譚林林，王建新，李 濤，王 慧

腸出血性大腸桿菌z4832基因缺失突變株的構(gòu)建

譚林林1，2，王建新2，李 濤2，王 慧1，2

目的 利用Red重組系統(tǒng)的同源重組功能，敲除腸出血性大腸桿菌O157∶H7（EHEC O157∶H7）的乙酰轉(zhuǎn)移酶基因z4832，構(gòu)建z4832基因缺失突變株。方法 EHEC O157∶H7的基因組作為模板，PCR擴增目的基因兩側(cè)的同源臂序列；將上下游同源臂連接于pUC19-kana質(zhì)粒上卡那霉素（kana）抗性基因的兩端；PCR擴增獲得中間嵌合卡那霉素抗性基因的同源臂線性片段，利用質(zhì)粒pKD46介導(dǎo)的重組技術(shù)敲除z4832基因，利用pCP20質(zhì)粒介導(dǎo)的重組技術(shù)去除抗性標記。PCR擴增及DNA測序驗證目的基因缺失后，測定突變株及野生株的生長曲線，檢測在抗菌藥物氧氟沙星中的存活率。結(jié)果 成功構(gòu)建EHEC O157∶H7 z4832基因缺失突變株。z4832缺失突變株生長速度與野生株差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但在含氧氟沙星的LB培養(yǎng)基中突變株存活率升高（P＜0.05），在含氧氟沙星的M9培養(yǎng)基中存活率下降（P＜0.05）。結(jié)論 構(gòu)建z4832缺失突變株，研究z4832與腸出血性大腸桿菌耐藥性之間的關(guān)系，為進一步研究乙酰轉(zhuǎn)移酶在EHEC O157∶H7中的作用機制奠定了基礎(chǔ)。

腸出血性大腸桿菌O157∶H7；Red重組系統(tǒng)；乙酰轉(zhuǎn)移酶；抗生素

腸出血性大腸桿菌（EHEC）是主要的食源性致病菌之一，通過糞便或屠宰過程污染飲水和肉類及其他食品，并且可以在水果蔬菜中長期存活［1］。由其引發(fā)的食物中毒在世界各地均有過暴發(fā)流行［2］。人感染該病原菌后可引發(fā)溶血性尿毒綜合征（heomlytic uremic syndrome，HUS）及血栓性血小板減少紫癜（thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP）等嚴重并發(fā)癥［3］。生物信息分析結(jié)果顯示EHEC O157∶H7基因組中z4832基因所編碼蛋白為乙酰轉(zhuǎn)移酶。蛋白質(zhì)乙?；揎椧驗楸话l(fā)現(xiàn)參與轉(zhuǎn)錄、代謝等多個重要領(lǐng)域而受到廣泛關(guān)注和研究［4-6］。經(jīng)預(yù)測，z4832基因?qū)儆贕NAT家族。GNAT家族在生物界廣泛存在，能夠把乙酰輔酶A的乙?；D(zhuǎn)移至乙酰基受體上，通過改變小分子或者蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能從而發(fā)揮生理功能［7-10］。該研究利用Red同源重組系統(tǒng)，敲除EHEC O157∶H7的乙酰轉(zhuǎn)移酶基因z4832，構(gòu)建z4832基因缺失突變株；結(jié)果表明，z4832基因缺失突變株在含有氧氟沙星的培養(yǎng)基中存活率發(fā)生改變。這為將來研究EHEC的致病機制提供了依據(jù)和材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 EHEC O157∶H7 EDL933菌株、pCP20質(zhì)粒、pKD46質(zhì)粒、插入卡那霉素（kana）抗性基因的質(zhì)粒pUC19-kana由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院保存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、pEASY-T1 simple載體和大腸桿菌BL21（DE3）表達感受態(tài)細胞購自北京TransGen生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 引物設(shè)計 PCR引物由中美泰和生物技術(shù)有限公司合成（表1），其中U1-HindⅢ、U2-SalⅠ用于擴增z4832基因上游500 bp同源臂（z4832-up）；D1-BamHⅠ、D2-EcoRⅠ用于擴增z4832基因下游500 bp同源臂（z4832-down）；kana-SalⅠ、kana-BamHⅠ用于擴增kana基因（帶有FRT位點）。

表1 引物序列

1.1.3 主要試劑 基因組提取試劑盒購自美國Promega公司；TransStart Taq DNA聚合酶、PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自北京TransGen生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶均購自美國NEB公司；2 mm電轉(zhuǎn)杯購自美國BIO-RAD公司。

