溫慧芳，陳麗麗，白春清，趙 利,*，袁美蘭，杜雨芊

基于不同提取方法的鮰魚皮膠原蛋白理化性質(zhì)的比較研究

溫慧芳1，陳麗麗1，白春清1，趙 利1,*，袁美蘭1，杜雨芊2

（1.江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，國家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心，江西 南昌 330013；2.南昌市食品化妝品監(jiān)督所，江西 南昌 330038）

本實(shí)驗(yàn)以鮰魚皮為原料，將堿法、鹽法、熱水法、酸法與酶法提取的膠原蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)的比較，通過對不同膠原蛋白的氨基酸組成、紫外光譜、傅里葉紅外光譜、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）、熱變性溫度、掃描電子顯微鏡圖像以及流變學(xué)特性的研究，從分子結(jié)構(gòu)到微觀結(jié)構(gòu)對膠原蛋白進(jìn)行全面解析和比較。結(jié)果表明：5 種方法提取的膠原蛋白的紫外光譜與紅外光譜都較為相似，為典型的膠原蛋白；堿法、熱水法、鹽法、酸法和酶法提取的膠原蛋白熱變性溫度分別為63.21、71.70、49.49、29.8、22 ℃；SDS-PAGE結(jié)果顯示酸法、酶法、熱水法提取的膠原蛋白均屬于Ⅰ型膠原蛋白，且較好地保留了蛋白的結(jié)構(gòu)；高效液相色譜顯示堿法與鹽法提取的膠原蛋白為多肽的形式；通過流變學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，熱水法提取的膠原蛋白凝膠穩(wěn)定性最高。由此可見，不同的提取方法對膠原蛋白的氨基酸組成、流變性質(zhì)、熱變性溫度以及微觀結(jié)構(gòu)均有不同的影響。

鮰魚；膠原蛋白；堿法；鹽法；熱水法；理化性質(zhì)

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膠原蛋白作為生物體中最重要的結(jié)構(gòu)蛋白之一，占總蛋白含量的25%～30%[1]，主要存在于皮膚、骨骼和韌帶中，起到支撐和保護(hù)機(jī)體的功能。動(dòng)物皮膚中的膠原主要以白色透明、具有四級結(jié)構(gòu)的Ⅰ型纖維狀膠原為主。Ⅰ型膠原分子中含有3 條α多肽鏈，其中2 條相同的多肽鏈稱α1鏈，另外一條與α1鏈的氨基酸組成不同，稱為α2鏈，在一些魚類和低等脊椎動(dòng)物中的膠原蛋白還可能含有α3鏈。膠原蛋白的結(jié)構(gòu)特征是由3 條左手螺旋構(gòu)型的α鏈構(gòu)成三螺旋結(jié)構(gòu)，然后又相互纏繞成右手超螺旋結(jié)構(gòu)[2]。

我國淡水資源豐富，水產(chǎn)加工過程中出現(xiàn)大量的下腳料如魚頭、魚皮和魚骨等，約占魚體質(zhì)量的70%，而這些下腳料中含有豐富的膠原蛋白，大多都被丟棄或制成動(dòng)物飼料，造成環(huán)境的污染和資源的極大浪費(fèi)。冷凍鮰魚片是江西水產(chǎn)行業(yè)的主要?jiǎng)?chuàng)匯產(chǎn)品，鮰魚皮中膠原蛋白的含量高達(dá)28%，遠(yuǎn)高于鳙魚皮和草魚皮，最高可占魚皮粗蛋白總量的80%之多[3]。

現(xiàn)階段對鮰魚皮膠原蛋白的提取多用酸法與酶法提取，限制了鮰魚皮的高效利用。本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新地利用鹽法、堿法以及熱水法從鮰魚皮中提取膠原蛋白，從分子結(jié)構(gòu)到微觀組織全面分析膠原的理化特性，并與酸法、酶法提取的膠原蛋白進(jìn)行分析比較，以期為全面開發(fā)鮰魚皮膠原蛋白提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮰魚皮，江西海浩鄱陽湖水產(chǎn)有限公司提供，平板凍結(jié)保藏。

