王金霞，林江麗，鹿 毅，王吉德（.新疆大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，石油天然氣精細(xì)化工教育部和新疆維吾爾自治區(qū)共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn) 室，新疆 烏魯木齊 830046；2.新疆產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，新疆 烏魯木齊 830004）

熒光衍生化法測(cè)定新疆特色葡萄干中總亞硫酸鹽含量

王金霞1,2，林江麗1，鹿 毅2,*，王吉德1
（1.新疆大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，石油天然氣精細(xì)化工教育部和新疆維吾爾自治區(qū)共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn) 室，新疆 烏魯木齊 830046；2.新疆產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，新疆 烏魯木齊 830004）

建立熒光衍生化法快速、準(zhǔn)確測(cè)定新疆特色葡萄干中總亞硫酸鹽的分析方法。用N-（9-吖啶基）馬來(lái)酰亞胺為 衍生化試劑，使其與葡萄干中的亞硫酸鹽發(fā)生衍生化反應(yīng)產(chǎn)生具有強(qiáng)熒光的衍生化產(chǎn)物，采用熒光光譜儀對(duì)其進(jìn)行分析檢測(cè)。結(jié)果表明，在1.0～43.2 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999 3，方法的檢出限為0.50 mg/L，3 個(gè)添加水平時(shí)，平均回收率為92.2%～100.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）不大于3.80%。利用該法對(duì)葡萄干中總亞硫酸鹽的測(cè)定結(jié)果與國(guó)標(biāo)法測(cè)得結(jié)果一致，說(shuō)明該方法可快速準(zhǔn)確地對(duì)新疆特色葡萄干中總亞硫酸鹽進(jìn)行測(cè)定，為干果中亞硫酸鹽殘留量的測(cè)定提供參考。

葡萄干；總亞硫酸鹽；熒光衍生化法

食品中添加亞硫酸鹽起漂白、抗氧化、防腐保鮮及防止褐變的作用[1]。葡萄干干制過(guò)程中常添加亞硫酸及其鹽類來(lái)抑制褐變，防止果粒霉變，保持葡萄干色澤亮黃[2]。但過(guò)量添加的亞硫酸鹽會(huì)對(duì)呼吸道及人體其他器官產(chǎn)生危害[3-4]。因此，世界各國(guó)對(duì)食品中亞硫酸鹽最大限量做了規(guī)定[5]。美國(guó)食品和藥物管理局要求對(duì)亞硫酸鹽使用量高于10 mg/kg的食品予以標(biāo)明；歐美國(guó)家的食品中的SO2殘留標(biāo)準(zhǔn)小于10 mg/kg。我國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1041—2010《綠色食品干果》規(guī)定：葡萄干等干果中SO2的殘留量不大于50 mg/kg[6-7]。

食品中亞硫酸鹽常用的測(cè)定方法是Monier-Williams法[8]、碘量法[9]、鹽酸副玫瑰苯胺法[10]。Monier-Williams法在蒸餾中易發(fā)生焦糖化反應(yīng)[11]；碘量法靈敏度不高[12]；鹽酸副玫瑰苯胺法（即國(guó)標(biāo)法）是常采用的方法，但吸收液毒性大，且色素對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生干擾[13]。隨著分析科學(xué)新方法和新技術(shù)的發(fā)展，化學(xué)發(fā)光[14]、電化學(xué)[15]、酶[16]、流動(dòng)注射[17]、離子色譜[18]、毛細(xì)管電泳[19]等方法逐漸應(yīng)用到亞硫酸鹽的分析檢測(cè)中，這些新方法雖然檢測(cè)靈敏度高，但樣品的前處理復(fù)雜，操作繁瑣，均無(wú)法快速、準(zhǔn)確地對(duì)基質(zhì)復(fù)雜樣品中總亞硫酸鹽含量進(jìn)行分析檢測(cè)。因此，建立一種樣品基質(zhì)相對(duì)復(fù)雜葡萄干中總亞硫酸鹽含量快速準(zhǔn)確的分析方法，在食品安全備受關(guān)注的當(dāng)今社會(huì)具有重要的意義。

