石文波　彭曉朋　冉瑞智　張芳　幸茂輝

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血清INTS6P1作為肝細(xì)胞癌疾病篩查新型標(biāo)志物的可行性研究

石文波彭曉朋冉瑞智張芳幸茂輝

目的探討血清中整合因子復(fù)合體亞基6假基因1(INTS6P1)作為肝細(xì)胞癌患者疾病篩查新型標(biāo)志物的可行性。方法采用Northern雜交方法檢測(cè)33例肝細(xì)胞癌患者腫瘤組織及臨近肺腫瘤組織中INTS6P1的表達(dá)情況，通過(guò)細(xì)胞試驗(yàn)檢測(cè)INTS6P1在細(xì)胞培養(yǎng)上清和胞內(nèi)表達(dá)情況，最后檢測(cè)INTS6P1在100例患者體內(nèi)的表達(dá)情況。結(jié)果與臨床非腫瘤組織相比，33例肝細(xì)胞癌患者腫瘤組織中的INTS6P1表達(dá)量顯著降低(P=0.0066)。血清檢測(cè)結(jié)果表明，肝細(xì)胞癌患者血清中INTS6P1表達(dá)水平顯著低于非肝細(xì)胞癌患者(P<0.01)。此外，曲線下面積-ROC曲線分析表明，血清-AFP含量低于20 ng/ml時(shí)INTS6P1可以作為肝細(xì)胞癌患者疾病篩查的診斷標(biāo)志物(P<0.05)。結(jié)論血清INTS6P1可以作為肝細(xì)胞癌疾病篩查新型標(biāo)志物，將該標(biāo)志物納入檢測(cè)能提高肝細(xì)胞癌臨床診斷的準(zhǔn)確率。

假基因;整合因子復(fù)合體亞基6假基因1;肝細(xì)胞癌;血清標(biāo)志物

肝細(xì)胞癌(HCC)是全球第5大常見(jiàn)癌癥，其特點(diǎn)為高遷移率和高復(fù)發(fā)率，且患者往往預(yù)后不良[1,2]。肝切除術(shù)是該疾病臨床首選治療方法[3]。由于HCC患者的早期診斷和篩查缺乏，患者往往錯(cuò)失最佳的手術(shù)治療時(shí)機(jī)，導(dǎo)致臨床療效不甚理想[4]。國(guó)內(nèi)慢性肝炎和HBV感染引起的肝硬化是引發(fā)HCC的主要原因。有報(bào)道表明，慢性HBV感染引發(fā)的HCC占總數(shù)的10%～25%[5-7]。由HBV感染導(dǎo)致的HCC患者能夠通過(guò)早期診斷進(jìn)而改善臨床治療效果。血清標(biāo)志物檢測(cè)(AFP，AFP-L3，AFU和GPC3)和影像學(xué)檢查(超聲，CT和MRI)常用于HCC高危人群的疾病檢查[8，9]。血清AFP含量是目前HCC患者疾病診斷的最常用標(biāo)志物，其缺點(diǎn)在于靈敏性(36%～64%)和特異性(79%～91%)均較低[10]。AFP在非HCC患者體內(nèi)也會(huì)出現(xiàn)升高，例如慢性肝炎、肝硬化、妊娠12周孕婦和生殖系統(tǒng)腫瘤等[11]。由于經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、操作簡(jiǎn)單，影像學(xué)檢查是HCC患者疾病早期診斷的理想選擇，然而，上述方法對(duì)病灶直徑小于3 cm的腫瘤檢出能力有限[12]。CT和MRI的檢測(cè)靈敏性和特異性較高，且目前是HCC患者臨床檢查的常規(guī)方法[13]。但是該方法的缺點(diǎn)在于價(jià)格較為昂貴，并不能成為所有患者臨床篩查和治療的常規(guī)手段。上述因素的綜合作用導(dǎo)致HCC的臨床早期篩查結(jié)果不理想。需要尋找一種HCC特異性和準(zhǔn)確性均較高的生物標(biāo)志物以改善當(dāng)前早期HCC檢測(cè)所遇瓶頸。本研究探討血清中INTS6P1作為肝細(xì)胞癌患者疾病篩查新型標(biāo)志物的可行性。