胃蛋白酶（EC3.4.23.1，3 000 U/mg）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 美國Sigma公司；Tris、考馬斯亮藍(lán)R-250、250 kD標(biāo)準(zhǔn)蛋白 北京索萊寶科技有限公司；β-巰基乙醇 美國Amresco公司；甘氨酸 廈門星隆達(dá)化學(xué)試劑有限公司；30%甲叉雙丙烯酰胺、四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED） 碧云天生物技術(shù)研究所；其余化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JJ1000型精密電子天平 常熟雙杰儀器廠；HZF-A1000型電子天平 美國康州電子科技有限公司；RW20型懸臂攪拌器 德國IKA公司；TDL-5A臺式低速離心機(jī) 上海菲恰爾分析儀器有限公司；Centrifuge 5804R型高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；UV2600紫外分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；Vertex 70傅里葉變換紅外光譜儀 德國Bruker公司；L-8900氨基酸自動(dòng)分析儀 日本日立公司；DSC 200F3型差示掃描量熱儀 德國耐馳儀器制造有限公司；MCR302型流變儀 奧地利安東帕公司；Waters 600高效液相色譜儀（配2487紫外檢測器和M32工作站） 美國Waters公司；JSM-6490LV掃描電子顯微鏡 JEOL日本株式會(huì)社；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE）垂直電泳裝置 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 鮰魚皮的預(yù)處理

將鮰魚皮解凍后用刀刮去大部分脂肪，并剪成10 mm×20 mm的形狀，用10%異丙醇在4 ℃條件下浸泡24 h，清洗干凈后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的NaCl溶液在4 ℃條件下浸泡24 h，洗凈后－20 ℃保藏。

1.3.2 鮰魚皮膠原蛋白的提取

1.3.2.1 堿法提取膠原蛋白

將處理后的魚皮10 g用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%的Ca(OH)2溶液以1∶10（m/V）的料液比于70 ℃提取9 h，5 000 r/min離心后過濾，－45 ℃冷凍干燥，得到堿溶性膠原蛋白。

1.3.2.2 鹽法提取膠原蛋白

將處理好的鮰魚皮與水1∶30（m/V）混合，加入Na2SO4（25 g/L）和NaOH（8 g/L），加熱50 ℃提取2 h，5 000 r/min離心后過濾，－45 ℃冷凍干燥，得到鹽溶性膠原蛋白。

1.3.2.3 熱水法提取膠原蛋白

將處理好的鮰魚皮與水1∶13（m/V）混合，在70 ℃條件下提取6 h，5 000 r/min離心后過濾，－45 ℃冷凍干燥，得到水溶性膠原蛋白。

1.3.2.4 酸法提取膠原蛋白

將預(yù)處理好的鮰魚皮置于0.5 mol/L的乙酸中，以1∶50（m/V）的料液比在15 ℃條件下提取72 h，5 000 r/min離心后過濾，－45 ℃冷凍干燥，得到酸溶性膠原蛋白[4]。

1.3.2.5 酶法提取膠原蛋白

將預(yù)處理好的鮰魚皮置于0.3 mol/L乙酸中，以1∶20（m/V）的料液比加入5 000 U/g胃蛋白酶在37 ℃提取6 h， 5 000 r/min離心后過濾，－45 ℃冷凍干燥，得到酶溶性膠原蛋白[4]。

1.3.3 鮰魚皮膠原蛋白理化性質(zhì)測定

1.3.3.1 膠原蛋白的氨基酸組成分析

采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）AccQ-Tag柱前衍生法對氨基酸組成進(jìn)行分析，稱取20 mg凍干的鮰魚皮膠原蛋白，加入6 mol/L HCl后真空封管，于110 ℃條件下水解24 h。水解完全后，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將HCl蒸干，加入蒸餾水復(fù)溶。水解液加入AccQ-Tag衍生劑進(jìn)行衍生反應(yīng)，衍生好后的樣品用HPLC法進(jìn)行分析。

1.3.3.2 膠原蛋白的紫外光譜掃描

參考Caputo等[5]的方法略有改動(dòng)：將凍干的膠原蛋白成品配制成2 mg/mL溶液，用紫外分光光度計(jì)在200～400 nm波長之間進(jìn)行掃描。

1.3.3.3 膠原蛋白傅里葉紅外光譜掃描

鮰魚皮膠原蛋白的傅里葉變換紅外光譜掃描參照Muyonga等[6]的方法略作改動(dòng)：將干燥的KBr（約100 mg）與鮰魚皮膠原蛋白的凍干制品（2 mg）置于瑪瑙研缽中，徹底磨成粉末狀后，放入壓片機(jī)手動(dòng)壓片，放入樣品室掃描。設(shè)置掃描波數(shù)范圍為4 000～500 cm－1，分辨率為2 cm－1。

