趙彥巧，朱志勇，李建穎，張麗君（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化中性蛋白酶輔助提取青稞淀粉工藝

趙彥巧，朱志勇，李建穎，張麗君
（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

采用中性蛋白酶輔助提取青稞淀粉，研究料液比、加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度和pH值對青稞淀粉中蛋白殘留量的影響，選擇加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度為影響因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。以淀粉蛋白殘留量和淀粉提取率為評價(jià)指標(biāo)，確定最佳提取工藝條件。結(jié)果表明，加酶量、酶解溫度、酶解時(shí)間、加酶量與酶解溫度的交互作用及加酶量與酶解時(shí)間的交互作用對淀粉蛋白殘留量有極顯著影響，而對淀粉提取率無顯著影響。實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)得到的最佳提取工藝條件為加酶量140.79 U/g、酶解溫度45.01 ℃、酶解時(shí)間2.57 h，在此條件下青稞淀粉的提取率為60.36%，淀粉蛋白殘留量為1.31%。

青稞淀粉；中性蛋白酶；蛋白殘留；響應(yīng)面

青稞是一種生長在我國西北、西南特別是西藏、青海一帶的極其重要的糧食作物，對青稞的研究主要集中在青稞葡聚糖[1-2]。青稞的淀粉平均含量為59.25%，遠(yuǎn)高于其他谷類作物[3]。青稞淀粉理化性質(zhì)非常獨(dú)特，有良好的工業(yè)應(yīng)用潛力。對于淀粉的提取與分離，文獻(xiàn)報(bào)道的方法有堿法[4-6]和酶法[7-10]，堿法提取的淀粉一般糊化溫度較低，凝膠硬度較大，易于回生，溶解度和膨潤力較大，對淀粉顆粒有一定程度的破壞[11]；酶法提取的淀粉中一般蛋白質(zhì)殘留量較大，結(jié)構(gòu)緊密，糊化溫度和糊化黏度較高[12]。在酶法提取淀粉的過程中，采用堿性蛋白酶分離淀粉的報(bào)道居多，但是，堿性蛋白酶分離淀粉的過程中水解時(shí)間長（18～24 h），而且作用的pH值在堿性范圍內(nèi)，會(huì)產(chǎn)生黃淀粉，并存在污水處理的問題[13]。也有關(guān)于中性蛋白酶進(jìn)行淀粉提取的報(bào)道[14-15]，多用于玉米淀粉和小麥淀粉的提取，采用中性蛋白酶進(jìn)行青稞淀粉提取鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用中性蛋白酶輔助提取青稞淀粉，通過單因素試驗(yàn)研究料液比、加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度、pH值等因素對淀粉蛋白殘留量的影響，選擇主要因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，探究中性蛋白酶輔助青稞粉提取淀粉的最佳工藝條件，為建立理想的青稞淀粉提取工藝路線及青稞的深加工和綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青稞粉來自云南香格里拉縣。

中性蛋白酶（酶活力≥10 000 U/g） 天津市諾奧科技發(fā)展有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 天津市化學(xué)試劑一廠；無水碳酸鈉 天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；三氯乙酸 上海伊卡生物技術(shù)有限公司；干酪素 杭州微生物試劑有限公司、L-酪氨酸、福林試劑 上海金穗生物科技有限公司；氫氧化鈉 天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；牛血清蛋白 上海伯奧生物科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250 上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；95%乙醇 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；85%磷酸天津大學(xué)科威公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AUY-220電子分析天平 日本Shimadzu公司；WE-3水浴恒溫振蕩器、XMTD-204型數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋 天津市歐諾儀器儀表有限公司；DGG-H-3型電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市天宇實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SK5210LHC超聲波清洗器 上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；PHS-3B型精密pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；UV-7504型紫外-可見分光光度計(jì) 上海欣茂儀器有限公司；DL-6000型低速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；3-18K低溫高速離心機(jī) 德國Sigma公司；高速萬能粉碎機(jī) 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 淀粉提取工藝條件

酶解輔助淀粉提取工藝流程參考文獻(xiàn)[16-19]的淀粉提取工藝并加以改進(jìn)，提取工藝如下：青稞粉過100 目篩，稱質(zhì)量，按一定料液比加水浸泡制漿，加入中性蛋白酶，恒溫振蕩水浴酶解一定時(shí)間（加入三氯乙酸終止酶解）；將酶解液在5 000 r/min進(jìn)行第1次離心，離心10 min，倒出上清液，刮去上層（暗黃色層），取下層（白色層）；將第1次離心得到的下層（白色層）加水制漿，過200 目篩后，淀粉漿在5 000 r/min進(jìn)行第2次離心，離心10 min，倒出上清液，小心刮去上層（灰色層），收集下層產(chǎn)品；自然條件干燥24 h，得青稞淀粉。