1　材料與方法

1.1臨床組織與血液樣品本研究的臨床樣品均采集自湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院和中國(guó)人民解放軍第302醫(yī)院2013至2015年治療的肝細(xì)胞癌患者。該研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，且患者均知情。肝細(xì)胞癌組織樣品和相應(yīng)的臨床肺腫瘤組織采集自芯片檢測(cè)lncRNA 陽(yáng)性的肝細(xì)胞患者。血液樣品100例，HCC患者50例，慢性HBV感染患者20例，健康人群30例。血清樣品采集時(shí)間為HCC患者手術(shù)治療前7 d。新鮮組織樣品在術(shù)后30 min內(nèi)-80℃冷凍，直至本研究檢測(cè)。所有患者為新發(fā)HCC，且未接受任何干預(yù)治療?；颊叩拇_診和腫瘤分期均由病理學(xué)專家完成。

1.2細(xì)胞系HCC細(xì)胞系(Hep3B，HepG2，Huh7，MHCC97L和MHCC97H)及正常人肝臟細(xì)胞系HL-7702均購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心，培養(yǎng)方法為含10% FBS(Gibco，Invitrogen，USA)、100 U/ml青霉素和DMEM培養(yǎng)基(Gibco，Invitrogen，USA)，5% CO2，37℃培養(yǎng)。

1.3樣品處理及血清總RNA提取采用EDTA血液采集管采集患者全血，4℃，1 200 g離心15 min，去除細(xì)胞。收集上清于微量離心管內(nèi)，4℃，12 000 g離心15 min，完全去除細(xì)胞碎片。血清置于-80℃保持備用。采用LS TRIzol(Invitrogen，USA)試劑盒根據(jù)說(shuō)明書(shū)提取血清RNA，HCC樣品的細(xì)胞系總RNA采用TRIzol試劑(Invitrogen，USA)提取。

1.4Northern blot采用TRIzol試劑提取HCC細(xì)胞系(Hep3B，HepG2，Hun7，MHCC97L和MHCC97H)和正常人源肝細(xì)胞HL-7702，向凝膠中加入20 μg RNA樣品。Northern blot檢測(cè)時(shí)，lncRNA(INTS6P1)探針序列為5’-ATATGAATTCGAGGAGACAGGTATATGCT-3’，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH，內(nèi)參)探針序列為5’-CTGATGCCCCCATGTTCGT CATGGGTGTGA-3’。

1.5HCC組織和血液樣本INTS6P1含量qRT-PCR檢測(cè)采用Prime Script反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，大連)對(duì)每個(gè)樣品的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。定量PCR總體積15 μl，包括3 μl cDNA模板，以GAPDH為內(nèi)參。采用Light Cycler 480 SYBR Green I Master(羅氏)試劑進(jìn)行定量擴(kuò)增。采用羅氏公司的LC480型定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。通過(guò)2-ΔΔct計(jì)算INTS6P1的相對(duì)表達(dá)水平。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件，組織、細(xì)胞和血清間的lncRNA表達(dá)水平采用雙尾t檢驗(yàn)、Wilcoxon分析和Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)ROC曲線制圖檢測(cè)腫瘤患者血液樣品與健康血液樣品間INTS6P1表達(dá)水平的差異。

2　結(jié)果

2.1HCC組織與臨近非腫瘤組織lncRNAs芯片檢測(cè)結(jié)果為驗(yàn)證lncRNAs在HCC組織中表達(dá)失調(diào)，本研究采用芯片方法檢測(cè)HCC腫瘤組織和臨床非腫瘤組織中l(wèi)ncRNAs表達(dá)情況。臨床非腫瘤組織INTS6P1水平為(2.65±1.32)，HCC患者腫瘤中INTS6P1表達(dá)水平為(1.68±1.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.015)。