1.3.3.4 酸溶性、酶溶性與水溶性膠原蛋白的SDS-PAGE分析

配制質(zhì)量濃度為4 mg/mL的膠原蛋白：取40 mg凍干的膠原蛋白樣品溶解于蛋白質(zhì)可溶性溶液（48%尿素、2% SDS、0.2% Tris-HCl、2.0% β-巰基乙醇，pH 8.8）中，與0.1%溴酚藍(lán)染色劑等體積混合，沸水浴3 min，10 000 r/min離心20 min，除去不溶物。電泳采用濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.5%，在不連續(xù)的Tris-HCl/甘氨酸系統(tǒng)中進(jìn)行，起始電壓為80 V，進(jìn)入分離膠后電壓調(diào)至120 V。待溴酚藍(lán)跑至膠底部1 cm處停止電泳。電泳結(jié)束后，將分離膠置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%考馬斯亮藍(lán)R-250溶液中染色1 h，然后用乙酸-乙醇脫色液處理直至背景色透明為止，最后將膠片放置于凝膠成像系統(tǒng)中拍照。

1.3.3.5 鹽溶性與堿溶性膠原蛋白的分子質(zhì)量分布

根據(jù)HPLC檢測乳鐵蛋白抗菌肽的分子質(zhì)量分布的條件進(jìn)行設(shè)置，色譜條件：色譜柱：TSKgel 2000 SWXL（300 mm×7.8 mm，0.7 μm）；流動(dòng)相體積比：乙醇-水-氯乙酸（450∶550∶1，V/V）；檢測波長：220 nm；流量：0.5 mL/min；柱溫：30 ℃；樣品制備：吸取2 mL樣品于10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至2 mg/mL，用微孔過濾膜0.22 μm過濾后進(jìn)樣。

1.3.3.6 膠原蛋白的熱變性溫度測定

準(zhǔn)確稱取約4 mg樣品于差示掃描量熱儀（differential scanning calorimeter，DSC）坩堝中，加蓋密封后，以空坩堝作參比，從20 ℃加熱至120 ℃，升溫速率為5 ℃/min，樣品室的氮?dú)饬髁繛?0 mL/min。

1.3.3.7 膠原蛋白的流變學(xué)特性研究

取適量凍干的膠原蛋白溶于蒸餾水中，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的膠原蛋白溶液。在20 ℃條件下，剪切頻率為0.1～150 rad/s，膠原蛋白溶液的流變學(xué)曲線測定條件為：椎板40 mm、2 °；在振蕩模式下，采用頻率掃描的數(shù)據(jù)獲取模式，頻率掃描范圍為0.1～150 rad/s；變量掃描為對數(shù)模式，采集33 個(gè)變量點(diǎn)，控制變量為形變率（30%）。研究膠原蛋白溶液的儲(chǔ)能模量（彈性模量）G’、損耗模量（黏性模量）G”隨著振蕩頻率的變化規(guī)律[7]。

1.3.3.8 膠原蛋白的掃描電鏡分析

取適量冷凍干燥好的膠原蛋白樣品置于液氮中冷凍定型，將定型后的樣品切成薄片之后真空噴金，最后在20 kV電壓下放大100 倍觀察膠原蛋白的表面形態(tài)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 6.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用Origin 7.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠原蛋白的氨基酸組成

表1 魚皮膠原蛋白的氨基酸組成Table 1 Amino acid composition of collagens extracted from Chinese longsnout catfish skin by different extraction methods

