王曉琳， 馬　甡， 單洪偉

(中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003)

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兩株潛在益生菌安全性評價(jià)及其對凡納濱對蝦免疫力和抗WSSV能力影響?

王曉琳， 馬甡， 單洪偉??

(中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003)

本研究以2株潛在益生菌(芽孢桿菌(Bacillus. sp)BZ5株和溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)VZ5株)為研究對象。通過研究其溶血特性、常見抗生素的敏感性及感染菌體后凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)的存活率，探討了兩菌株對凡納濱對蝦的安全性。注射和浸泡方式下，研究兩菌株對凡納濱蝦的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化酶(POD)、抗菌酶活力變化的影響以及感染W(wǎng)SSV的凡納濱對蝦的存活率，探討了兩菌株對凡納濱對蝦免疫力和抗WSSV能力的影響。研究顯示：芽孢桿菌BZ5株和溶藻弧菌VZ5株均未表現(xiàn)出溶血特征，且對多數(shù)常見抗生素敏感或中度敏感。在106cfu/mL濃度下，芽孢桿菌BZ5株和溶藻弧菌VZ5株未對凡納濱對蝦表現(xiàn)出明顯的毒害作用。注射和浸泡方式下，芽孢桿菌組和溶藻弧菌組對蝦的SOD、POD活力顯著高于對照組(P<0.05)，其中芽孢桿菌組對蝦的SOD、POD活力顯著高于溶藻弧菌組(P<0.05)。感染W(wǎng)SSV后，芽孢桿菌組和溶藻弧菌組對蝦的半數(shù)致死時(shí)間比對照組分別延長了27.38%和21.43%(注射菌體)、24.73%和8.60%(浸泡菌體)。研究結(jié)果表明，芽孢桿菌BZ5株和溶藻弧菌VZ5株在提高對蝦免疫力和抗WSSV能力方面具有較好的效果，在對蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)中有潛在的應(yīng)用前景。

芽孢桿菌；溶藻弧菌；凡納濱對蝦；安全性評價(jià)；免疫力；抗WSSV能力

引用格式：王曉琳， 馬甡， 單洪偉. 兩株潛在益生菌安全性評價(jià)及其對凡納濱對蝦免疫力和抗WSSV能力影響[J]. 中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2016, 46(10)： 39-47.

WANG Xiao-Lin, MA Shen， SHAN Hong-Wei. Safety evaluation of two probiotics strains and their effects on the immunity and the ability of anti-WSSV ofLitopenaeusvannamei[J]. Periodical of Ocean University of China, 2016, 46(10)： 39-47.

益生菌是一群當(dāng)達(dá)到一定數(shù)量時(shí)能夠?qū)λ拗鳟a(chǎn)生積極影響的微生物[1]。目前，水產(chǎn)益生菌的種類主要包括光合細(xì)菌、乳酸菌(Lactobacilus. sp)、芽孢桿菌(Bacillus.sp)、硝化細(xì)菌等。其中，芽孢桿菌是一種公認(rèn)的優(yōu)良益生菌，因其具有促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物生長[2]、減少病害發(fā)生[3]、改善養(yǎng)殖環(huán)境[4-5]、提高養(yǎng)殖動(dòng)物免疫力[6]等優(yōu)點(diǎn)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中被廣泛應(yīng)用。此外，其他菌種也具有作為益生菌的潛能。溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)是海水中的常見菌，一些研究將其作為益生菌應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中，并取得了很好的效果[7]。

在前期工作中，我們分離得到了芽孢桿菌BZ5株和溶藻弧菌VZ5株2株潛在益生菌。研究發(fā)現(xiàn)，飼喂芽孢桿菌BZ5株能夠有效提高對蝦消化和抗WSSV能力，飼喂溶藻弧菌VZ5株能夠更好的提高對蝦免疫相關(guān)酶活力和抗WSSV能力[8]。此外，溶藻弧菌VZ5株還能夠有效去除水體中的氨態(tài)氮和亞硝態(tài)氮[9]。

近年來，隨著益生菌研究的不斷發(fā)展，其所引發(fā)的安全性問題引起人們的廣泛關(guān)注。益生菌通過被機(jī)體直接攝入而發(fā)揮作用，其在耐藥性、感染能力等方面潛在的安全問題不容忽視[10]。目前，蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、短乳桿菌(Lactobacillusbreris)、戊糖乳桿菌(L.pentosus)等一些從禽畜體內(nèi)分離的益生菌株的安全性已有相關(guān)研究[11]，但水產(chǎn)益生菌的安全性研究卻很少。