2.2INTS6P1在HCC組織及正常肝臟組織中表達(dá)情況為進(jìn)一步驗(yàn)證芯片檢測(cè)結(jié)果，本研究采用定量PCR方法檢測(cè)33例HCC患者腫瘤組織和33例正常肝臟組織樣品中INTS6P1表達(dá)情況，與正常組比較，HCC組織中INTS6P1表達(dá)下調(diào)比例為78.8%(26/33)。33對(duì)樣本檢測(cè)結(jié)果表明，INTS6P1表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0066)。見(jiàn)圖1。

圖1　33對(duì)腫瘤-正常肝細(xì)胞INTS6P1定量檢測(cè)結(jié)果

2.3HCC細(xì)胞及HL-7702細(xì)胞培養(yǎng)基中INTS6P1表達(dá)檢測(cè)為檢測(cè)INTS6P1的來(lái)源，本研究檢測(cè)了lncRNA-INTS6P1是否存在于細(xì)胞培養(yǎng)上清中。我們選擇6株肝細(xì)胞系，包括正常肝細(xì)胞(HL-7702)和5株人HCC細(xì)胞系(HepG2，Hep3B，Huh7，MHCC97L和MHCC97H)。收集細(xì)胞傳代后第1、2、3天的細(xì)胞培養(yǎng)上清。取上清的總RNA。收集上清后，采用qRT-PCR和northern blot檢測(cè)6株細(xì)胞中INTS6P1表達(dá)情況。均檢測(cè)到INTS6P1表達(dá)，且其表達(dá)量隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加。正常肝臟細(xì)胞中INTS6P1表達(dá)情況與HCC細(xì)胞系不同。見(jiàn)圖2～5。

2.4肝切除術(shù)前后患者血清中INTS6P1表達(dá)情況比較為進(jìn)一步探究導(dǎo)致HCC患者INTS6P1表達(dá)下降的原因，采集8例肝臟切除術(shù)治療的HCC患者術(shù)前和術(shù)后1個(gè)月血液?；颊咝g(shù)后血液中INTS6P1表達(dá)量顯著高于術(shù)前(P=0.022)?；颊呓邮芨闻K切除術(shù)治療后血清中仍能檢測(cè)到AFP。患者術(shù)后AFP與術(shù)前相比顯著下降(P=0.0078)。見(jiàn)圖6、7。

圖2　細(xì)胞培養(yǎng)上清中LncRNA-INTS6P1表達(dá)情況

圖3　northern blot方法檢測(cè)不同細(xì)胞系中INTS6P1表達(dá)情況

圖4　northern blot灰度掃描和量化結(jié)果

圖5　qRT-PCR方法檢測(cè)不同肝細(xì)胞系中INTS6P1表達(dá)情況

圖6肝臟切除術(shù)治療前后患者血漿中INTS6P1表達(dá)量比較(Wilcoxon檢驗(yàn))

圖7肝臟切除術(shù)治療前后患者血漿中AFP表達(dá)量比較(Wilcoxon檢驗(yàn))

2.5血清INTS6P1表達(dá)作為疾病篩查研究為驗(yàn)證采用外周血中INTS6P1檢測(cè)作為HCC患者疾病篩查的新型標(biāo)志物的可行性。我們采用qRT-PCR方法檢測(cè)50例HBsAg陽(yáng)性HCC患者的血清樣品，20例HBV感染患者血清樣品和30例健康人群血清樣品(AFP<10 ng/ml，HBsAg陰性)。HCC患者的臨床病理學(xué)特征。與健康人群(P=0.04)和非HCC患者(P=0.03)相比，HCC患者的INTS6P1表達(dá)顯著下降。此外，也比較了INTS6P1在慢性HBV感染和健康人群中的表達(dá)情況，前者顯著低于后者(P=0.0458)。見(jiàn)表1，圖8。

2.6血清AFP和INTS6P1的診斷價(jià)值為檢測(cè)INTS6P1對(duì)疾病診斷的價(jià)值，本研究采用AUC-ROC分析血清AFP和血清INTS6P1。二者的診斷價(jià)值。結(jié)果表明，在血清AFP含量低于20 ng/ml時(shí)，INTS6P1(AUC-ROC，0.867，P<0.05)的臨床診斷價(jià)值高于AFP(AUC-ROC，0.855，P<0.05)。見(jiàn)表2,圖9。