1.1.4 主要儀器 恒溫振蕩搖床購自太倉市實驗設(shè)備廠；PE-2400 PCR擴增儀購自美國PE公司；Scp85H高速冷凍離心機購自日本HITACHI公司；SpectroPlus全自動酶聯(lián)免疫檢測儀購自美國MD公司；GenePulser Xcell電穿孔儀購自美國BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建z4832打靶片段 以提取的EHEC O157∶H7 EDL933菌株基因組作為模板，以U1-HindⅢ和U2-SalⅠ為引物PCR擴增z4832基因上游的500 bp同源臂序列，以D1-BamHⅠ和D2-EcoRⅠ為引物PCR擴增z4832基因下游的500 bp同源臂序列。用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物，然后與克隆載體pEASY-T1 simple連接，分別獲得pEASY-T1-z4832-up質(zhì)粒和pEASY-T1-z4832-down質(zhì)粒；將兩種質(zhì)粒以及pUC19-kana分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。分別構(gòu)建pEASYT1-z4832-up/DH5α、pEASY-T1-z4832-down/DH5α、pEASY-T1-kana/DH5α菌株，并從中提取pEASYT1-z4832-up質(zhì)粒、pEASY-T1-z4832-down質(zhì)粒、pUC19-kana質(zhì)粒。

用HindⅢ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切pEASY-T1-z4832-up質(zhì)粒；BamHⅠ和EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切pEASY-T1-z4832-down質(zhì)粒；SalⅠ和BamHⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切pUC19質(zhì)粒。上下游同源臂分別連接至kana的兩側(cè)，構(gòu)建pUC19-z4832-up-kana-z4832-down質(zhì)粒。提取該質(zhì)粒，用引物U1-HindⅢ和D2-EcoRⅠ擴增UKD打靶片段，用DpnⅠ內(nèi)切酶處理，純化回收，獲得線性打靶片段。

1.2.2 pKD46質(zhì)粒導(dǎo)入EHEC O157∶H7 將EHEC O157∶H7菌株接入新鮮的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，復(fù)蘇菌株。將復(fù)蘇的EHEC O157∶H7按1∶100的比例接入10 ml新鮮LB培養(yǎng)基中，37℃、2 00 r/min條件下培養(yǎng)至光密度（optical density，OD）值OD600mm約為0，4時取出，冰浴10 min。4 000 r/min、4℃條件下離心2 min，富集菌體。用冰冷的10%甘油洗滌3次菌體，每次離心條件均為4 000 r/ min、4℃、2 min。將菌體溶解到100 μl 10%甘油中制成感受態(tài)細胞。向感受態(tài)細胞中加入pKD46質(zhì)粒，2.5 kv、200 Ω、25 μF電擊，然后加入1 ml冰冷的LB培養(yǎng)基。將電轉(zhuǎn)杯封口，在30℃、2 00 r/min條件下培養(yǎng)1 h，取500 μl菌體涂于含100 μg/ml氨芐青霉素的LB平板，30℃培養(yǎng)，次日挑取單克隆，經(jīng)PCR鑒定構(gòu)建pKD46/EHEC菌株。

1.2.3 z4832目的基因的敲除 將pKD46/EHEC菌株于30℃、200 r/min過夜復(fù)蘇。次日按1∶100的比例轉(zhuǎn)接于10 ml新鮮LB培養(yǎng)基中30℃、200 r/ min培養(yǎng)，待菌液OD600nm到達0.3時，添加L-阿拉伯糖至終濃度為30 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，待OD600nm約為0.6時取出。冰浴10 min，4℃、5 000 r/min離心2 min收集菌體，相同的離心條件下用蒸餾水洗菌體3遍，10%甘油洗3遍，最后用100 μl、10%甘油重懸菌體，4℃放置15 min即制得感受態(tài)細胞。向感受態(tài)細胞中加入100 ng純化后的線性打靶片段，混勻后冰浴15 min，然后將混合物轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，在電壓2.5 kV，電阻200 Ω，頻率25 μF條件下電擊。電擊后加入1 ml冰冷的LB培養(yǎng)基，37℃、200 r/min條件下培養(yǎng)1 h。吸取500 μl菌液涂布含50 μg/ml卡那霉素的LB平板，37℃培養(yǎng)過夜。次日挑取單克隆，U1-HindⅢ和D2-EcoRⅠ引物PCR鑒定打靶片段正確重組菌即為目的基因缺失的陽性克隆，其中kana基因置換z4832基因。

