耿天龍，李佛生，于　敏，羅楓雪，唐　琳，王勝華

( 四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，成都 610064 )

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不同抗生素對(duì)金發(fā)草愈傷組織生長分化的影響

耿天龍，李佛生，于敏，羅楓雪，唐琳，王勝華*

( 四川大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，成都 610064 )

該研究以金發(fā)草愈傷組織為材料，通過分析比較不同抗生素種類(卡那霉素、潮霉素、頭孢噻呋鈉和氨芐青霉素)和濃度對(duì)金發(fā)草愈傷組織生長分化的影響，來確定適用于金發(fā)草遺傳轉(zhuǎn)化體系中的抗性篩選劑和抑菌劑。結(jié)果表明：(1)金發(fā)草愈傷組織對(duì)卡那霉素很敏感，且其分化率隨著卡那霉素濃度的增加顯著減少(P=0.01)。當(dāng)卡那霉素濃度為10 mg·L-1時(shí)，金發(fā)草愈傷組織的生長分化受到明顯抑制，且有大量的白化苗形成，但分化率仍有36.56%；當(dāng)卡那霉素濃度為15 mg·L-1時(shí)，金發(fā)草愈傷組織的分化率為11.94%，只有很少部分的愈傷分化出綠色的叢生苗；當(dāng)卡那霉素濃度為20 mg·L-1時(shí)，金發(fā)草愈傷組織基本褐化死亡，分化率僅為2.26%。因此，濃度為15 mg·L-1的卡那霉素適合作為金發(fā)草遺傳轉(zhuǎn)化體系中的抗性篩選劑。(2)金發(fā)草愈傷組織對(duì)潮霉素的敏感性要比卡那霉素弱，且潮霉素對(duì)金發(fā)草愈傷組織分化率的影響小，但毒害作用大。因此，潮霉素不適合作為金發(fā)草遺傳轉(zhuǎn)化體系中的抗性篩選劑。(3)300 mg·L-1的頭孢霉素和氨芐青霉素對(duì)金發(fā)草愈傷組織生長分化影響很小且能有效抑制雜菌的生長，較高濃度的氨芐青霉素對(duì)金發(fā)草愈傷組織的抑制作用不太明顯。因此，300 mg·L-1的頭孢霉素和較高濃度的氨芐青霉素均可作為金發(fā)草遺傳轉(zhuǎn)化體系中的抑菌劑。該研究確定了適用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的金發(fā)草遺傳轉(zhuǎn)化體系中的抗性篩選劑和抑菌劑，為金發(fā)草的遺傳改良及功能性基因的研究奠定了基礎(chǔ)。

金發(fā)草，愈傷組織，抗生素，遺傳轉(zhuǎn)化，抗性篩選劑，抑菌劑

在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物基因遺傳轉(zhuǎn)化體系中，抗生素是必不可少的，且根據(jù)其功能不同主要分為抗性篩選劑和抑菌劑兩類(鄭進(jìn)等，2006)。抗性篩選劑是用于淘汰未轉(zhuǎn)化成功的植株，而轉(zhuǎn)化成功植株又不受影響的一類抗生素(譚偉等，2008)。抑菌劑是在農(nóng)桿菌侵染之后，能及時(shí)有效地殺死或抑制植物受體材料上多余的農(nóng)桿菌和雜菌，防止其危害植物受體材料并影響植株再生的一類抗生素(徐淑紅和徐香玲，2004)。然而，不同植物受體材料對(duì)抗生素敏感程度和毒害耐受程度均不同，每種植物受體材料都有它適合的抗生素種類和用量(鄭進(jìn)等，2006；李文蘭等，2010；茆永萍等，2012；唐亞萍等，2012；高行英等，2013；于永明等，2014)。因此，在建立植物農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系之前，必須進(jìn)行抗生素的敏感性試驗(yàn)，以篩選出合適的抗生素種類和濃度作為遺傳轉(zhuǎn)化體系的抗性篩選劑和抑菌劑。