表1　HCC患者的臨床病理學(xué)特征　例

圖8　3組INTS6P1表達(dá)情況比較

3　討論

近年來(lái)，高度穩(wěn)定的游離DNA(cfCNA)，包括RNA和DNA，均在人類的血液、血清和尿液中檢測(cè)到。研究表明，cfCNA與多種疾病相關(guān)，特別是腫瘤性疾病[14]。隨著基因測(cè)序和表觀遺傳學(xué)的不斷發(fā)展，已經(jīng)衍生出關(guān)于研究非編碼RNAs(ncRNAs)的學(xué)科。長(zhǎng)非編碼RNAs(lncRNAs)已經(jīng)被廣泛發(fā)現(xiàn)和報(bào)道，其長(zhǎng)度一般在200～10 000 nt[15]，參與多種腫瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)途徑[16]。假基因是IncRNAs的一種。其結(jié)構(gòu)與親本蛋白編碼基因相似。HULC，是首個(gè)在HCC中發(fā)現(xiàn)的lncRNA，在Hep3B細(xì)胞中通過(guò)調(diào)節(jié)CREB轉(zhuǎn)錄因子，導(dǎo)致HULC表達(dá)顯著上調(diào)[17,18]，在HCC組織中HULC的表達(dá)水平與HBx陽(yáng)性密切相關(guān)。此外，越來(lái)越多的報(bào)道表明，HCC組織中l(wèi)ncRNAs表達(dá)失調(diào)[19,20]，這一現(xiàn)象與腫瘤轉(zhuǎn)移、篩查、診斷或腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)[21]。有研究表明，整合因子復(fù)合體亞基6假基因1(INTS6P1)是一種HCC腫瘤抑制基因，其通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(ceRNA)上調(diào)相應(yīng)的腫瘤抑制同源基因INTS6，進(jìn)而抑制HCC生長(zhǎng)[22]。因此，INTS6P1具有作為HCC患者臨床疾病診斷標(biāo)志物的潛力。

表2　血清AFP和INTS6P1診斷價(jià)值

圖9血清AFP含量低于20 ng/ml時(shí)AFP和INTS6P1用于疾病診斷比較

cfCNA是腫瘤診斷和篩查的潛在生物標(biāo)志物。盡管報(bào)道表明許多與mRNA和microRNA類似的cfCNA是許多腫瘤檢測(cè)的標(biāo)志物[14,23]，關(guān)于假基因的報(bào)道很少。Peng等[22]研究表明，INTS6P1能抑制HCC細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移，并能促進(jìn)其凋亡。其機(jī)制是INTS6P1 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合HCC癌基因miR-17-5p轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)INTS6表達(dá)。本研究進(jìn)一步探討INTS6P1在HCC患者臨床中的應(yīng)用。

芯片檢測(cè)結(jié)果表明，我們?cè)贖CC組織中檢測(cè)到大量的假基因INTS6P1。本研究進(jìn)一步比較HCC與正常肝臟組織中INTS6P1 表達(dá)水平，表明HCC中表達(dá)顯著下調(diào)78.8%。細(xì)胞和血清檢測(cè)結(jié)果表明，INTS6P1在患者的組織和血清中均有表達(dá)。與非HCC患者相比，HCC患者血清中INTS6P1表達(dá)水平顯著下降，表明INTS6P1在正常人體內(nèi)表達(dá)水平更高更穩(wěn)定。

部分研究表明，腫瘤細(xì)胞能分泌miniRNA到細(xì)胞外，并進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)[24]。HCC細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，與正常肝臟細(xì)胞相比，不僅胞內(nèi)INTS6P1表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞培養(yǎng)上清中的INTS6P1表達(dá)也相應(yīng)下降。此外，HCC患者肝臟切除術(shù)治療前后的血清INTS6P1表達(dá)情況檢測(cè)結(jié)果表明，術(shù)后INTS6P1表達(dá)量較術(shù)前有顯著升高。綜合組織和細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果，我們認(rèn)為腫瘤細(xì)胞能抑制INTS6P1表達(dá)。表明與正常肝臟細(xì)胞相比HCC細(xì)胞分泌INTS6P1 假基因到細(xì)胞外顯著降低。鑒于HCC患者與非HCC患者血清中INTS6P1表達(dá)量的不同，可以采用INTS6P1作為該疾病診斷的標(biāo)志物。

