李會英　李國興　崔佳　劉哲敏　杜寧　劉學聰　喬玉巧

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·論著·

黃芩苷對牙周炎大鼠牙齦組織及外周血中IL-1β表達的影響

李會英李國興崔佳劉哲敏杜寧劉學聰喬玉巧

目的采用大腸桿菌脂多糖誘導大鼠牙周炎模型，觀察黃芩苷對牙周炎大鼠牙齦組織及外周血中白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)表達水平的影響。方法選用50只8周齡SD大鼠，隨機分成5組，每組10只，A組為對照組，B組為牙周炎組，C1、C2、C3組為黃芩苷治療組，治療1周后處死大鼠采取其外周血及牙齦組織，采用微量樣本多重蛋白定量技術(shù)(CBA)檢測外周血中IL-1β含量，采用RT-PCR法檢測大鼠牙齦組織中IL-1βmRNA的表達水平。結(jié)果B組大鼠牙齦組織中IL-1βmRNA及外周血中IL-1β表達含量均明顯高于A組(P<0.05)，C1、C2、C3組大鼠牙齦組織中IL-1βmRNA和外周血中IL-1β表達含量均明顯低于B組(P<0.05)。結(jié)論黃芩苷可以降低牙周炎大鼠牙齦組織中IL-1βmRNA和外周血中IL-1β表達水平，抑制脂多糖對大鼠牙周組織的損傷作用。

黃芩苷；牙周炎； 白介素-1β；大鼠

牙周炎的主要致病菌為革蘭陰性厭氧菌，其細胞壁中的主要毒性成分脂多糖(LPS)可抑制牙周組織細胞的生長和繁殖，又可激活宿主防御細胞釋放多種炎性細胞因子(如 TNF-α、IL-1β和 IL-6等)介導炎性反應，導致牙周組織的損傷。黃芩是我國傳統(tǒng)中藥，其有效成分黃芩苷具有抑菌、清熱、抗炎、抗變態(tài)反應等藥理活性，可以顯著增加和促進牙齦成纖維細胞的增殖活性和膠原蛋白的合成[1]。本實驗通過局部應用黃芩苷治療大鼠牙周炎，采用RT-PCR法檢測大鼠牙齦組織IL-1βmRNA表達含量，采用微量樣本多重蛋白定量技術(shù)(CBA)檢測大鼠外周血中 IL-1β表達含量，觀察其變化狀況，探討黃芩苷治療牙周炎的作用。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物：SD大鼠50只，清潔級，8周齡，雄性，體重(220±20)g，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供(動物合格證號：1410084)。大鼠適應環(huán)境1周后進行實驗。喂飼實驗動物中心的標準動物飼料，自由攝取水和食物。

1.1.2主要藥品與儀器：大腸桿菌ATCC O55:B5的脂多糖 (美國，sigma公司)，黃芩苷(中國藥物生物制品檢定所)大鼠IL-1β檢測試劑盒(美國BD公司)?？俁NA提取試劑TRIzol Reagent(GIBCOBRL公司,美國)；逆轉(zhuǎn)錄試劑與PCR試劑SYBR PrimeScript RT-PCR Kit (TaKaRa公司，日本)；IL-1β及GADPH引物(上海生工生物工程有限公司)；Kodak_1DDC_120電泳凝膠成像自動分析系統(tǒng)(Kodak公司,美國)；7500熒光定量PCR儀(AB公司；美國)；流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2實驗方法

1.2.1溶液的配制：取2 mg黃芩苷溶于2 ml 0.9%氯化鈉溶液中，碳酸氫鈉調(diào)pH值至7.4，至黃芩苷完全溶解，成為1 mg/ml的儲存液，4℃保存?zhèn)溆茫囼灂r用0.9%氯化鈉溶液稀釋至所需濃度；取10 mg脂多糖(LPS)，用0.9%氯化鈉溶液稀釋至1 mg/ml的溶液。LPS的終末濃度為1 mg/ml，黃芩苷終末濃度為0.01、0.1、1.0 μg/ml。