植物轉(zhuǎn)基因中常用抗性篩選基因有nptⅡ基因、aph(4)-Ⅰ基因和spec基因等。其中，nptⅡ基因轉(zhuǎn)入植物基因組后通過編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，使轉(zhuǎn)化植株具有抗卡那霉素、新霉素和G418等抗性；aph(4)-Ⅰ基因轉(zhuǎn)入植株之后具有抗潮霉素的抗性(王相春等，2011)。常用的抑菌劑主要有頭孢噻呋鈉類、青霉素類和大環(huán)內(nèi)脂類(徐淑紅和徐香玲，2004)。其中，最常用的頭孢噻呋鈉和氨芐青霉素分別為頭孢噻呋鈉類和青霉素類。雖然各種抑菌劑對(duì)細(xì)菌的作用機(jī)理不盡相同，但頭孢噻呋鈉類抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)與青霉素類不同之處在于母核7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)取代了6-氨基青霉烷酸，所以兩者對(duì)細(xì)菌的作用機(jī)理相似(鄭進(jìn)等，2006)。

金發(fā)草(Pogonatherumpaniceum)是一種多年生禾本科巖生草本植物，廣泛分布于亞洲的溫帶、熱帶和亞熱帶地區(qū)，大洋洲及非洲等地區(qū)，以及我國的西南、南部地區(qū)和臺(tái)灣等 (中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會(huì), 1997)。金發(fā)草根系發(fā)達(dá)，抗旱耐瘠，可在風(fēng)化巖石、滑坡、裸地等惡劣的生態(tài)環(huán)境中生長并形成草坪，是一種許多逆境生態(tài)恢復(fù)的先鋒物種，在水土保持、生態(tài)護(hù)坡方面有著較好的應(yīng)用前景(王海洋等，2005；王文國等，2010)。金發(fā)草稈質(zhì)堅(jiān)硬，外形酷似小竹，節(jié)上生根，自然形態(tài)優(yōu)美，可作為園林綠化植物(王海洋等，2005)。金發(fā)草不同外植體(莖、葉、種子等)的再生體系已經(jīng)建立，其愈傷組織誘導(dǎo)率與再生率高達(dá)100%(Wang et al，2006，2007)。然而，不同抗生素對(duì)金發(fā)草愈傷組織生長分化的影響還未有相關(guān)報(bào)道，且對(duì)其遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立至關(guān)重要。因此，本研究以金發(fā)草愈傷組織為材料，綜合分析比較卡那霉素/潮霉素/頭孢噻呋鈉和氨芐青霉素對(duì)金發(fā)草愈傷組織生長分化的影響，以期確定適用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的金發(fā)草遺傳轉(zhuǎn)化體系中的抗性篩選劑和抑菌劑。

1　材料與方法

1.1 植物材料

金發(fā)草種子采自四川省遂寧市。挑選飽滿成熟的種子，20%次氯酸鈉浸泡15 min后，無菌水沖洗3～5次，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)出愈傷組織；然后將愈傷組織塊轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中，兩周繼代一次，挑取白色或黃白色多瘤狀胚性愈傷組織，作為實(shí)驗(yàn)材料。誘導(dǎo)愈傷及繼代培養(yǎng)都是在(26 ± 1)℃暗條件下進(jìn)行(Wang et al，2006，2007)。

表 1　卡那霉素對(duì)金發(fā)草愈傷組織生長分化的影響

注：分化率數(shù)據(jù)用平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，且數(shù)據(jù)后的不同大寫字母表示處理間在0.01水平有顯著差異。下同。

Note: Data of differentiation rate are expressed as mean ± SD, and the different uppercases behind the data represent significant differences among treatments at the level of 0.01. The same below.