lncRNA 的表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[25]。檢測(cè)血清中l(wèi)ncRNA表達(dá)水平作為疾病診斷手段，其結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。本研究中報(bào)道了假基因INTS6P1，證實(shí)其在HCC中表達(dá)被抑制，其通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(ceRNA)上調(diào)相應(yīng)的腫瘤抑制同源基因INTS6，進(jìn)而抑制HCC生長(zhǎng)。AUC-ROC 分析結(jié)果表明，在血清AFP含量低于20 ng/ml時(shí)，INTS6P1(AUC-ROC，0.867，P<0.05)的臨床診斷價(jià)值高于AFP(AUC-ROC，0.855，P<0.05)。臨床上HCC患者聯(lián)合采用AFP和INTS6P1進(jìn)行檢測(cè)能提高診斷的靈敏性，從而能顯著改善HCC患者篩查的結(jié)果。本研究還發(fā)現(xiàn)慢性HBV感染患者的INTS6P1表達(dá)量高于HCC患者，同時(shí)又低于正常人群。根據(jù)這個(gè)結(jié)果，我們認(rèn)為可以通過(guò)INTS6P1表達(dá)檢測(cè)進(jìn)行HBV感染患者轉(zhuǎn)為HCC的早期篩查?？梢酝ㄟ^(guò)該標(biāo)志物的檢測(cè)為HBV患者疾病的治療方案的制定提供重要依據(jù)。

目前，尚沒(méi)有一種生物標(biāo)志物能替代AFP作為HCC的臨床診斷。然而由于AFP檢測(cè)存在高靈敏性和低特異性的問(wèn)題，開(kāi)發(fā)一種輔助檢測(cè)方法十分必要。本研究結(jié)果表明，血清INTS6P1假基因可以作為HCC患者早期篩查的新型非侵襲性生物標(biāo)志物。

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The feasibility study on serum INTS6P1 as an novel marker for screening hepatocellular carcinoma

SHIWenbo*,PENGXiaopeng,RANRuizhi*,etal.

*DepartmentofOncology,EnshiCentralHospital,EnshiTujianationalityandMiaonationalityAutonomousPrefecture,Hubei,Enshi445000,China

ObjectiveTo investigate the feasibility of pseudogene integrator complex subunit 6 pseudogene 1 (INTS6P1) in serum as an novel marker to screen hepatocellular carcinoma (HCC). MethodsThe expression levels of INTS6P1 were detected by Northern hybridization method in 33 cases of hepatocellular carcinoma tissues and adjacent normal liver tissues.Moreover the expressions of INTS6P1 in supernatant of cell culture were measured by means of cell culture in vitro, besides, the expression levels of INTS6P1 were detected in 100 patients with HCC in vivo.ResultsAs compared with those in adjacent normal liver tissues,the expression levels of INTS6P1 in 33 cases of hepatocellular carcinoma tissues were significantly decreased (P<0.01). The expression levels of INTS6P1 in serum of patients with HCC were significantly lower than those of patients with non-HCC (P<0.01). In addition, the AUC-ROC curve analysis showed that when the serum levels of AFP were lower than 20ng/ml, INTS6P1 could be regarded as a diagnostic marker for screening hepatocellular carcinoma (P<0.05).ConclusionThe serum INTS6P1 can be regarded as an novel marker for screening hepatocellular carcinoma,moreover,the detection of serum INTS6P1 can increase the accuracy of clinical diagnosis of HCC.

pseudogene;INTS6P1;hepatocellular carcinoma;serum markers

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.21.002

445000湖北省恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院腫瘤Ⅱ科(石文波、冉瑞智、張芳、幸茂輝)；中國(guó)人民解放軍第302醫(yī)院肝癌病區(qū)組腫瘤科(彭曉朋)

R 735.7

A

1002-7386(2016)21-3209-05

2016-04-05)