由表1可知，5 種樣品均具有膠原蛋白的特征性氨基酸，即富含甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸。其中甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丙氨酸的含量均比較豐富；相反，胱氨酸、色氨酸、組氨酸、蘇氨酸以及苯丙氨酸的含量很低甚至沒有；5 種膠原蛋白中甘氨酸含量均最高，約占氨基酸殘基總量的1/3，這是因?yàn)槟z原蛋白多肽鏈很長的區(qū)段序列是由Gly-X-Y氨基酸序列重復(fù)而成的[8]。作為膠原蛋白中的特征氨基酸，羥脯氨酸能夠促進(jìn)肽鏈間氫鍵的形成，氫鍵能夠維持膠原三螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，與膠原蛋白的熱穩(wěn)定性質(zhì)相關(guān)[9]。提取方法不同會(huì)直接影響羥脯氨酸的含量，這可能是因?yàn)椴煌奶崛》椒▽δz原蛋白結(jié)構(gòu)的影響程度不同。熱水提取的方法會(huì)使得膠原蛋白分子中的部分氨基酸被水解，而酶解會(huì)使酶溶性膠原蛋白失去端肽，切斷膠原肽鏈間的共價(jià)交聯(lián)鍵，導(dǎo)致其羥脯氨酸的含量也低于其他膠原蛋白，該結(jié)果也與Knott等[10]的研究結(jié)論一致，而膠原蛋白α鏈間氫鍵的形成主要依賴于羥脯氨酸，它對膠原蛋白分子三級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性起到非常重要旳作用[11]。

2.2 膠原蛋白的紫外光譜分析

圖1 1 鮰魚皮膠原蛋白的紫外吸收光譜Fig.1 UV-visible absorption spectra of collagens from Chinese longsnout catfish skin

蛋白分子在溶液中能夠吸收一定波長范圍的紫外光，產(chǎn)生紫外吸收光譜。蛋白質(zhì)分子之所以能夠吸收紫外光，是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子中含有一些能吸收某一波長的紫外生色基團(tuán)，例如膠原肽鏈所含的—C=O、—COOH、—CONH2都是生色基團(tuán)，蛋白質(zhì)溶液的紫外吸收光譜實(shí)際上是蛋白質(zhì)分子中各種紫外生色基團(tuán)加和的結(jié)果[1]。蛋白質(zhì)分子中的部分官能團(tuán)具有特征性的紫外吸收區(qū)域，如芳香族氨基酸殘基通常在250～280 nm波長范圍內(nèi)有一個(gè)吸收峰；氨基酸殘基、氫鍵或與螺旋等構(gòu)象有關(guān)的次級鍵通常在210～250 nm波長范圍內(nèi)有吸收峰；而蛋白質(zhì)分子中的肽鍵以及許多蛋白質(zhì)構(gòu)象因素通?？僧a(chǎn)生210 nm波長以下的吸收峰[12]。鮰魚皮膠原蛋白的紫外掃描光譜如圖1所示，其特征吸收波長均位于230 nm左右，主要是由肽鍵—C=O的n→π*躍遷所貢獻(xiàn)，這是膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的特征吸收峰，與其他魚類膠原蛋白的研究結(jié)果一致[13-14]。Trp在280 nm波長處有較強(qiáng)的紫外吸收，但是膠原蛋白中幾乎不含有Trp，故在280 nm波長處無吸收峰可作為鑒定膠原蛋白的方法，同時(shí)也表明通過該方法提取得到的膠原蛋白雜蛋白少，純度較高[15]。由以上結(jié)果可初步推斷本實(shí)驗(yàn)所提取的膠原蛋白為典型的膠原蛋白。

2.3 膠原蛋白的紅外光譜分析

圖2 2 鮰魚皮膠原蛋白的紅外光譜圖Fig.2 FTIR spectra of collagens from Chinese longsnout catfish skin