1.2.4 卡那霉素抗性基因的消除 將已經(jīng)敲除目的基因的陽性克隆傳代3次，37℃、200 r/min培養(yǎng)，待菌液OD600nm到達0.6時，按照1.2.3中方法制備感受態(tài)細胞，加入200 ng pCP20質(zhì)粒，冰浴15 min，然后電擊轉(zhuǎn)化，電擊之后立刻加入1 ml冰冷的LB培養(yǎng)基。封閉電轉(zhuǎn)杯，30℃、200 r/min培養(yǎng)1 h。取200 μl菌液涂布含100 μg/ml氨芐霉素的LB平板，30℃倒置培養(yǎng)過夜，次日挑取單克隆，U1-HindⅢ和D2-EcoRⅠ引物鑒定陽性克隆，將卡那抗性基因丟失的陽性克隆轉(zhuǎn)接于新鮮LB培養(yǎng)基中，42℃、200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)過夜，次日將菌液適當稀釋后涂布LB平板，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單克隆分別在含100 μg/ml氨芐霉素的LB平板和50 μg/ml卡那霉素LB平板上劃線培養(yǎng)。對在兩種含抗生素的平板上均不生長的克隆，進行基因組定位測序。其中不具有pKD46和pCP20質(zhì)粒的菌株即為z4832基因缺失突變株。

1.2.5 野生株及缺失突變株生長曲線的測定 將過夜培養(yǎng)的EHEC O157∶H7野生株和z4832基因缺失突變株按1∶100的比例接種至200 ml培養(yǎng)瓶中。37℃、200 r/min培養(yǎng)。每隔1 h測定1次OD600nm。每株菌做3個平行。將所得數(shù)據(jù)繪成生長曲線。

1.2.6 野生株及缺失突變株在含氧氟沙星的M9和LB培養(yǎng)基中存活率的測定 將EHEC O157∶H7野生株和z4832基因缺失突變株復(fù)蘇后按1∶100接種到5 ml LB或M9培養(yǎng)基內(nèi)。37℃、200 r/min搖至OD600nm約為0.5時取出500 μl加入到500 μl含10 μg/ml氧氟沙星的LB或M9培養(yǎng)基內(nèi)，37℃、200 r/min培養(yǎng)5 h后取出，13 000 r/min離心5 min，收集所有菌液。PBS洗1次后，取適量稀釋后涂LB平板，37℃培養(yǎng)16 h，每個濃度和稀釋度各3個平行。根據(jù)平板上的細菌克隆數(shù)計算存活率。只取其中克隆數(shù)在10到100個之間的平板計數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增z4832基因上下游同源臂 PCR擴增z4832基因上游500 bp同源臂z4832-up和下游500 bp同源臂z4832-down（圖1A）；分別酶切連接于pUC19-kana質(zhì)粒kana基因的兩側(cè)，構(gòu)建pUC19-z4832-up-kana-z4832-down，用引物U1-HindⅢ和D2-EcoRⅠ擴增出打靶片段（圖1B）。

2.2 PCR鑒定目的基因缺失突變株 挑取轉(zhuǎn)化打靶片段后的單克隆，以引物U1-HindⅢ和D2-EcoRⅠ鑒定重組菌，正確重組菌PCR產(chǎn)物大小為2 500 bp（圖1C）。

2.3 卡那基因的敲除及鑒定 以U1-HindⅢ和D2-EcoRⅠ為引物鑒定kana基因敲除突變株。pCP20質(zhì)粒表達的FLP重組酶識別kana基因兩端的FRT位點，敲除kana基因，PCR產(chǎn)物大小約1 000 bp（圖1D）。

2.4 野生株及z4832缺失突變株生長曲線的比較

每隔1 h測定菌液的OD600nm，監(jiān)測10 h，繪制生長曲線，z4832缺失突變株與野生株生長速度差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖2。

2.5 野生株及z4832缺失株在含氧氟沙星的M9和LB培養(yǎng)基中存活率的比較 在含有氧氟沙星的LB培養(yǎng)基中z4832基因缺失株存活率比野生株高4.3倍，兩者存活率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。而在含有氧氟沙星的M9培養(yǎng)基中z4832基因缺失株存活率比野生株低4倍，兩者存活率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