1.2.2動物分組及牙周炎模型的建立：取SD大鼠50只，隨機分5組：對照組(A組)、牙周炎組 (B組)、黃芩苷治療組(C1、C2、C3組)，每組10只。除A組外，其余4組大鼠用10%水合氯醛(0.3 g/kg)腹腔注射麻醉成功后，選大鼠右上頜第1、2磨牙之間頰腭側(cè)齦溝底注射LPS(1 mg/ml)各0.2 ml，每天在同一部位重復1次，連續(xù)3 d，1周后大鼠牙周炎模型建立。

1.2.3黃芩苷的局部治療：大鼠牙周炎模型建立后第2天開始用藥，A組不用藥，黃芩苷治療組(C1、C2、C3組)每天在大鼠右上頜第1、2磨牙之間頰腭側(cè)齦溝底分別注射0.01、0.1、1.0 μg/ml黃芩苷溶液各0.2 ml，B組注射等量0.9%氯化鈉溶液，均連續(xù)3 d，分籠飼養(yǎng)。用藥前、后分別觀察5組大鼠牙周組織、全身狀況、毛發(fā)、食欲及糞便情況。

1.2.4動物處死及標本采集：用藥后第7天，10%水合氯醛腹腔注射麻醉成功后，于腹主動脈取血5 ml，3 500 r/min離心，取上清液，-70℃冰箱保存，用于外周血IL-1β的檢測；取頸椎脫臼法處死5組大鼠，5 min 內(nèi)取其右上頜第1、2磨牙頰腭側(cè)實驗處新鮮牙齦組織放置于eppendorf管中，液氮驟冷后，-70℃冰箱保存，用于牙齦組織IL-1βmRNA的檢測；剪取其右上頜、牙、牙槽骨及牙周組織，0.9%氯化鈉溶液沖洗后置于10%甲醛固定、10%EDTA脫鈣、包埋，制作右上頜磨牙頰腭向石蠟切片，片厚5 μm，蘇木精-伊紅染色，于光學顯微鏡下觀察牙槽骨吸收及牙周袋形成情況。

1.2.5RT_PCR檢測大鼠牙齦組織中IL-1β mRNA的表達水平：①提取RNA 將牙齦標本復融，取0.1 g粉碎至勻漿狀，加入1 ml RNA裂解液吹打均勻，加入200 μl氯仿混勻，13 000 r/min 4℃離心15 min。取上清加入500 μl異戊醇，-30℃放置12 h，離心同上。棄上清，加75%乙醇200 μl洗滌，再次離心同上，棄上清得白色沉淀，加入50 μl聚碳酸二乙酯(diethlpyrocarbonate，DEPC)，置-20℃冰箱備用。采用紫外分光光度計測定RNA純度。②逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 取1 μl IL-1β RNA，2×緩沖液(buffer)5 μl，2 mmol/L MgSO42 μl，10 mmol/L脫氧核苷三磷酸(dNTPs )0.5 μl，40 U/μl RNA酶抑制劑(RNase Inhibitor)0.25 μl，逆轉(zhuǎn)錄酶(Bca_Best polymerase)0.5 μl，寡脫氧胸苷酸(OligodT)0.5 μl，以雙蒸水補足反應體積至10 μl，操作嚴格按試劑盒說明書進行。③PCR擴增 PCR反應體系為20 μl，其中包括SYBR Premix Ex TaqTM(2×)10 μl，Rox Reference DyeⅡ(50×)0.4 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μl，cDNA模板2 μl及dH2O 6.8 μl。置于7500 real-time PCR儀上，兩步法PCR擴增，擴增程序為：第1步預變性：95℃ 30 s；第2步 PCR反應：95℃ 5 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳驗證。以 GAPDH 作為內(nèi)參照。引物序列見表1。

表1　基因引物的堿基序列

1.2.6流式液相多重蛋白定量技術(shù)(CBA)檢測外周血中IL-1β的含量：將已分離的血清上清液標本從冰箱取出置于室溫下，待溶解后采用CBA技術(shù)通過流式細胞儀(美國BD公司)檢測血漿中IL-1β的含量，具體按試劑盒說明書操作。