圖2 為不同方式提取的鮰魚皮膠原蛋白的傅里葉紅外光譜圖，5 種樣品都具有膠原蛋白紅外光譜的特征吸收峰，即酰胺A、B、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ吸收峰，酰胺A歸屬于N—H伸縮振動(dòng)，酰胺B歸屬于—CH2的不對稱伸縮振動(dòng)。由文獻(xiàn)[16]可知，酰胺A的吸收峰在3 440～3 400 cm－1處，而當(dāng)含N—H基團(tuán)的肽段參與氫鍵形成時(shí)，N—H基團(tuán)的伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的吸收峰會(huì)降低100 cm－1左右，從圖中可以看出，5 種膠原蛋白均在3 300 cm－1左右有吸收峰出現(xiàn)，說明5 種膠原蛋白分子均有氫鍵的存在。而由于在蛋白分子內(nèi)亞甲基基團(tuán)會(huì)發(fā)生不對稱的伸縮振動(dòng)，使得酰胺B的吸收峰在3 080 cm－1處出現(xiàn)[6]。從圖中可看出，堿法與鹽法提取的膠原蛋白在3 080 cm－1處并無吸收峰，說明亞甲基被破壞，而亞甲基是三級結(jié)構(gòu)的特征基團(tuán)，說明其三級結(jié)構(gòu)受到了破壞。酰胺鍵是蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化敏感特征的官能團(tuán)，常常被用來鑒定和分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，酰胺Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ帶是反映蛋白質(zhì)肽鏈骨架結(jié)構(gòu)的最重要吸收峰。其中C=O伸縮振動(dòng)峰為酰胺Ⅰ，N—H和C—N扭轉(zhuǎn)振動(dòng)峰為酰胺Ⅱ，而甘氨酸和脯氨酸殘基的—CH2特征振動(dòng)峰為酰胺Ⅲ。在蛋白質(zhì)分子內(nèi)，存在大量的肽鍵于氨基酸之間，而羰基鍵的伸縮振動(dòng)會(huì)導(dǎo)致酰胺Ⅰ的特征吸收峰位于1 700～1 600 cm－1處[17]。酰胺Ⅰ與蛋白肽鏈骨架的有序程度密切相關(guān)，有序度越高，則酰胺Ⅰ吸收峰波數(shù)越大[15]。從圖中可以看到，5 種膠原蛋白分子都具有酰胺Ⅰ帶的吸收峰，而堿溶性膠原蛋白的吸收峰波數(shù)較小，故其有序度較低。在已知的膠原蛋白分子中，膠原蛋白酰胺Ⅱ的吸收峰通常位于1 600～1 500 cm－1范圍內(nèi)[18]。圖中顯示在1 550 cm－1處有吸收峰，說明5 種膠原蛋白分子均具有酰胺Ⅱ帶，同酰胺Ⅰ帶一樣，酰胺Ⅱ帶也是由α-螺旋、β-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲疊加共同作用產(chǎn)生的吸收帶。酰胺Ⅲ的吸收峰通常位于1 300～1 200 cm－1，酰胺Ⅲ帶的存在可以證明膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)是否保持完整[19]。對5 種膠原蛋白的紅外光譜分析可以發(fā)現(xiàn)：堿法與鹽法提取的膠原蛋白三級結(jié)構(gòu)被破壞，其余蛋白均保留了完整的三螺旋結(jié)構(gòu)。

2.4 酸溶性、酶溶性與水溶性膠原蛋白的SDS-PAGE結(jié)果

圖3 3 鮰魚皮膠原蛋的SDS-PAGE圖譜AGEFig.3 SDS-PAGE patterns of collagens from Chinese longsnout catfish skin

膠原蛋白呈三股螺旋結(jié)構(gòu)，分子由3 條多肽鏈組成，每條膠原鏈都是左手螺旋構(gòu)型，3 條左手螺旋的α鏈又互相纏繞成右手螺旋結(jié)構(gòu)，即超螺旋結(jié)構(gòu)[20]。牛跟腱膠原蛋白是Ⅰ型膠原蛋白，在電泳分析中作為膠原蛋白的標(biāo)準(zhǔn)品，由圖3可知，酸法、酶法、熱水法提取的膠原蛋白均有1 條β鏈和至少2 條α鏈（α1和α2）組成，與標(biāo)準(zhǔn)品條帶出現(xiàn)的位置一致，可鑒定為Ⅰ型膠原蛋白[21]。而條帶α1中可能含有α3鏈，因?yàn)棣?鏈和α3鏈在單相垂直電泳膠上無法辨別[22]，其中酸法與酶法提取的膠原蛋白具有較多的β鏈與明顯的γ鏈，而熱水法提取的膠原蛋白中只存在較少的β鏈，這可能是因?yàn)闊崴ㄌ崛〉臏囟容^高，使得膠原蛋白中的高分子質(zhì)量部分發(fā)生降解，即γ鏈和β鏈部分，特別是γ鏈的含量大大降低，而出現(xiàn)的低分子質(zhì)量蛋白可能是在提取時(shí)水解高分子部分形成的。本實(shí)驗(yàn)中酸法、酶法、熱水法提取的膠原蛋白的電泳條帶較為清晰，無雜帶出現(xiàn)，說明提取的膠原蛋白具有較高的純度；而膠原蛋白特征條帶的出現(xiàn)說明了利用本實(shí)驗(yàn)工藝提取的膠原蛋白樣品基本保持了其原有的結(jié)構(gòu)。高分子質(zhì)量的γ鏈和β鏈的含量越高，膠原的凝膠強(qiáng)度會(huì)變差[23]。相比于酸法與酶法提取的膠原蛋白，熱水法提取的膠原蛋白β鏈含量顯然較少，這表明水溶性膠原蛋白具有較高的凝膠性能。