3 討論

在病原微生物研究中基因敲除是確定基因未知功能和闡明其致病機制的一種重要手段。目前Red同源重組技術(shù)已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于大腸桿菌的基因敲除，該技術(shù)有同源序列短、重組效率高等特點，可在DNA靶標分子的任意位點進行基因敲除、敲入、點突變等操作。本研究利用該技術(shù)成功構(gòu)建了EHEC O157∶H7的z4832基因缺失突變株，并且對傳統(tǒng)的操作方法做了一些改進。感受態(tài)的制備采用現(xiàn)用現(xiàn)制備的方案，制好后4℃靜置15 min后使用，此時感受態(tài)細胞活力最佳，使轉(zhuǎn)化效率提高；電擊轉(zhuǎn)化之前的操作使用4℃預(yù)冷的槍頭能夠防止感受態(tài)細胞升溫，保持其活力；阿拉伯糖終濃度為30 mmol/L，誘導(dǎo)時間為60 min，能夠提高重組酶表達量；在卡那霉素基因替換目標基因后，將細菌傳代3次有利于之后卡那霉素基因的去除。

GNAT家族與許多生理反應(yīng)相關(guān)，包括耐藥、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、壓力反應(yīng)以及代謝等，其可以利用乙酰輔酶A乙?；髯缘牡孜锊⑨尫泡o酶A和乙?；漠a(chǎn)物［11］。通過測定生長曲線發(fā)現(xiàn)z4832基因缺失后EHEC O157∶H7生長速度與野生株相比并無顯著差異，說明其表達產(chǎn)物作為乙酰轉(zhuǎn)移酶在細菌生理進程中的作用與生長速度無關(guān)，z4832基因的缺失并不會影響細菌的正常生長。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖2 野生株及z4832缺失突變株生長曲線

圖3 野生株及z4832缺失突變株在含有氧氟沙星的LB培養(yǎng)基中的存活率

圖4 野生株及z4832缺失突變株在含有氧氟沙星的M9培養(yǎng)基中的存活率

在含有氧氟沙星的LB培養(yǎng)基中z4832基因缺失突變株存活率高于野生株，而在含有氧氟沙星的M9培養(yǎng)基中z4832基因缺失突變株存活率卻低于野生株。兩者結(jié)果截然不同，說明不同的碳源影響了乙酰轉(zhuǎn)移酶的作用結(jié)果，進一步推測該乙酰轉(zhuǎn)移酶可能與細菌的代謝相關(guān)，其具體的作用機制將在后續(xù)工作中進一步探索。本實驗構(gòu)建的EHEC O157∶H7的z4832基因缺失突變株為下一步機制研究提供了材料和依據(jù)。

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Construction of z4832 defective mutant of enterohemorrhagic Escherichia coli

Tan Linlin1，2，Wang Jianxin2，Li Tao2，et al
（1Anhui Medical University，Hefei 230032；2State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity，Institute of Microbiology and Epidemiology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071）

Objective To construct acetyltransferase defective mutant of enterohemorrhagic Escherichia coli O157∶H7（EHEC O157∶H7）with λRed recombination system.Methods Kanamycin-resistant gene with two FRT sites and homologous regions which were cloned from EHEC O157∶H7 by PCR were inserted into plasmid pUC19 to construct a recombinant vector.z4832 was deleted with the recombination function of plasmid pKD46.The kanamycin-resistant gene was deleted with the recombination function of plasmid pCP20.The gene deletion mutant was obtained and identified by PCR and sequencing.Then the growth curve was determined and the change of survival rate were checked in LB or M9 medium containing ofloxacin.Results The acetyltransferase gene z4832 defective mutantof EHEC O157∶H7 was successfully constructed.The growth curve of the mutant had no significant difference with that of wild strain.The viability of deletion mutant increased in the culture with LB medium（P＜0.05）but reduced with M9 medium（P＜0.05）.Conclusion The construction of z4832 defective mutant would be helpful for study of the effect of z4832 on antibiotic tolerance and the mechanism by which acetyltransferase works.

EHEC O157∶H7；λRed recombinant system；acetyltransferase；antibiotics

Q 939.93

A

1000-1492（2016）08-1111-05

時間：2016-6-22 14：44：58

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160622.1444.016.html

2016-05-04 接收

國家自然科學(xué)基金（編號：81401643）

1安徽醫(yī)科大學(xué)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，合肥 230032

2軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071

譚林林，女，碩士研究生；

王 慧，女，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：geno0109@ vip.sina.com