳代時(shí)間長，需要 3～7 d，之后傳代時(shí)間變短，一般在30 h左右），篩選生長周期短、對(duì) Fe2+氧化率高的突變菌株。

1.2.4菌種的礦石馴化

對(duì)各個(gè)劑量輻照后的菌液進(jìn)行礦石馴化，第一次馴化時(shí)加少量FeSO4·7H2O，接入對(duì)數(shù)期菌液，礦石粉末加入量為1%，置于最佳生長條件（30 ℃，pH =1.8，150 r/min）下培養(yǎng)。每隔1 d測(cè)定其pH值，并觀察顏色變化確定細(xì)菌的生長狀況，每次測(cè)完后調(diào)節(jié)pH=1.8。每隔7 d轉(zhuǎn)接一次菌，礦漿濃度按1%的梯度從1%到5%遞增。當(dāng)最后細(xì)菌完全適應(yīng)礦石條件時(shí)開始金礦的生物預(yù)氧化實(shí)驗(yàn)。

1.2.5礦石生物預(yù)氧化

將礦石于200 ℃干燥滅菌2 h，按礦漿濃度5%加入浸礦培養(yǎng)基中，調(diào)整pH 值至1.8。分別接入不同劑量輻照后的菌液，30 ℃、150 r/min 振蕩培養(yǎng)28 d，培養(yǎng)基因蒸發(fā)而損失的水分用無菌水進(jìn)行補(bǔ)充，最后測(cè)定Fe的浸出率。

1.2.6金礦的浸出

將生物預(yù)氧化后的礦石分別用 pH=1.5的蒸餾水和pH=11的蒸餾水洗滌兩次后烘干，加入0.4%的氰化鈉，稱重、記錄。置于30 ℃、150 r/min搖床中氰化48 h，取出補(bǔ)加蒸發(fā)掉的水，靜置4 h，用原子吸收分光光度法測(cè)定金濃度。通過溶液中金含量和礦石中金含量的比值來確定金浸出率。同時(shí)測(cè)定直接氰化時(shí)的金浸出率。

1.2.7分析方法

氧化活性的分析采用亞鐵離子氧化法，菌液中Fe2+的濃度用重鉻酸鉀容量法測(cè)定：

式中：RO-Fe2+表示 Fe2+氧化率；［Fe2+］1為原培養(yǎng)基中Fe2+濃度（g/mol）；［Fe2+］2為培養(yǎng)后培養(yǎng)基中Fe2+濃度（g/mol）；V1為原培養(yǎng)基消耗重鉻酸鉀溶液的體積（mL）；V2為培養(yǎng)后培養(yǎng)基消耗重鉻酸鉀溶液的體積（mL）。

細(xì)菌數(shù)的測(cè)定采用血球記數(shù)器，礦石成分分析采用掃描電子顯微鏡X-射線能量色散譜方法（FEI 6 CHANNEL BSD AMPLIFIER MK3.1）和原子吸收光譜儀方法（瓦里安AA240原子吸收光譜儀），礦石預(yù)氧化程度采用測(cè)量鐵浸出率法，鐵的浸出率采用德國耶拿ZEEnit?700P火焰石墨爐原子吸收光譜儀測(cè)定，金的浸出率采用瓦里安AA240原子吸收光譜儀進(jìn)行分析，pH值的測(cè)定采用 PHS-3C 型精密酸度計(jì)。

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)分析由 SPSS 15 軟件完成，統(tǒng)計(jì)圖采用 Origin8.0軟件繪制。

2　結(jié)果與分析

2.1礦樣成分分析

利用掃描電子顯微鏡 X射線能量色散譜方法（SEM-EDS）和原子吸收光譜法對(duì)礦石的主要成分進(jìn)行分析，結(jié)果表明該礦樣中Au含量為15.67 g/t，其他主要成分有23.87% Fe，2.01% As，3.73% Al 和5.44% Si?？梢娫摰V樣是一種高砷的品位很低的貧礦。陽山金礦［18］是我國最大的卡林型-類卡林型金礦，金以細(xì)微形式包裹在黃鐵礦和硫化物中，使用氰化物直接浸出難度較大。

2.2X射線誘變對(duì)At.f的影響

將原始At.f用X射線誘變處理，吸收劑量分別為90、180、270、360、450、540、630和720 Gy，照射之后便進(jìn)行計(jì)數(shù)，不同劑量的 X射線對(duì)原始At.f的致死率見圖1。從圖1可以看出，隨著吸收劑量的增加，細(xì)菌的致死率增加。當(dāng)吸收劑量在0～360 Gy時(shí)，致死率隨著劑量增加急劇增長，之后增長緩慢。半致死劑量為 270 Gy；當(dāng)吸收劑量為540 Gy時(shí)，致死率達(dá)94%。