熒光法因具有靈敏度和選擇性高、線性范圍寬、準(zhǔn)確快速和不易受到樣品中陰陽(yáng)離子和色素的干擾等優(yōu)點(diǎn)，常應(yīng)用于樣品中熒光化合物的分析檢測(cè)[20-21]。本實(shí)驗(yàn)利用N-（9-吖啶基）馬來(lái)酰亞胺為熒光衍生化試劑，使其與葡萄干中的亞硫酸鹽發(fā)生衍生化反應(yīng)產(chǎn)生具有強(qiáng)熒光的衍生化產(chǎn)物，采用熒光法對(duì)葡萄干中的亞硫酸鹽含量進(jìn)行分析檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

葡萄干、鮮葡萄、葡萄酒、榨菜、蝦皮等 市購(gòu)。

N-（9-吖啶基）馬來(lái)酰亞胺（色譜純）；乙二胺四乙酸二鈉、硼酸、無(wú)水碳酸鈉、氯化鉀、亞硫酸氫鈉均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?；所有?shí)驗(yàn)用水均為電阻率18.2 MΩ/cm的超純水。

RF-5301熒光分光光度計(jì)、UV-2550紫外分光光度計(jì)日本島津公司；Coulter Avanti J-25高速離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司；DF-101S集熱式磁力加熱攪拌器 金壇市醫(yī)療儀器廠；KQ5200E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；FW-80高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；XS105DU分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；PHB-8型筆式pH計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

N-（9-吖啶基）馬來(lái)酰亞胺溶液：準(zhǔn)確稱取1 mg N-（9-吖啶基）馬來(lái)酰亞胺溶解于4.0 mL丙酮，待用。

緩沖溶液：A溶液：稱取6.18 g硼酸、7.46 g氯化鉀和7.4 g乙二胺四乙酸二鈉，用水溶解定容至1 L容量瓶中；B溶液：稱取10.6 g碳酸鈉和7.4 g乙二胺四乙酸二鈉，用水溶解定容至1 L容量瓶中。兩溶液按照不同體積比混合，配成pH值范圍5.0～10.0的緩沖溶液。

1.2.2 樣品前處理

將冷凍的葡萄干樣品加入液氮低溫粉碎，準(zhǔn)確稱取粉碎后的葡萄干樣品10.0 g左右，加入0.1 mol/L氫氧化鈉溶液20.0 mL，混勻，超聲提取15 min，10 000 r/min離心10 min，取上層清液定容至25 mL容量瓶中，于4 ℃冰箱保存。

1.2.3 衍生化反應(yīng)及測(cè)定

準(zhǔn)確移取樣品溶液50.0、150.0 ?L N-（9-吖啶基）馬來(lái)酰亞胺溶液和3.0 mL緩沖溶液置于反應(yīng)瓶中，混勻，放置10 min，于50 ℃水浴中反應(yīng)20 min后，立即放入冰水中冷卻至室溫，使衍生化反應(yīng)停止。在激發(fā)波長(zhǎng)360 nm、發(fā)射波長(zhǎng)442 nm、狹縫寬度5 nm條件下，在380～600 nm波長(zhǎng)處對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行熒光光譜掃描。

1.2.4 鹽酸副玫瑰苯胺法測(cè)定總亞硫酸鹽

參照GB/T 5009.34—2003《食品中亞硫酸的測(cè)定》方法，對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取0.5 g亞硫酸氫鈉，1.85 g乙二胺四乙酸二鈉，用水定容至250 mL容量瓶，使用前用碘量法標(biāo)定，于4 ℃冰箱保存至多3 d，使用時(shí)用0.1 mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液稀釋至所需質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生化反應(yīng)條件優(yōu)化

圖1 緩沖液pH值（a）、物質(zhì)的量比（b）和反應(yīng)溫度（c）對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響Fig.1 Effect of buffer pH (a), molar ratio (b) and reaction temperature (c) on the fluorescence intensity

圖2 反應(yīng)時(shí)間（a）、緩沖液體積（b）和靜置時(shí)間（c）對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of reaction time (a), buffer solution volume (b) and standing time (c) on the fluorescence intensity