2　結(jié)果

2.1實驗動物一般情況A組大鼠牙齦組織無充血腫脹，無牙周袋，神態(tài)、活動正常，毛澤光亮，飲食、飲水、大便正常，體重逐漸增加。B組大鼠于第 3 次注射LPS后出現(xiàn)牙齦組織充血腫脹，觸之易出血，牙周袋形成，探診深度4～5 mm，神態(tài)倦怠、活動笨拙、皮毛無光澤、進食水減少、大便干燥，體重增加不明顯，B組注射0.9%氯化鈉溶液后牙齦仍然紅腫，牙周袋深度4～5 mm，神態(tài)倦怠、活動笨拙、皮毛無光澤、進食水減少、大便干燥等癥狀無明顯改善，而C1、C2、C3組隨著注射黃芩苷后，上述癥狀逐漸改善，牙齦組織充血減輕，牙周袋變淺，神態(tài)趨于正常，皮毛光澤改善，進食、活動增多，體重逐漸增加，并且C3組效果最明顯。

2.2牙齦組織病理變化A組牙齦上皮和上皮下結(jié)締組織無病理性改變，牙周膜纖維排列整齊，牙槽骨表面光滑，無明顯骨吸收、破骨細胞和骨吸收陷窩形成。B組牙間乳頭溝內(nèi)上皮潰瘍、壞死、牙周袋形成，牙周膜炎性細胞浸潤明顯，纖維排列紊亂，牙槽嵴表面呈蠶食狀，吸收明顯，牙槽骨內(nèi)骨質(zhì)疏松，破骨細胞和骨吸收陷窩明顯可見。黃芩苷治療組(C1、C2、C3組)牙周組織表現(xiàn)較牙周炎組好轉(zhuǎn)，炎性細胞逐漸減少，成纖維性細胞逐漸增多，牙周間隙逐漸正常，牙周膜及牙槽骨結(jié)構(gòu)比較正常，牙周膜主纖維束排列較整齊，固有層血管擴張及淋巴細胞滲出逐漸減輕，破骨細胞浸潤減少。見圖1。

A組B組C1組C2組C3組

圖15組牙周組織形態(tài) (HE ×10)

2.3黃芩苷對大鼠牙齦組織IL-1βmRNA表達的影響B(tài)組大鼠牙齦組織中IL-1βmRNA表達水平(即相對含量)較A組明顯升高(P<0.05)； C1、C2、C3組大鼠牙齦組織中IL-1βmRNA表達水平均較B組明顯降低(P<0.05)，且C1、C2、C3組大鼠牙齦組織中IL-1βmRNA表達水平依次逐漸下降(P<0.05)。提示牙周炎組大鼠牙齦組織中IL-1βmRNA的表達強度明顯高于正常對照組大鼠，用黃芩苷治療1周后,黃芩苷治療組大鼠牙齦組織IL-1βmRNA表達強度隨黃芩苷濃度增加依次逐漸下降。見表2。

2.4外周血中IL-1β含量表達B組大鼠外周血中IL-1β含量明顯高于A組(P<0.05)，而C1、C2、C3組IL-1β含量均較B組明顯降低(P<0.05)，且C1、C2、C3組的IL-1β含量逐漸下降。提示牙周炎組大鼠外周血IL-1β含量明顯增高，黃芩苷治療1周后,各治療組外周血中IL-1β含量隨黃芩苷濃度增加依次明顯下降。見表2。

　組別IL?1βmRNA(fold)IL?1β(pg/ml)A組27．45±9．221．00±0．00B組75．56±1．66?1．54±0．07?C1組64．43±2．11?#1．40±0．08?#C2組51．12±5．10?#1．26±0．06?#C3組39．67±4．95?#1．13±0．04?#F值38．4743．60P值4．82×10-62．69×10-6