把經(jīng) X射線照射的菌液置于4 ℃冰箱避光放置12 h，然后接入9 K培養(yǎng)基置于搖床培養(yǎng)，反復(fù)重新接種 3次后測(cè)其氧化活性和生長曲線，其中OD450用來表征細(xì)菌的生長程度，培養(yǎng)基中 Fe2+的氧化程度表征其氧化活性。具體見圖2和圖3。

細(xì)菌的生長曲線和氧化活性相一致。360 Gy吸收劑量下的細(xì)菌氧化活性最高，提前進(jìn)入對(duì)數(shù)期，且氧化活性比原始菌株高11%。270 Gy吸收劑量下的細(xì)菌氧化活性也高于原始菌株。在致死率50%～80%，細(xì)菌的氧化活性最高。450 Gy吸收劑量下的細(xì)菌從第一次傳代培養(yǎng)到第三次傳代培養(yǎng)時(shí)間均非常長，第三次傳代培養(yǎng)時(shí)，7 d后才進(jìn)入對(duì)數(shù)期。630、720 Gy吸收劑量下對(duì)細(xì)菌而言是非常大的劑量，總活性皆明顯低于原始菌株。

2.3突變菌株對(duì)陽山金礦的預(yù)氧化效果

在進(jìn)行金礦的預(yù)氧化之前，以原始菌株為對(duì)照，分別采用各個(gè)劑量輻照后的 At.f進(jìn)行礦石馴化試驗(yàn)。結(jié)果表明，細(xì)菌可以在有礦石存在的條件下很好地生長，且最佳礦漿濃度為 5%。把經(jīng)過馴化的細(xì)菌接入浸礦培養(yǎng)基中進(jìn)行礦石預(yù)氧化，每隔 7 d取樣并測(cè)定Fe的浸出率，用浸礦培養(yǎng)基補(bǔ)充因取樣而損失的浸出液，結(jié)果如圖4所示?？偣步V時(shí)間28 d，F(xiàn)e的最終浸出率如圖5所示。

由圖4可見，各個(gè)吸收劑量下的細(xì)菌對(duì)礦石的氧化效果在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均高于原始菌株，并且隨著時(shí)間的增長，F(xiàn)e的浸出率也增加，且浸出速率在7～21 d時(shí)間內(nèi)較低，之后大幅增加。吸收劑量為540 Gy的菌液對(duì)Fe的浸出率在各個(gè)時(shí)期均高于其他劑量。180 Gy輻照后的菌液在第7～14 d內(nèi)浸出速率較快，之后下降；450 Gy輻照后的菌液在浸礦開始時(shí)速率較快，第7 d后開始下降，第7～14 d的浸出率基本沒有增加。在0～180 Gy和270～540 Gy范圍內(nèi)，浸出率隨著吸收劑量的增加而增加，劑量超過540 Gy之后，F(xiàn)e的浸出率下降，這與細(xì)菌總氧化活性低相一致。

由圖5可見，所有經(jīng)X射線輻照后的突變體對(duì)Fe的浸出率均高于原始菌株，其中540 Gy吸收劑量下的突變體對(duì) Fe的浸出率最高，比原始菌株高76%；450 Gy吸收劑量下的突變體對(duì)Fe的浸出率達(dá)50.24%，比原始菌株提高 44%；顯著性檢驗(yàn)得p＜0.05，兩者皆與原始菌株對(duì)Fe的浸出率存在顯著性差異。360 Gy吸收劑量下的突變體對(duì)礦石的氧化效果比原始菌株高22.1%，這與前面所述360 Gy吸收劑量下細(xì)菌總氧化活性比原始菌株高相一致。從180～540 Gy吸收劑量下的細(xì)菌對(duì)礦石的預(yù)氧化效果提高均比較明顯，說明存活率在30%～80%的吸收劑量都是可選的。

2.4金礦浸出結(jié)果

以未經(jīng)過生物氧化的礦樣為對(duì)照，用經(jīng)各個(gè)劑量X射線輻照誘變過的At.f氧化后的礦樣進(jìn)行氰化浸金的實(shí)驗(yàn)研究。誘變前后的At.f對(duì)礦樣中金浸出效果的影響見圖6。

由圖6可見，經(jīng)過生物預(yù)氧化礦樣的金浸出率均高于未經(jīng)生物預(yù)氧化的礦樣。各個(gè)吸收劑量下的細(xì)菌對(duì)礦樣預(yù)氧化效果的影響與對(duì)金浸出率的影響大概一致。450 Gy篩選到的突變體，金浸出率最高，達(dá)到86.68%，浸出率是直接氰化時(shí)的2.1倍，顯著性檢驗(yàn)得p＜0.01，表明兩者之間存在明顯差異。當(dāng)吸收劑量為540 Gy時(shí)，金浸出率為57.7%，相對(duì)于直接氰化提高了39.5%，與預(yù)氧化效果高相一致。X射線誘變可引起At.f變異，使其對(duì)金浸出率有明顯提高。

3　討論與總結(jié)