1.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[20-21]，選取加酶量、酶解時(shí)間及酶解溫度3 個(gè)因素，采用三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，響應(yīng)面試驗(yàn)的因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface design

1.3.3 指標(biāo)測定

1.3.3.1 淀粉含量的測定

依據(jù)GB/T 5009.9—2008《食品中淀粉的測定》第一法酶水解法測定淀粉含量。

1.3.3.2 中性蛋白酶比活力的測定

依據(jù)GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》附錄B蛋白酶活力的測定-福林法測定中性蛋白酶的比活力。

1.3.3.3 淀粉中蛋白質(zhì)含量的測定

采用考馬斯亮藍(lán)法測定淀粉中蛋白質(zhì)的含量[22]。

1.3.3.4 淀粉提取率的計(jì)算

1.3.3.5 淀粉中蛋白殘留量的計(jì)算

2 結(jié)果與分析

2.1 青稞原料中淀粉含量

經(jīng)測定，本實(shí)驗(yàn)所選用的青稞原料的平均淀粉含量為56.77%，與文獻(xiàn)[1]報(bào)道的淀粉平均含量59.25%相當(dāng)。

2.2 中性蛋白酶的比活力

經(jīng)測定，本實(shí)驗(yàn)所選用中性蛋白酶的比活力為8 000 U/g，與中性蛋白酶生產(chǎn)廠家所標(biāo)示的比活力基本一致，酶活力較高且穩(wěn)定。

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 料液比對蛋白殘留量的影響

圖1 料液比對淀粉蛋白殘留量的影響Fig.1 Effect of solid/liquid ratio on the residual protein content of starch

在中性蛋白酶添加量100 U/g、提取溫度45 ℃、提取時(shí)間1.5 h的條件下，分別按照料液比為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7（g/mL）進(jìn)行青稞淀粉的提取，探討料液比對其蛋白殘留量的影響，由圖1可以看出，當(dāng)溶劑用量過小時(shí)，淀粉蛋白殘留量較高，原因可能是溶劑用量過小時(shí)，酶促反應(yīng)體系過小，不利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行；隨溶劑用量的增加，酶與底物充分接觸，酶解完全，淀粉蛋白殘留量逐漸降低，使淀粉粒子最大限度游離出來[23-24]。在料液比1∶4之后，蛋白殘留量下降速率變緩，考慮到廢液處理和環(huán)境保護(hù)的問題，故在響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)中不再考慮料液比對蛋白殘留量的影響，選擇料液比1∶4進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3.2 加酶量對蛋白殘留量的影響

圖2 加酶量對淀粉蛋白殘留量的影響Fig.2 Effect of enzyme dosage on the residual protein content of starch

在料液比1∶4（g/mL）、提取溫度45 ℃、提取時(shí)間1.5 h的條件下，分別按照加酶量為80、100、120、140、160 U/g進(jìn)行青稞淀粉的提取，探討加酶量對其蛋白殘留量的影響，由圖2可以看出，加酶量對淀粉蛋白殘留量的影響較為顯著，隨著加酶量的增加，淀粉蛋白殘留量下降速率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當(dāng)加酶量較少時(shí)，酶質(zhì)量濃度大大低于飽和質(zhì)量濃度，由酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)可知，加酶量成為酶促反應(yīng)的主要限制因素，此時(shí)酶質(zhì)量濃度與反應(yīng)速率呈正比關(guān)系[25]，因此蛋白殘留量也隨著酶質(zhì)量濃度的增加而降低。當(dāng)加酶量為120 U/g時(shí)，酶質(zhì)量濃度達(dá)到飽和，所以蛋白殘留量降低速率減緩，考慮到實(shí)際生產(chǎn)的成本問題，加酶量不宜過高，且當(dāng)考察加酶量與其他因素的交互作用時(shí)，較低水平的加酶量也可能產(chǎn)生良好的催化效果，故選取120、140、160 U/g 3 個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.3.3 酶解時(shí)間對蛋白殘留量的影響

圖3 酶解時(shí)間對淀粉蛋白殘留量的影響Fig.3 Effect of hydrolysis time on the residual protein content of starch

在料液比1∶4（g/mL）、中性蛋白酶添加量100 U/g、酶解溫度45 ℃的條件下，分別酶解1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h，探討酶解時(shí)間對其蛋白殘留量的影響，由圖3可以看出，酶解時(shí)間對淀粉蛋白殘留量的影響較為顯著，隨酶解時(shí)間的延長，淀粉蛋白殘留量降低速率呈現(xiàn)先增大后減小的總趨勢。在酶促反應(yīng)初期，酶活性及反應(yīng)速率都比較高，隨酶解時(shí)間的延長，酶促反應(yīng)不斷進(jìn)行，所以淀粉蛋白殘留量不斷減少。但當(dāng)酶解時(shí)間超過3 h后，酶促反應(yīng)基本進(jìn)行完全，與文獻(xiàn)[26]報(bào)道的中性蛋白酶酶解時(shí)間基本相同。考慮到時(shí)間成本，選取2.0、2.5、3.0 h 3 個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，探究酶解時(shí)間及其與其他因素的交互作用對淀粉蛋白殘留量的影響。