1.2 試劑與培養(yǎng)基

卡那霉素、潮霉素、頭孢噻呋鈉和氨芐青霉素均購自于SIGMA公司；誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)基為MS+NAA 2 mg·L-1+2,4-D 1 mg·L-1+3%蔗糖+0.8%瓊脂粉(pH5.8)；分化培養(yǎng)基為MS+3%蔗糖+0.8%瓊脂粉+不同濃度和種類的抗生素(pH 5.8)。

表 2　潮霉素對(duì)金發(fā)草愈傷組織生長分化的影響

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將生長良好的愈傷組織分別放入含不同濃度和種類抗生素的分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，如5、10、15、20、30、50 mg·L-1的卡那霉素，10、20、30、50、100 mg·L-1的潮霉素，300、500、1 000 mg·L-1的頭孢噻呋鈉和500、1 000 mg·L-1的氨芐青霉素。每瓶大約30塊愈傷組織，重復(fù)四次，以未添加抗生素的分化培養(yǎng)基為對(duì)照。培養(yǎng)條件為(25 ± 1)℃，2 000 lx光照12 h/d。3周后觀察不同抗生素及其濃度對(duì)金發(fā)草愈傷組織生長和誘導(dǎo)叢生芽的抑制作用，拍照，記錄數(shù)據(jù)并分析。

2　結(jié)果與分析

2.1 卡那霉素對(duì)金發(fā)草愈傷組織生長分化的影響

表1顯示，金發(fā)草愈傷組織對(duì)卡那霉素的敏感性很強(qiáng)。 當(dāng)卡那霉素濃度為10 mg·L-1時(shí)，金發(fā)草愈傷組織的生長和分化受到明顯抑制，并出現(xiàn)大量白化苗(圖1)，但分化率仍有36.56%。當(dāng)卡那霉素濃度為15 mg·L-1時(shí)，金發(fā)草愈傷組織的分化率為11.94%，只有很小部分的愈傷分化出綠色的叢生苗。然而，當(dāng)卡那霉素濃度為20 mg·L-1時(shí)，金發(fā)草愈傷組織基本褐化死亡，分化率也只有2.26%。因此，15 mg·L-1的卡那霉素濃度適合作為金發(fā)草遺傳轉(zhuǎn)化體系中的抗性篩選劑。

圖 1　卡那霉素對(duì)金發(fā)草愈傷組織生長分化的影響　A. 對(duì)照，未加卡那霉素；B. 10 mg·L-1卡那霉素。Fig. 1　Effects of Kanamycin on the growth and differentiation of P. paniceum callus　A. CK, no antibiotics; B. 10 mg·L-1 Kanamycin.

圖 2　潮霉素對(duì)金發(fā)草愈傷組織生長分化的影響　A. 10 mg·L-1潮霉素；B. 100 mg·L-1卡那霉素。Fig. 2　Effects of Hygromycin on the growth and differentiation of P. paniceum callusA. 10 mg·L-1 Hygromycin; B. 100 mg·L-1 Hygromycin.

圖 3　頭孢噻呋鈉和氨芐青霉素對(duì)金發(fā)草愈傷組織生長分化的影響　A. 300 mg·L-1頭孢噻呋鈉；B. 1 000 mg·L-1頭孢噻呋鈉；C. 500 mg·L-1氨芐青霉素；D. 1 000 mg·L-1氨芐青霉素。Fig. 3　Effects of different concentration of Ceftiofur sodium and Ampicillin on the growth and differentiation of P. paniceum callus　A. 300 mg·L-1 Ceftiofur sodium; B. 1 000 mg·L-1 Ceftiofur sodium; C. 500 mg·L-1 Ampicillin; D. 1 000 mg·L-1 Ampicillin.