本研究以芽孢桿菌BZ5株和溶藻弧菌VZ5株為研究對象，開展了兩菌株的溶血活力、耐藥性及對對蝦的安全性研究，之后進(jìn)一步研究了注射和浸泡2種方式下芽孢桿菌BZ5株和溶藻弧菌VZ5株對凡納濱對蝦免疫相關(guān)酶活力及抗WSSV能力的影響，旨在為兩菌株在凡納濱對蝦養(yǎng)殖中應(yīng)用的安全及功能提供參考，為對蝦養(yǎng)殖中益生菌的開發(fā)及應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)購于青島市膠州市寶榮水產(chǎn)科技發(fā)展有限公司，體長為(7.0±0.5) cm。將對蝦暫養(yǎng)于室內(nèi)，水溫(24±1) ℃，鹽度30，持續(xù)充氣，早晚各投喂1次，每天吸殘餌糞便，換水1/5。暫養(yǎng)7 d后開始實(shí)驗(yàn)。

芽孢桿菌BZ5株和溶藻弧菌VZ5株由本研究室篩選于舟山市綠源水產(chǎn)養(yǎng)殖有限公司的凡納濱對蝦養(yǎng)殖池塘[12]。哈維氏弧菌2011053001由中國水產(chǎn)科學(xué)院黃海水產(chǎn)研究所海水養(yǎng)殖疾病控制與分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

血瓊脂培養(yǎng)基(BZW12005)購于南京便診生物科技有限公司，抗菌藥物藥敏紙片(S1009)購于杭州微生物試劑有限公司。

注射感染實(shí)驗(yàn)和浸泡感染實(shí)驗(yàn)在水循環(huán)系統(tǒng)中進(jìn)行，水族箱規(guī)格為50 cm×35 cm×35 cm，水體積大約為50 L。

WSSV病毒液WSSV病毒由中國海洋大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物病害與免疫實(shí)驗(yàn)室提供。使用前，用配好的PBS緩沖液(136.9 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10.1 mmol/L Na2HPO4，1.8 mmol/L K2HPO4，pH =7.4)將WSSV病毒稀釋1 000倍，備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 溶血實(shí)驗(yàn)將芽孢桿菌BZ5株和溶藻弧菌VZ5株培養(yǎng)24 h后點(diǎn)種于血瓊脂培養(yǎng)基上，每種菌在同一個(gè)平板上點(diǎn)種3次(即3個(gè)重復(fù))，然后在37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察是否有溶血現(xiàn)象產(chǎn)生。以哈維氏弧菌2011053001作為陽性對照。

1.2.2 藥敏實(shí)驗(yàn)采用抗菌藥物藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將芽孢桿菌BZ5株和溶藻弧菌VZ5株培養(yǎng)24 h后取 0.1 mL 菌液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上，并貼上藥敏紙片(20種抗生素)，擴(kuò)散 30 min 后，置于 30 ℃培養(yǎng) 24 h，培養(yǎng)結(jié)束后測量并記錄待測菌株的抑菌圈直徑。每種抗生素藥物紙片做 4個(gè)重復(fù)。測試菌株對20種抗生素的藥敏性參照CLSI 2011版本的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.2.3 注射感染實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分為4組，每組設(shè)4個(gè)平行，每個(gè)平行20尾蝦。向?qū)ξr第四、五腹節(jié)分別注射50 μL生理鹽水(生理鹽水組)、50 μL(106cfu/mL)芽孢桿菌BZ5株活菌體(芽孢桿菌組)、50 μL(106cfu/mL)溶藻弧菌VZ5株活菌體(溶藻弧菌組)、50 μL(106cfu/mL)哈維氏弧菌2011053001株活菌體(哈維氏弧菌組)，其中，生理鹽水組和哈維氏弧菌組為對照組。

實(shí)驗(yàn)持續(xù)264 h。在實(shí)驗(yàn)前96 h，每隔12 h記錄對蝦死亡數(shù)量，評估注射菌體對對蝦成活率的影響。在96 h時(shí)，向生理鹽水組、芽孢桿菌組和溶藻弧菌組對蝦注射50 μL WSSV病毒液，每隔12 h記錄對蝦死亡數(shù)量，評估注射菌體對對蝦抗WSSV能力的影響。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，分別在0、12、48、96、108、120、144和192 h取生理鹽水組、芽孢桿菌組和溶藻弧菌組對蝦血清，測定血清中SOD、POD和抗菌酶活力，評估注射菌體對對蝦免疫相關(guān)酶活力的影響。

1.2.4 浸泡感染實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分為4個(gè)處理組，每組設(shè)4個(gè)平行，每個(gè)平行20尾蝦。對照組：不添加菌液;芽孢桿菌組：向水體添加芽孢桿菌BZ5株菌體使水體中菌體密度維持在106cfu/mL；溶藻弧菌組：向水體添加溶藻弧菌VZ5株菌體使水體中菌體密度維持在106cfu/mL；哈維氏弧菌組：向水體添加哈維氏弧菌2011053001株菌體使水體中菌體密度維持在106cfu/mL。