2.5 鹽溶性與堿溶性膠原蛋白的分子質(zhì)量

堿溶性與鹽溶性膠原蛋白的平均分子質(zhì)量分布如表2所示，鹽溶性膠原蛋白的分子質(zhì)量集中在700～1 400 D左右，堿溶性膠原蛋白的分子質(zhì)量集中在280～700 D左右，且均無大分子物質(zhì)存在，從分子質(zhì)量分布看來，兩者的α鏈被打斷，呈現(xiàn)多肽的性質(zhì)，說明堿溶性與鹽溶性膠原蛋白在提取過程中發(fā)生降解，此類多肽極易被人體吸收。

表2 鹽溶性與堿溶性膠原蛋白的分子質(zhì)量Table 2 Average relative molecular weight distribution of salt-soluble collagens and alkali-soluble collagens from Chinese longsnout catfish skin

2.6 膠原蛋白的熱變性溫度（Td）

圖4 4 鮰魚皮膠原蛋白的熱變性曲線Fig.4 Thermal denaturation curves of collagens from Chinese longsnout catfish skin

熱變性溫度（Td）通?？梢杂脕矸从衬z原蛋白的熱穩(wěn)定性，即蛋白的熱變性溫度。膠原蛋白的變性是指其三螺旋結(jié)構(gòu)的次級鍵斷裂，螺旋打開后形成無規(guī)則的單鏈線團(tuán)結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致膠原蛋白失去獨(dú)特的性質(zhì)，例如黏度下降、沉降速率增加、浮力上升、紫外吸收增強(qiáng)等[24]。膠原蛋白的熱變性溫度與其羥脯氨酸和脯氨酸的含量有關(guān)，羥脯氨酸和脯氨酸含量越高，膠原蛋白的熱穩(wěn)定性越高[25]，2.1節(jié)的氨基酸組成分析也顯示，鹽溶性膠原蛋白的羥脯氨酸殘基含量最高，故其熱變性溫度也在這5 種膠原蛋白中最高。由圖4可知，酸溶性膠原蛋白的熱變性溫度為29.8 ℃，酶溶性膠原蛋白的熱變性溫度為22 ℃，水溶性膠原蛋白的熱變性溫度為71.7 ℃，鹽溶性膠原蛋白的熱變性溫度為49.49 ℃，堿溶性膠原蛋白的熱變性溫度為63.21 ℃?？梢钥闯?，膠原蛋白的熱變性溫度與提取溫度有很大關(guān)系，因?yàn)閴A法、熱水法、鹽法的提取溫度分別為70、70、50 ℃，與其熱變性溫度相近，由此可推斷出膠原蛋白的熱變性溫度可能受到提取溫度的影響較大。

2.7 膠原蛋白的流變學(xué)特性

膠原蛋白溶液的黏彈性可用振蕩模型進(jìn)行測定，即對膠原分子施加一個(gè)扭擺力矩，使膠原分子在此力矩下發(fā)生運(yùn)動(dòng)。當(dāng)扭擺力矩的頻率從低到高變化時(shí)，分子鏈的運(yùn)動(dòng)也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的改變，據(jù)此測定其黏彈性能。G’為儲(chǔ)能模量或彈性模量，反映膠原分子隨外力的改變而發(fā)生形變的能力；G’為損耗模量或黏性模量，反映膠原分子在外力作用發(fā)生改變時(shí)分子鏈內(nèi)或分子間拉伸導(dǎo)致的能量耗損。

圖5 5 鮰魚皮膠原蛋白溶液的流變學(xué)特性Fig.5 Rheological characteristics of collagen solutions of Chinese longsnout catfish skin

由圖5可知，水溶性膠原蛋白的G’的變化斜率較大，說明在0.4～1.8 rad/s區(qū)間內(nèi)具有較高的凝膠穩(wěn)定性[26]。當(dāng)振蕩頻率較低時(shí)，膠原蛋白溶液主要表現(xiàn)出黏性為主的特征；隨著振蕩頻率的增高，膠原蛋白溶液主要表現(xiàn)出彈性為主的特征。5 種膠原蛋白溶液隨著振蕩頻率的變化出現(xiàn)相同的變化趨勢，說明振蕩頻率的變化可以影響膠原溶液的流變性質(zhì)，而不同膠原溶液的變化呈現(xiàn)不同的程度，說明不同膠原溶液的流變性質(zhì)存在差異。