為使亞硫酸鹽與衍生化試劑充分反應(yīng)，對(duì)影響衍生化反應(yīng)的緩沖液pH值、N-（9-吖啶基）馬來(lái)酰亞胺與亞硫酸物質(zhì)的量比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、緩沖液體積和靜置時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化。如圖1、2所示，pH 9.0（圖1a）、N-（9-吖啶基）馬來(lái)酰亞胺亞硫酸鹽物質(zhì)量比15∶1（圖1b）、反應(yīng)溫度50 ℃（圖1c）、 緩沖鹽體積3.0 mL（圖2b，小于3 mL無(wú)法進(jìn)行熒光檢測(cè)）、反應(yīng)時(shí)間20 min（圖2a）為最佳衍生化反應(yīng)條件，從圖2c可以看出，衍生化反應(yīng)結(jié)束應(yīng)立即進(jìn)行熒光強(qiáng)度測(cè)試。

2.2 樣品中亞硫酸鹽超聲提取條件的優(yōu)化

圖3 提取時(shí)間（a）和提取溫度（b）對(duì)樣品中亞硫酸鹽提取的影響Fig.3 Effect of extraction time (a) and temperature (b) on the extraction of sulfite from raisin

為使樣品中亞硫酸鹽充分浸提，對(duì)樣品中亞硫酸鹽的提取時(shí)間和提取溫度等提取條件進(jìn)行了優(yōu)化。如圖3所示，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)（圖3a），亞硫酸鹽提取量增大，熒光強(qiáng)度逐漸增大。提取時(shí)間15 min時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值，說(shuō)明樣品中的亞硫酸鹽被充分浸提。提取時(shí)間超過(guò)15 min后，熒光強(qiáng)度逐漸降低。故選擇提取時(shí)間15 min為樣品提取最佳時(shí)間。另外，從圖3b可以看出，提取溫度對(duì)樣品中亞硫酸鹽提取的影響較小。故選擇室溫作為對(duì)樣品中亞硫酸鹽提取的適宜溫度。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及檢出限

用亞硫酸鹽氫鈉儲(chǔ)備液配制一系列不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.3節(jié)衍生化反應(yīng)方法測(cè)定反應(yīng)混合液的熒光強(qiáng)度。以亞硫酸氫鈉質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到亞硫酸氫鈉的線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)，以3 倍空白標(biāo)準(zhǔn)偏差除以校準(zhǔn)曲線的斜率得到亞硫酸鹽的檢出限。由表2可知，亞硫酸氫鈉與熒光強(qiáng)度在質(zhì)量濃度1.0～43.2 mg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）不大于3.33%。

表2 兩種方法線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限、RRSSDD（n==33）TTaabbllee 22 RReeggrreessssiioonn eeqquuaattiioonnss aanndd ccoorrrreellaattiioonn ccooeeffffiicciieennttss,, lliinneeaarr ranges, LODs, and RSDs of the pararosaniline method and fluorescence derivatizatiioonn ((n == 33))

2.4 加標(biāo)回收率

取葡萄干樣品9 份，分別按低、中、高3 個(gè)水平（0.60、1.2、2.0 mg）添加亞硫酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液。按1.2.2節(jié)樣品處理方法與1.2.3節(jié)衍生化反應(yīng)方法操作，測(cè)定反應(yīng)混合液的熒光強(qiáng)度，結(jié)果見表3，加標(biāo)回收率范圍為92.2 %～100.2%，RSD不大于3.80%，說(shuō)明本方法滿足定量分析實(shí)驗(yàn)要求。

表3 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（ =3）Table 3 Recoveries of the fluorescence derivatization method for spiked sampples ( = 3)

2.5 實(shí)際樣品分析

采用熒光衍生化法對(duì)兩種無(wú)核葡萄干、葡萄、葡萄酒、蝦皮、榨菜中總亞硫酸鹽含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見表4，兩種無(wú)核葡萄干中總亞硫酸鹽含量分別為1.31 mg/kg和3.11 mg/kg。鮮食葡萄、葡萄酒、蝦皮、榨菜中的總亞硫酸鹽含量分別為2.37、67.08、12.95、0.77 mg/kg。

表4 實(shí)際樣品中總亞硫酸鹽含量的測(cè)定（ =4）Table 4 Contents of total sulfite in real samples determined by the pararosaniline method and fluorescence derivatization ( = 4)