注：與A組比較，*P<0.05;與B組比較，#P<0.05

3　討論

牙周病是由革蘭陰性(G-)細菌等引起一種以骨破壞為主要特征的慢性細菌感染性疾病，其中革蘭陰性厭氧菌及內(nèi)毒素刺激可引起宿主局部免疫細胞反應,從而激活宿主防御細胞釋放TNF-α、IL-1和 IL-6等多種炎性細胞因子，這些炎性細胞因子繼發(fā)引起牙齦組織炎癥、牙槽骨破壞和吸收等牙周組織損傷[2，3]。內(nèi)毒素是G-菌胞壁外膜中的LPS,是G-菌所獨有的一種致病物質(zhì),對牙周組織具有很高的毒性。LPS的化學組成在不同微生物之間有所不同，但其基本結(jié)構(gòu)相似。LPS的生物活性中心是類脂A，幾乎可介導所有LPS的所有生物學反應,各種G-菌類脂A的化學成分和結(jié)構(gòu)極其相似,是LPS結(jié)構(gòu)中最保守的部分,無種屬特異性,所以不同G-菌的LPS引起的毒性作用基本相似[4]。采用大腸桿菌LPS誘導的大鼠實驗牙周炎模型,簡便、可比性強，具有可重復性，已由SUNY Stony Brook動物用戶委員會認可[3]。本實驗采用大腸桿菌LPS進行實驗，連續(xù)3 d在大鼠右上頜磨牙同一部位的牙齦組織中注射LPS,1周后牙周袋形成,牙齦紅腫,探診出血。光鏡下顯示，炎性細胞聚集,破骨細胞浸潤,牙槽骨吸收。

IL-1是一種單核細胞因子，包括 IL-1α、IL-1β 及其受體拮抗劑等，可作用于機體的各個系統(tǒng)，具有廣泛的生物學活性，參與免疫調(diào)節(jié)、介導炎性反應和影響組織代謝。IL-1β主要功能是致炎作用，其生物學效應與牙周組織的破壞作用直接相關(guān)，是介導牙周炎癥的重要炎性細胞因子，可引起牙周結(jié)締組織損傷及牙槽骨吸收[5]。有研究發(fā)現(xiàn)IL-1β引起牙周組織破壞可通過以下途徑：IL-1β與TNF-α、前列腺E2(PGE2)協(xié)同作用引起骨吸收，抑制骨生成；IL-1β刺激牙齦成纖維細胞和牙周膜細胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶；IL-1β抑制人牙周韌帶成纖維細胞堿性磷酸酶基因的表達，影響組織恢復和骨性愈合；刺激纖溶酶原激活劑，導致纖溶酶增多，使基質(zhì)金屬蛋白酶的活性增強，引起牙周結(jié)締組織降解、牙周附著喪失；刺激成骨細胞、牙周膜細胞產(chǎn)生PGE2、IL-6等骨吸收強誘導劑，增強骨吸收[6-9]。另有研究表明， IL-1β可通過調(diào)節(jié)骨保護素(OPG)和 核因子因子κB受體活化劑配體(RANKL)的變化，引起牙槽骨吸收[10]；IL-1β可刺激牙周膜成纖維細胞分泌肝細胞生長因子，引起上皮細胞增殖并向根方遷移、牙周袋形成及一系列牙周膜細胞的炎性反應和免疫應答[11]。

近年來許多學者認為，牙周炎癥不僅存在于局部牙周組織，還與全身系統(tǒng)性免疫炎性反應有關(guān)，牙周炎可能引起機體外周血循環(huán)中IL-1β和TNF-α等致炎細胞因子的水平，參與多種全身疾病的發(fā)生和發(fā)展。孫曉軍等[12]研究發(fā)現(xiàn)，牙周炎患者血清IL-1β濃度顯著高于牙周健康者。IL-1β濃度升高的原因可能是致病微生物及其毒素通過感染、破潰的牙周袋上皮，刺激牙周組織，局部產(chǎn)生的高濃度的IL-1β進入血循環(huán)中，另一方面可能是細菌及其毒素的全身播散，引起血中白細胞和其他一些組織、細胞釋放更多的IL-1β，導致血漿中IL-1β水平的升高。因此，在牙周炎的臨床治療中，抑制炎性細胞因子IL-1β的生成，，對牙周炎及全身疾病的治療均有積極的治療意義。