圖6 黏彈性溶液的三區(qū)模型圖[[2277]]Fig.6 Illustration of three-zone behavior for viscoelastic liquids[27]

膠原蛋白溶液在不同振蕩頻率下的流變行為可用黏彈性液體的三區(qū)模型[28]來描述。如圖6所示，在不同的剪切頻率下，膠原蛋白溶液的流變學(xué)行為可分為3 個(gè)區(qū)域，分別為終止區(qū)、平穩(wěn)區(qū)和過渡區(qū)。當(dāng)剪切頻率較低時(shí)，G’大于G’，溶液以黏性為主；隨著剪切頻率的增大，G’大于G’，溶液以彈性為主；若剪切頻率進(jìn)一步增加，分子結(jié)構(gòu)被破壞，G’又表現(xiàn)為大于G’。

圖7 不同方式提取的膠原蛋白溶液的動(dòng)態(tài)模量Fig.7 Dynamic modulus of collagens obtained by different extraction methods

不同提取方式下鮰魚皮膠原蛋白溶液的黏彈性模量與振蕩頻率的關(guān)系如圖7所示。不同膠原蛋白溶液的黏彈性模量隨著振蕩頻率的增加而增大，除鹽溶性膠原蛋白溶液外，其余膠原蛋白溶液的黏性模量和彈性模量的交點(diǎn)均在終止區(qū)，交點(diǎn)分別為1.08、1.30、1.03、0.86 rad/s，而交點(diǎn)為1.78 rad/s的鹽溶性膠原蛋白溶液出現(xiàn)在平穩(wěn)區(qū)。在幾種膠原蛋白溶液中，堿溶性與鹽溶性膠原蛋白溶液交點(diǎn)的數(shù)值較高，表明其松弛時(shí)間較短。而松弛時(shí)間與原膠原分子運(yùn)動(dòng)以及分子內(nèi)臨近鏈中的—NH和—CO形成的氫鍵有關(guān)。因此，高交點(diǎn)值會(huì)導(dǎo)致膠原分子內(nèi)三螺旋結(jié)構(gòu)被破壞，使得分子內(nèi)流動(dòng)性增加[29]。這種情況可能與提取膠原的方法有關(guān)，堿提法與鹽提法的提取環(huán)境較為刺激，使得原膠原分子的結(jié)構(gòu)被破壞；而酶提法、酸提法、水提法的提取環(huán)境比較溫和，故較好地保留了膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)。

2.8 膠原蛋白的掃描電鏡圖像

圖8 8 鮰魚皮膠原蛋白的掃描電鏡圖像Fig.8 SEM images of collagens from Chinese longsnout catfish skin