2.2 潮霉素對(duì)金發(fā)草愈傷組織生長分化的影響

由表2可知，金發(fā)草愈傷組織對(duì)潮霉素的敏感程度比卡那霉素弱，但毒害作用大。與10 mg·L-1的卡那霉素相比，10 mg·L-1的潮霉素幾乎不影響金發(fā)草愈傷組織的分化，其分化率仍可達(dá)到95.25%，但分化出來的叢生苗較小(表2，圖2：A)。當(dāng)潮霉素濃度為50 mg·L-1時(shí)，仍有超過一半的愈傷組織可以分化出叢生苗，只是在分化出的叢生苗的愈傷面積中有70%～80%被褐化，而且分化出的叢生苗極小。另外，當(dāng)潮霉素濃度達(dá)到100 mg·L-1時(shí)，大部分愈傷死亡，而存活的愈傷塊表面變綠，說明仍有愈傷組織分化，分化率為20.25%，只是未能觀察到叢生的小苗(圖2：B)。這說明潮霉素比卡那霉素對(duì)愈傷組織分化率的影響較小，但毒害作用更大，主要導(dǎo)致愈傷組織的褐化或死亡，很少有白化現(xiàn)象。因此，潮霉素不適合作為金發(fā)草愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系中的抗性篩選劑。

2.3 頭孢噻呋鈉和氨芐青霉素對(duì)金發(fā)草愈傷組織生長分化的影響

本研究中，300 mg·L-1的頭孢噻呋鈉對(duì)金發(fā)草愈傷組織分化影響很小，分化出來的叢生苗生長良好(圖3：A)。然而，當(dāng)頭孢噻呋鈉濃度達(dá)到1 000 mg·L-1時(shí)，約一半的愈傷被抑制生長，且分化出的小苗顏色發(fā)黃且有白化現(xiàn)象(圖3：B)。這說明高濃度的頭孢噻呋鈉對(duì)金發(fā)草愈傷組織有一定的毒害作用。因此，300 mg·L-1的頭孢噻呋鈉可以作為金發(fā)草遺傳轉(zhuǎn)化體系中的抑菌劑。

與頭孢噻呋鈉相比，氨芐青霉素對(duì)金發(fā)草愈傷組織的抑制作用不太明顯，當(dāng)氨芐青霉素濃度為500 mg·L-1時(shí)，對(duì)金發(fā)草愈傷組織的生長分化基本無影響，分化出的叢生苗生長良好(表3，圖3：C)。當(dāng)氨芐青霉素濃度為1 000 mg·L-1時(shí)，仍有85.75%的分化率，只是分化出的叢生苗較小但長勢(shì)好，此外氨芐青霉素也能有效抑制細(xì)菌生長。因此，較高濃度的氨芐青霉素也可以作為金發(fā)草遺傳轉(zhuǎn)化體系中的抑菌劑。

表 3　頭孢噻呋鈉和氨芐青霉素對(duì)金發(fā)草愈傷組織生長分化的影響

注：Cef表示頭孢噻呋鈉，Amp表示氨芐青霉素；分化率數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，且數(shù)據(jù)后的不同大寫字母表示處理間在0.01水平有顯著差異。

Note: Cef represents Ceftiofur sodium, Amp represents Ampicillin; Data of differentiation rate are expressed as mean ± SD, the different uppercases behind the data represent significant differences among treatments at the level of 0.01.