常用于微生物誘變育種的電離輻射有X射線及γ射線，X射線是一種高能電磁輻射［19］，它波長較短，穿透能力較強(qiáng)，照射在生物機(jī)體的分子上時(shí)產(chǎn)生電離作用，通過直接效應(yīng)和間接效應(yīng)［20-21］使機(jī)體發(fā)生不同程度的生理、病理和生化等方面的改變，例如引起細(xì)胞膜損傷和DNA 損傷等，其中未修復(fù)的DNA損傷往往引起突變。大量研究涉及到利用物理輻射對(duì)微生物進(jìn)行選育，如徐曉軍等［22］用紫外線輻照誘變氧化亞鐵硫桿菌，結(jié)果表明，紫外線輻照能夠使浸礦細(xì)菌氧化亞鐵硫桿菌產(chǎn)生明顯的變異，提高氧化亞鐵硫桿菌菌種的活性，誘變氧化亞鐵硫桿菌對(duì)黃銅礦的浸出率比原始氧化亞鐵硫桿菌提高46%以上。本研究使用X射線誘變At.f取得的結(jié)果表明，所有經(jīng)過輻照誘變的菌株對(duì)礦樣中 Fe的浸出率都高于原始菌株。其中360 Gy吸收劑量下的突變體比原始菌株對(duì)Fe的浸出率提高了25%；450 Gy吸收劑量下的突變體對(duì)Fe的浸出率提高了44%；540 Gy吸收劑量下的突變體對(duì)礦樣中Fe的浸出率比原始菌株提高76%。結(jié)果表明，X射線輻照能夠使At.f發(fā)生有利突變，是一種良好的菌種選育方法。當(dāng)菌種的致死率在30%～80%之間時(shí)，細(xì)菌對(duì)礦石的預(yù)氧化效果均明顯高于原始菌株，這為今后優(yōu)良菌種選育提供了重要的吸收劑量范圍。

此外，細(xì)菌預(yù)氧化對(duì)礦樣中金的浸出效果優(yōu)于直接氰化浸出，且輻照處理對(duì)礦樣的金浸出率也具有一定程度的影響，所有經(jīng)過X射線輻照的At.f都提高了難處理金礦的金浸出率，其中最值得一提的是當(dāng)吸收劑量為450 Gy時(shí)，金浸出率的提高非常顯著，達(dá)到86.68%，是直接氰化時(shí)金浸出率的2.1倍?？梢娂?xì)菌氧化法可有效地提高難處理金礦的金浸出率，在直接氰化之前進(jìn)行礦石預(yù)氧化非常有必要，而且菌種性能直接影響金浸出率。說明X射線是一種有效的高效浸礦菌種選育方法。

本研究還表明生物氧化法適合陽山金礦一類的卡林型金礦等低品位難處理金礦的浸出。

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Study on breeding Acidithiobacillus ferrooxidans induced by X-ray irradiation and bioleaching of refractory gold ore

YAN Qian1，2ZHANG Miaomiao1GUO Xiaopeng1，2LI Wenjian1LU Dong1
1（Institute of Modern Physics， Chinese Academy of Sciences， Lanzhou 730000， China）
2（University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China）

To study the influence of Acidithiobacillus ferrooxidans （At.f） mutated by X-ray on the biooxidation and bioleaching of refractory gold ores， X-ray was used to irradiate At.f strains at different doses， and more efficient strains were screened by microbiology methods and the measurement of relevant indicators. Compared with the original strain， the bioleaching ratio of iron by the mutants after irradiation at 450 Gy was 50.24%， namely 44% increased， and the bioleaching ratio of gold reached 86.68%-two folds than gold direct cyanidation leaching. It is proved that X-ray irradiation is an outstanding way to breed mutants of high bioleaching ratio of iron and gold strains of At.f.

Acidithiobacillus ferrooxidans， X-ray irradiation， Biooxidation， Refractory gold ores

YAN Qian （female） was born in December 1992 and graduated from Northwest Normal University in June 2014. Now she is a master candidate in Institute of Modern Physics， Chinese Academy of Sciences， majoring in biophysics and focusing on basic study on microbial mutation breeding. E-mail： qiany@impcas.ac.cn

Ph.D. LI Wenjian， professor， E-mail： wjli@impcas.ac.cn

9 May 2016， accepted 22 June 2016

Q691.5，TL99

10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.050401

中國科學(xué)院西部之光人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（Y306010XB0）資助

剡倩，女，1992年12月出生，2014年6月畢業(yè)于西北師范大學(xué)，現(xiàn)為中國科學(xué)院近代物理研究所碩士研究生，生物物理學(xué)專業(yè)，主要從事微生物誘變育種基礎(chǔ)研究，E-mail： qiany@impcas.ac.cn

李文建，博士，研究員，E-mail： wjli@impcas.ac.cn

初稿2016-05-09；修回2016-06-22

Supported by Western Talent Training Program of the Chinese Academy of Sciences， China（No. Y306010XB0）