如圖8a～8c所示，酸法、酶法、熱水法提取的膠原蛋白在放大100 倍的情況下呈現(xiàn)出規(guī)則的、光滑的、纖維狀的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，且分布均勻，其中酸溶性膠原蛋白的薄片較薄且分布均勻，說明在提取過程中基本保持了膠原蛋白原有的纖維結(jié)構(gòu)，這與Wang Lin等[30]研究的史氏鱘魚皮膠原蛋白的結(jié)構(gòu)類似；熱水法提取的膠原蛋白的薄片分布不均勻且孔徑也大小不一，說明已有部分膠原蛋白交聯(lián)呈現(xiàn)出明膠的性質(zhì)；而酶法提取的膠原蛋白孔徑較多且分布不均勻，說明酶對膠原的結(jié)構(gòu)有部分改變，但明顯還保持了較好的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。如圖8d、8e所示，堿法與鹽法提取的膠原蛋白的結(jié)構(gòu)與前面幾種相比有所不同，表現(xiàn)為多孔基體互相連接而成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在孔與孔之間存在微米薄層，伴有散布的與內(nèi)部貫通的裂紋，表明膠原蛋白有較好的溶解性和吸濕、透氣、導(dǎo)濕的特點(diǎn)[31]。研究表明，膠原蛋白呈現(xiàn)出的不同結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，包括空隙率、孔徑大小、網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)以及表面積等，是其應(yīng)用于不同生物醫(yī)藥材料的重要參數(shù)[32]。通過對幾種不同提取方法而得的膠原蛋白的掃描電鏡圖分析可知，提取方式不同，所得的膠原的性質(zhì)與結(jié)構(gòu)也不盡相同，其中酸法、酶法、熱水法提取的膠原蛋白保留了較完整的纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可較好地應(yīng)用于生物醫(yī)藥材料；而堿法與鹽法所得的膠原蛋白薄片部分被破壞，只留下多孔狀的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其作為食品加工輔料（例如魚糜改良劑、飲料增稠劑等）和化妝品、保健品等可起到較好的作用。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)分析對比了酸法、酶法、堿法、鹽法以及熱水法提取鮰魚皮膠原蛋白的理化特性：氨基酸組成分析表明5 種膠原蛋白均存在特征氨基酸，羥脯氨酸占總蛋白的比例為70%左右，且在230 nm波長處出現(xiàn)最大紫外吸收峰，故5 種樣品均為典型的膠原蛋白；堿法、熱水法、鹽法、酸法和酶法提取的膠原蛋白熱變性溫度分別為63.21、71.70、49.49、29.8、22 ℃；紅外光譜以及SDS-PAGE圖譜分析表明，酸法、酶法和熱水法提取的膠原蛋白均為典型的Ⅰ型膠原蛋白，鹽法與堿法提取的膠原蛋白為膠原蛋白多肽；流變學(xué)特性測定結(jié)果表明酸法、酶法和熱水法提取的膠原蛋白保留了較好蛋白結(jié)構(gòu)，其中水溶性膠原蛋白的凝膠穩(wěn)定性最高；從掃描電鏡圖片可以看出，酸法、酶法和熱水法提取的膠原蛋白保留了較完整的纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，堿法與鹽法所得的膠原蛋白部分結(jié)構(gòu)被破壞，形成多孔狀的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

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Comparative Study on Physical and Chemical Properties of Collagens Obtained by Different Extraction Methods from the Skin of the Chinese Longsnout Catfish Leiocassis longirostris

WEN Huifang1, CHEN Lili1, BAI Chunqing1, ZHAO Li1,*, YUAN Meilan1, DU Yuqian2
(1. National Research and Development Branch Center for Conventional Freshwater Fish Processing, College of Life Science, Jiangxi Science and Technology Normal University, Nanchang 330013, China; 2. Nanchang Food and Cosmetics Supervision Institution, Nanchang 330038, China)

Collagens extracted from the skin of the Chinese longsnout catfish Leiocassis longirostris by alkali, salt, hot water, acid and pepsin were comparatively evaluated for their chemical and structural properties (amino acid compositions, thermo-stability, molecular weight distribution and scanning electron microscope) and rheological characteristics. The results showed that all collagens presented similar UV spectrum with the absorption peak at 230 nm. SDS-PAGE indicated collagens extracted by acid, pepsin and water belonged to collagen I with well-preserved structure. The denaturation temperatures of collagens extracted by alkali, water, salt, acid and pepsin were 63.21, 71.70, 49.49, 29.8 and 22 ℃, respectively. The salt-extractable collagen was polypeptides as analyzed by high-performance liquid chromatography (HPLC). The water-soluble collagen from the fish skin presented the highest gel stability. Therefore, different extraction methods could result in differences in the chemical and structural properties of fish skin collagens.

Leiocassis longirostris; collagen; alkali extraction; salt extraction; hot-water extraction; physicochemical properties

10.7506/spkx1002-6630-201601014

S986.1

A

1002-6630（2016）01-0074-08

溫慧芳, 陳麗麗, 白春清, 等. 基于不同提取方法的鮰魚皮膠原蛋白理化性質(zhì)的比較研究[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(1): 74-81.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601014. http://www.spkx.net.cn

WEN Huifang, CHEN Lili, BAI Chunqing, et al. Comparative study on physical and chemical properties of collagens obtained by different extraction methods from the skin of the Chinese longsnout catfish Leiocassis longirostris[J]. Food Science, 2016, 37(1): 74-81. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601014.

2015-04-20

江西省高等學(xué)?？萍悸涞赜?jì)劃項(xiàng)目（KJLD12009）；江西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)

溫慧芳（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)。E-mail：susie20102389@sina.cn

*通信作者：趙利（1967—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)。E-mail：lizhao618@hotmail.com