黃芩苷具有抑菌、清熱、抗炎、抗變態(tài)反應等藥理活性，能夠抑制牙周組織的炎癥反應，顯著降低脂多糖誘導的單核細胞中IL-1β的合成，增加牙齦成纖維細胞的細胞活性、線粒體活性、膠原和總蛋白質(zhì)的合成，對牙齦成纖維細胞有激活作用[13-15]；而且有研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷對內(nèi)毒素還有較好的直接降解作用，其降解作用具有時間和濃度依賴性，局部應用黃芩苷治療牙周病還能有效改善臨床及細菌學指標[2,16]。目前局部應用化學藥物對牙周炎的療效也比較明顯，但這些藥物僅能殺滅致病菌，卻不能直接拮抗菌體溶解后產(chǎn)生的內(nèi)毒素，并且化學藥物存在毒副作用大、耐藥性強等問題，應用受到局限。而黃芩苷既對內(nèi)毒素有較好的降解作用，又可以抑制炎性因子的合成，促進牙周成纖維細胞的活性，黃芩又是我國傳統(tǒng)中藥，來源豐富、價格低廉、不良反應小，因此利用黃芩苷防治牙周病具有廣闊的前景。

本實驗結(jié)果顯示，與牙周炎組相比，局部注射黃芩苷后，黃芩苷治療組大鼠的一般情況與牙周炎組相比均有明顯好轉(zhuǎn)，各治療組大鼠牙齦組織充血減輕，牙周袋變淺，神態(tài)趨于正常，皮毛光澤改善，進食、活動增多，體重逐漸增加；黃芩苷各治療組牙齦組織中IL-1βmRNA和其外周血中IL-1β的表達含量均明顯低于牙周炎組，隨著黃芩苷濃度升高，IL-1β表達水平逐漸降低，表明黃芩苷可降低實驗性牙周炎大鼠牙齦組織中IL-1βmRNA和其外周血中IL-1β的表達水平，抑制IL-1β的分泌和合成，減輕機體炎性反應，抑制牙槽骨吸收，提示臨床上局部應用黃芩苷治療牙周炎，可能會減輕牙周炎的炎性反應，抑制破骨細胞形成，促進牙周病患者的康復。

綜上所述，黃芩苷可改善牙周炎大鼠的一般狀況，降低牙周炎大鼠牙齦組織和外周血中IL-1β的表達水平，阻斷脂多糖對大鼠牙周細胞內(nèi)膜性結(jié)構(gòu)的損傷，但具體作用機尚需進一步研究。

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Effects of baicalin on the expression levels of interleukin-1β in gingival tissues and peripheral blood of rats with periodontitis

LIHuiying,LIGuoxing,CUIJia,etal.

DepartmentofStomatology,HebeiProvincialChildren’sHospital,Shijiazhuang050031,China

ObjectiveTo observe the effects of baicalin on the expression levels of interleukin-1β in gingival tissues and peripheral blood of rats with periodontitis that is induced by colibacillus lipopolysaccharide.MethodsFifty SD rats (8-week age) were randomly divided into five groups:control group (group A), periodontitis group (group B), baicalin treatment groups (group C1,C2,C3),with 10 rats in each group.After 1-week treatment,all the rats were sacrificed and gingival tissues and peripheral blood specimens were taken,and the expression levels of IL-1β mRNA in peripheral blood of rats were measured by cytometric bead array (CBA),which in gingival tissues of rats were detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) technique.ResultsThe expression levels of IL-1β mRNA in gingival tissues and peripheral blood of rats in group B were significantly higher than those in group A (P<0.05). Moreover the expression levels of IL-1β mRNA in gingival tissues and peripheral blood of rats in group C1,C2,C3 were significantly lower than those in group B (P<0.05).ConclusionThe baicalin can decrease the expression levels of IL-1β mRNA in gingival tissues and peripheral blood of rats with periodontitis,and can improve the injury effect of lipopolysaccharide on gingival tissues of rats.

baicalin; periodontitis; interleukin-1β; rats

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.21.001

項目來源：河北省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥類科研計劃項目(編號:2013181)

050031石家莊市,河北省兒童醫(yī)院口腔科

劉學聰，050031石家莊市，河北省兒童醫(yī)院口腔科；E-mail:lgxlhy@163.com

R 781.4

A

1002-7386(2016)21-3205-04

2016-03-18)