2.3.4 酶解溫度對蛋白殘留量的影響

圖4 酶解溫度對淀粉蛋白殘留量的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperatures on the residual protein content of starch

在料液比1∶4（g/mL）、中性蛋白酶添加量100 U/g、酶解時(shí)間1.5 h的條件下，控制酶解溫度分別為35、40、45、50、55 ℃，探討酶解溫度對蛋白殘留量的影響，由圖4可以看出，酶解溫度對淀粉蛋白殘留量的影響較為顯著，隨酶解溫度的升高，蛋白殘留量先減小后增大，最小值出現(xiàn)在酶解溫度為50 ℃時(shí)。溫度是影響酶活性的最重要因素之一[27-28]。蛋白酶具有特定的空間結(jié)構(gòu)，溫度較低時(shí)，不能使結(jié)構(gòu)充分的舒展，活性也不能充分發(fā)揮，升溫有利于加快反應(yīng)速率，而當(dāng)溫度過高時(shí)，蛋白質(zhì)變性而導(dǎo)致蛋白酶結(jié)構(gòu)破壞，從而喪失或部分喪失活性；此外，較高的溫度也可能使產(chǎn)生的淀粉糊化，黏度增大，影響蛋白酶的作用效果?？紤]到經(jīng)濟(jì)成本，選取40、45、50 ℃ 3 個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.3.5 pH值對蛋白殘留量的影響

圖5 pH值對淀粉蛋白殘留量的影響Fig.5 Effect of pH on the residual protein content of starch

在料液比1∶4（g/mL）、中性蛋白酶添加量100 U/g、酶解溫度45 ℃、酶解時(shí)間1.5 h的條件下，分別調(diào)節(jié)pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，探討pH值對淀粉蛋白殘留量的影響，由圖5可以看出，pH值升高，淀粉蛋白殘留量先減小后增大，在pH值為7時(shí)，淀粉蛋白殘留量最小，與文獻(xiàn)[29]報(bào)道的中性蛋白酶的最適pH值相當(dāng)?？紤]到調(diào)節(jié)pH值之后，還需要進(jìn)行中和，后續(xù)過程中會(huì)涉及廢水處理和脫鹽處理，工序復(fù)雜，而且不利于環(huán)境保護(hù)，故選擇不調(diào)節(jié)pH值，此時(shí)pH值為6.8。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝結(jié)果

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

以蛋白殘留量（R1）和淀粉提取率（R2）為考察指標(biāo)，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

經(jīng)回歸擬合后，各試驗(yàn)因素對響應(yīng)值蛋白殘留量的影響可用如下函數(shù)表示：

R1=111.908 75－0.729 21A－9.166 67B－2.011 00C＋0.022 750AB＋2.025 00×10－3AC－9.000 00×10－3BC＋2.030 21×10－3A2＋1.148 33B2＋0.018 883C2

運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件對15 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見表3。

表3 蛋白殘留量回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

由表3可知，此模型的F值81.37，P＜0.000 1，回歸模型高度顯著。模型的一次項(xiàng)A、B、C極顯著，二次項(xiàng)A2、B2、C2極顯著，交互項(xiàng)AB、AC極顯著?；貧w模型的決定系數(shù)R2=0.993 2，調(diào)整后的回歸模型決定系數(shù)=0.981 0，說明模型擬合程度好。失擬項(xiàng)P=0.050 8，不顯著，說明本試驗(yàn)無其他顯著因素的影響，試驗(yàn)條件合適。各因素對淀粉蛋白殘留量的影響次序是：B（酶解時(shí)間）＞A（加酶量）＞C（酶解溫度）＞AB＞AC＞BC，其中加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度、加酶量與酶解時(shí)間的交互作用及加酶量與酶解溫度的交互作用對蛋白殘留量有極顯著影響。

經(jīng)回歸擬合后發(fā)現(xiàn)，各試驗(yàn)因素對淀粉提取率的影響并不顯著，故在此不再討論。

2.4.2 因素間交互作用的響應(yīng)面

為了進(jìn)一步研究相關(guān)因素之間的交互作用，通過Design-Expert繪制響應(yīng)面圖進(jìn)行直觀分析，對蛋白殘留量有交互影響的響應(yīng)面分析立體曲面見圖6。