3　討論與結(jié)論

在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物高效遺傳轉(zhuǎn)化體系中，選擇合適的抗性篩選劑和抑菌劑是至關(guān)重要的(王關(guān)林和方宏篤，2002)。然而，所選擇抗生素種類和濃度因植物受體材料的不同而有所差異?？剐院Y選劑是與轉(zhuǎn)化所用載體中的抗性基因有關(guān)，nptⅡ基因以其生物安全性好且易于篩選而廣泛用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化研究中(王紫萱和易自力，2003)。然而，不同植物受體材料對(duì)卡那霉素的敏感程度不盡相同。如Jin et al(2006)在建立苜蓿愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化體系時(shí)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用50 mg·L-1的卡那霉素時(shí)，轉(zhuǎn)化頻率達(dá)到最高。邢文超等(2006)發(fā)現(xiàn)薰衣草對(duì)卡那霉素很敏感；6 mg·L-1的卡那霉素導(dǎo)致薰衣草不能誘導(dǎo)出愈傷；10 mg·L-1的卡那霉素致使薰衣草外植體黃化甚至死亡。常用的抗性篩選劑有卡那霉素和潮霉素。本研究發(fā)現(xiàn)卡那霉素和潮霉素對(duì)金發(fā)草愈傷組織均有較強(qiáng)的抑制作用，但潮霉素對(duì)金發(fā)草愈傷組織的毒害太大，甚至直接褐化死亡。當(dāng)潮霉素濃度達(dá)到100 mg·L-1時(shí)，大部分愈傷死亡，而存活的愈傷塊表面變綠。這與老芒麥對(duì)潮霉素的敏感性相似(李達(dá)旭等，2006)。因此，選擇卡那霉素作為金發(fā)草愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系中的抗性篩選劑。但抗性篩選劑的濃度不能太低也不能太高，太低會(huì)產(chǎn)生過多的假陽性植株，太高會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生毒害(王關(guān)林和方宏篤，2002，王相春等，2011)。因此，15 mg·L-1的卡那霉素適合作為金發(fā)草遺傳轉(zhuǎn)化的抗性篩選劑。

在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系中，外植體與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)之后，需要清洗外植體上附著的農(nóng)桿菌，同時(shí)為抑制農(nóng)桿菌的繁殖，必須在篩選培養(yǎng)基中加入抑菌劑(徐淑紅和徐香玲，2004；Wu et al，2005)。但是，抑菌劑在對(duì)農(nóng)桿菌生長起抑制作用的同時(shí)，也會(huì)對(duì)植物受體材料的生長分化產(chǎn)生影響。因此，有必要對(duì)抑菌劑進(jìn)行敏感性實(shí)驗(yàn)，以便找出抑菌效果好而對(duì)植物受體材料生長與分化的影響最小的抗生素并確定其適宜濃度。由于頭孢噻呋鈉與生長素2,4-D和NAA等有相類似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，因此頭孢噻呋鈉在植物組織培養(yǎng)中具有激素效應(yīng)，低濃度能促進(jìn)植物愈傷組織的分化與生長，但濃度過大會(huì)對(duì)植物組織有一定的副作用(詹立平等，2004)。本研究中發(fā)現(xiàn)高濃度的頭孢噻呋鈉(1 000 mg·L-1)對(duì)金發(fā)草愈傷組織毒害較大，會(huì)影響轉(zhuǎn)基因植株的再生，不適宜做抑菌劑。但是，300 mg·L-1的頭孢噻呋鈉能有效抑制農(nóng)桿菌的生長且對(duì)金發(fā)草愈傷組織影響很小。而且Li et al(2015)發(fā)現(xiàn)300 mg·L-1的頭孢噻呋鈉能夠有效抑制雜菌的生長，因此，可以作為金發(fā)草愈傷組織遺傳的轉(zhuǎn)化體系中的抑菌劑。與頭孢噻呋鈉相比，金發(fā)草愈傷對(duì)氨芐青霉素的敏感性較弱。當(dāng)氨芐青霉素濃度為500 mg·L-1時(shí)，對(duì)金發(fā)草愈傷組織的生長分化基本無影響，分化生的叢生苗生長良好。這和吳關(guān)庭等(2005)的抗生素對(duì)高羊茅的研究結(jié)果一致。較高濃度的氨芐青霉素對(duì)金發(fā)草愈傷組織的影響也很小，可以作為金發(fā)草愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系中的抑菌劑。