2.6 兩種方法的比較

為了驗(yàn)證熒光衍生化法的準(zhǔn)確性，采用熒光衍生化法和鹽酸副玫瑰苯胺法對(duì)兩種無(wú)核葡萄干、葡萄、葡萄酒、蝦皮及榨菜6 個(gè)樣品中總亞硫酸鹽含量進(jìn)行測(cè)定。從表2可以看出，熒光衍生化法的線性范圍比鹽酸副玫瑰苯胺法高一個(gè)數(shù)量級(jí)，且熒光衍生化法樣品前處理所需時(shí)間不到鹽酸副玫瑰苯胺法的一半。從表4也可以看出，兩種方法的RSD不大于3.32%，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)建立的方法準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié) 論

建立一種熒光衍生化法測(cè)定新疆特色葡萄干中總亞硫酸鹽的分析方法。利用N-（9-吖啶基）馬來(lái)酰亞胺與葡萄干樣品中的亞硫酸鹽反應(yīng)生成具有強(qiáng)熒光的衍生化產(chǎn)物，采用熒光光譜儀對(duì)新疆特色葡萄干中總亞硫酸鹽含量進(jìn)行檢測(cè)，線性范圍、相關(guān)系數(shù)及RSD均較好。與鹽酸副玫瑰苯胺法相比較，線性范圍寬、檢出限低、樣品前處理所需時(shí)間較短，同時(shí)避免了有毒試劑的使用。而且熒光法檢測(cè)所需試樣量少，不易受色素的干擾，有利于大批樣品的分析檢測(cè)。利用該法對(duì)葡萄干、鮮食葡萄等5 種樣品中總亞硫酸鹽含量進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果與國(guó)標(biāo)法測(cè)定結(jié)果一致。說(shuō)明該法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，對(duì)樣品基質(zhì)較為復(fù)雜的干果中總亞硫酸鹽的分析檢測(cè)具有一定的參考價(jià)值。

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Determination of Total Sulfite in Xinjiang Specialty Raisin by Fluorescence Derivatization

WANG Jinxia1,2, LIN Jiangli1, LU Yi2,*, WANG Jide1
(1. Key Laboratory of Oil and Gas Fine Chemicals Ministry of Education and Xinjiang Uyghur Autonomous Region, College of Chemistry and Chemical Engineering, Xinjiang University, ürümqi 830046, China; 2. Xinjiang Supervision and Inspection Institute for Product Quality, ürümqi 830004, China)

A rapid and accurate method for the determination of total sulfite in Xinjiang specialty raisin was developed using fluorescence derivatization. N-(9-Acridinyl) maleimide (NAM) reacted with the sulfite in raisin to form strong fluorescent derivatives, which were then detected by fluorometry. The linear range of the method was between 1.0 and 43.2 mg/L, with a correlation coefficient (R2) of 0.999 3. At three spiked levels, the average recoveries of sulfite in raisin ranged from 92.2% to 100.2% with relative standard deviations lower than 3.80% (n = 3). Furthermore, the results obtained by this method for the total sulfite content of raisin were consistent with those obtained by the pararosaniline method. These results indicate that the fluorescence derivatization method can accurately and rapidly determine total sulfite in Xinjiang specialty raisin.

raisin; total sulfite; fluorescence derivatization

10.7506/spkx1002-6630-201604038

O657.3

A

1002-6630（2016）04-0212-04

王金霞, 林江麗, 鹿毅, 等. 熒光衍生化法測(cè)定新疆特色葡萄干中總亞硫酸鹽含量[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(4): 212-215.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604038. http://www.spkx.net.cn

WANG Jinxia, LIN Jiangli, LU Yi, et al. Determination of total sulfite in Xinjiang specialty raisin by fluorescence derivatization[J]. Food Science, 2016, 37(4): 212-215. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604038. http://www.spkx.net.cn

2015-03-24

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2013211A015）

王金霞（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物分析。E-mail：372467867@qq.com

*通信作者：鹿毅（1966—），男，教授級(jí)高級(jí)工程師，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品成分分析及質(zhì)量監(jiān)控。E-mail：wangjinxia6868@163.com