圖6 各因素交互作用對淀粉蛋白殘留量的影響Fig.6 Effect of interaction between various factors on the residual protein content of starch

由圖6a可以看出，加酶量與酶解時(shí)間之間存在明顯的交互作用，表現(xiàn)為等高線呈橢圓形。中性蛋白酶的添加量在130～150 U/g之間時(shí)，隨著酶解時(shí)間的延長，淀粉蛋白殘留量減少。當(dāng)中性蛋白酶的添加量大于150 U/g時(shí)，淀粉的蛋白殘留量又隨著酶解時(shí)間的延長而升高。由圖6b可以看出，加酶量與酶解溫度之間存在明顯的交互作用，表現(xiàn)為等高線呈橢圓形。中性蛋白酶的添加量在130～150 U/g之間時(shí)，隨著酶解溫度的升高，淀粉蛋白殘留量減少。當(dāng)中性蛋白酶的添加量大于150 U/g時(shí)，淀粉的蛋白殘留量又隨著酶解溫度的升高而增大。由圖6c可以看出，酶解時(shí)間和酶解溫度之間無明顯交互作用。

按照響應(yīng)面最佳條件，即加酶量140.79 U/g，在45.01 ℃條件下酶解2.57 h，對中性蛋白酶輔助青稞淀粉的提取進(jìn)行3 次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在上述最佳條件下淀粉的平均提取率為60.36%，淀粉蛋白殘留量平均值為1.31%，而預(yù)測的最小值為1.27%，兩者吻合較好。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用中性蛋白酶輔助從青稞粉中提取淀粉，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度3 個(gè)主要影響因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，探究中性蛋白酶輔助青稞粉提取淀粉的最佳工藝條件，降低淀粉蛋白殘留量，得出如下主要結(jié)論：料液比對淀粉蛋白殘留量的影響并不顯著，但過低的溶劑用量會(huì)使蛋白殘留量升高，考慮到廢水處理及節(jié)水節(jié)能，較為理想的料液比為1∶4；各因素對淀粉提取率的影響并不顯著；各因素對淀粉蛋白殘留量的影響次序是：B（酶解時(shí)間）＞A（加酶量）＞C（酶解溫度）＞AB＞AC＞BC，其中加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度、加酶量與酶解時(shí)間的交互作用及加酶量與酶解溫度的交互作用對蛋白殘留量有極顯著影響。

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果，得到最佳提取工藝條件：中性蛋白酶量140.79 U/g，在45.01 ℃條件下酶解2.57 h。此時(shí)青稞淀粉的提取率為60.36%，淀粉蛋白殘留量為1.31%。

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Optimization of Neutral Protease-Assisted Extraction of Highland Barley Starch

ZHAO Yanqiao, ZHU Zhiyong, LI Jianying, ZHANG Lijun
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

The neutral protease-assisted extraction of highland barley starch was optimized using response surface methodology. The effects of several operating parameters, namely solid to liquid ratio, enzyme dosage, hydrolysis time, temperature and pH, on the residual protein content of highland barley starch were studied. Three main factors including enzyme dosage, hydrolysis time and temperature were chosen to design response surface experiments using residual protein content and starch yield as the responses. The results showed that the three selected factors as well as the interaction between enzyme dosage and either hydrolysis time or temperature all had significant effects on residual protein content, but had no significant effects on starch yield. The optimal extraction conditions in the selected experimental ranges were determined as follows: enzyme dosage, 140.79 U/g; temperature, 45.01 ℃; and hydrolysis time, 2.57 h, leading to a starch yield of 60.36% and a residual protein content of 1.31%.

highland barley starch; neutral protease; residual protein; response surface methodology

10.7506/spkx1002-6630-201604006

TS235.1

A

1002-6630（2016）04-0031-06

趙彥巧, 朱志勇, 李建穎, 等. 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化中性蛋白酶輔助提取青稞淀粉工藝[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(4): 31-36. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604006. http://www.spkx.net.cn

ZHAO Yanqiao, ZHU Zhiyong, LI Jianying, et al. Optimization of neutral protease-assisted extraction of highland barley starch[J]. Food Science, 2016, 37(4): 31-36. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604006. http://www.spkx.net.cn

2015-07-09

天津市高?？萍及l(fā)展基金項(xiàng)目（140023）；天津市高等學(xué)?！笆濉本C合投資人才培養(yǎng)項(xiàng)目（507-125RCPY0315）；

天津市教育科學(xué)“十二五”規(guī)劃重點(diǎn)研究課題（HE3024）；天津市科學(xué)技術(shù)普及項(xiàng)目（13KPXM01SY008）；

天津市科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新資金項(xiàng)目（13ZXCXSY08400）

趙彥巧（1979—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物的提取與分離。E-mail：yqzhao@tjcu.edu.cn