總之，本研究比較分析了卡那霉素、潮霉素、頭孢噻呋鈉和氨芐青霉素對(duì)金發(fā)草愈傷組織生長分化的影響，成功確定了15 mg·L-1的卡那霉素適合作為金發(fā)草愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系中的抗性篩選劑；300 mg·L-1頭孢霉素和較高濃度的氨芐青霉素均適合作為金發(fā)草愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系中的抑菌劑。這為金發(fā)草的遺傳改良及功能性基因的研究奠定了基礎(chǔ)。

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Effects of different antibiotics on callus differentiation and growth ofPogonatherumpaniceum

GENG Tian-Long, LI Fo-Sheng, YU Min, LUO Feng-Xue, TANG Lin，WANG Sheng-Hua*

( College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610064, China )

In the study,Pogonatherumpaniceumcalluses were selected as the experimental materials, and the effects of different kinds of antibiotics (kanamycin, hygromycin, ceftiofur sodium and ampicillin) and its concentrations to the growth and differentiations ofP.paniceumcalluses were compared and analysed in order to find out the suitable resistance selection agent and antibacterial agent in genetic transformation system ofP.paniceum, respectively. The results were as follows: (1)P.paniceumcallus had a strong sensitivity to kanamycin and the differentiation rate significantly decreased as the concentration of kanamycin increased (P=0.01). When the concentration of kanamycin was 10 mg·L-1, the growth and differentiation ofP.paniceumcallus were significantly suppressed and differentiated a large number of whiten seedlings, but the differentiation rate was still at 36.56%. When the concentration of kanamycin was 15 mg·L-1, differentiation rate ofP.paniceumcallus was at 11.94%, and only part of calluses were differentiated into green seedlings. However, when the concentration of kanamycin was 20 mg·L-1,P.paniceumcallus almost turn brown or dead, and the differentiation rate was only at 2.26%. Hence, 15 mg·L-1of kanamycin was fit for serveing as the resistance selection agent in genetic transformation system ofP.paniceum. (2)P.paniceumcallus had a less strong sensitivity to hygromycin than kanamycin. The effects of hygromycin on differentiation rate ofP.paniceumcallus was very small, but the toxicity was big, so hygromycin was not suitable as the resistance selection agent in genetic transformation system ofP.paniceum. (3) 300 mg·L-1of ceftiofur sodium and ampicillin had a little effect on the growth and differentiation ofP.paniceumcallus, and all were able to inhibit the bacterials effectively. Morever, the inhibition of little higher level of ampicillin to the growth and differentiation ofP.paniceumcallus was less obvious. Therefore, 300 mg·L-1of ceftiofur sodium and little higher level of ampicillin could be used as the antibacterial agent in genetic transformation system ofP.paniceumas well. This study found out the suitable kinds and concentration of antibiotics served as the resistance selection agent and the antibacterial agent inAgrobacteriumtumefaciensmediated genetic transformation system ofP.paniceum, respectively, which provides the reference for studing genetic improvement and functional genes ofP.paniceum.

Pogonatherumpaniceum, callus, antibiotics, genetic transformation, resistance selection agent, antibacterial agent

10.11931/guihaia.gxzw201512019

2016-02-01

2016-04-28

國家自然科學(xué)基金(31270360) [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31270360)]。

耿天龍(1988-)，男，河北衡水人，碩士研究生，主要從事植物生理與分子生物學(xué)研究，(E-mail)tianlong_geng@126.com。

王勝華，博士，教授，主要從事植物生殖與發(fā)育等研究，(E-mail)shwang200@aliyun.com.cn。

Q943.1

A

1000-3142(2016)10-1238-08

耿天龍，李佛生，于敏，等. 不同抗生素對(duì)金發(fā)草愈傷組織生長分化的影響 [J]. 廣西植物，2016，36(10):1238-1244

GENG TL, LI FS, YU M, et al. Effects of different antibiotics on callus differentiation and growth ofPogonatherumpaniceum[J]. Guihaia，2016，36(10):1238-1244