實(shí)驗(yàn)持續(xù)23 d，在實(shí)驗(yàn)前16 d，記錄對蝦死亡數(shù)量，評估浸泡菌體對對蝦成活率的影響。在16 d時(shí)，向生理鹽水組、芽孢桿菌組和溶藻弧菌組對蝦注射50 μL WSSV病毒液，每隔12 h記錄對蝦死亡數(shù)量評估浸泡菌體對對蝦抗WSSV能力的影響。分別在0、1、2、4、8、16、17、18和20 d取生理鹽水組、芽孢桿菌組和溶藻弧菌組的對蝦血清，測定血清中SOD、POD和抗菌酶活力，評估浸泡菌體對對蝦免疫相關(guān)酶活力的影響。

1.3 樣品分析

1.3.1 血清采集采集血清前準(zhǔn)備好抗凝劑(450 mmol/L NaCl，10 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2-EDTA，10 mmol/L HEPES，pH=7.3)[13]。開始時(shí)將一次性注射器用抗凝劑潤洗數(shù)次，然后按血清：抗凝劑=1∶1的比例從對蝦靠近血竇的位置進(jìn)行抽血，抽出的血清離心(5 000 r/min，10 min)，取上清液保存于-80 ℃超低溫冰箱中，待測。

1.3.2 相關(guān)酶活力測定SOD、POD均由南京建成生物有限公司購置的相關(guān)測定盒測定?？咕富盍Σ捎酶倪M(jìn)的Hultmark等[14]的方法進(jìn)行測定：將哈維氏弧菌用pH=6.4的1 mol/L磷酸鉀鹽緩沖液配成OD570 nm為0.4的菌液，移取3 mL菌液放入試管(放于冰水浴中)中，再向試管中加入50 μL待測血清，輕微震蕩使液體混勻，立即放于570 nm波長下測其吸光值A(chǔ)1，再把試管放于37 ℃恒溫水浴中30 min后立即取出放在冰水浴中停止反應(yīng)，再于570 nm波長下測定吸光值A(chǔ)2?？咕富盍τ?jì)算公式為[(A1-A2)/A2]1/2。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ± S.D.)表示，通過SPSS19.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因子方差分析(One-way ANOVA) 和Duncan多重比較法進(jìn)行差異顯著性分析，取P<0.05 為差異顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1 溶血實(shí)驗(yàn)

菌株溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，哈維氏弧菌2011053001產(chǎn)生明顯的溶血現(xiàn)象，而芽孢桿菌BZ5株和溶藻弧菌VZ5株沒有明顯的溶血現(xiàn)象，表明芽孢桿菌BZ5株和溶藻弧菌VZ5株不產(chǎn)生溶血素。

2.2 藥敏實(shí)驗(yàn)

菌株藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，芽孢桿菌BZ5株對頭孢氨芐、頭孢唑啉、頭孢拉定、頭孢呋辛、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢哌哃、丁胺卡那、苯唑西林、羧芐青霉素、四環(huán)素、多西林素、米諾環(huán)素、紅霉素敏感，對青霉素G片、慶大霉素中度敏感；溶藻弧菌VZ5株對新霉素、紅霉素、頭孢呋辛、頭孢他啶敏感，對頭孢拉定、哌拉西林、頭孢氨芐、頭孢唑啉、頭孢曲松、丁胺卡那、慶大霉素、卡那霉素中度敏感。

圖1　不同菌株的溶血現(xiàn)象Fig.1　The hemolysis of the different bacteria strains表1　不同菌株的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1　The results of the medicine sensitive of the different strains

抗生素Antibiotics紙片含藥量(每片)①VZ5株抑菌圈直徑②/mm判定結(jié)果③BZ5株抑菌圈直徑④/mm判定結(jié)果③青霉素G片PenicillinGpiece10U0R14.44I苯唑西林Oxacillin1μg0R0R氨芐西林Ampicillin10μg9.57R18.87S羧芐青霉素Carbenicillin100μg7.27R18.29S哌拉西林Piperacillin100μg13.71I17.59S頭孢氨芐Cefalexin30μg11.67I20.88S頭孢唑啉Cefazolin30μg13.73I28.56S頭孢拉定Cefradine30μg14.14I22.36S頭孢呋辛Cefuroxime30μg21.05S0R頭孢他啶Ceftazidime30μg28.75S24.75S頭孢曲松Ceftriaxone30μg14.48I33.49S頭孢哌哃Cefoperazone75μg0R24.02S丁胺卡那Amikacin30μg14.31I16.62S慶大霉素Gentamicin10μg13.51I13.9I卡那霉素Kanamycin30μg12.27I0R新霉素Neomycin30μg15.15S16.89S四環(huán)素Tetracycline30μg8.21R16.42S多西環(huán)素Doxycycline30μg0R20.55S米諾環(huán)素Minocyline30μg0R22.43S紅霉素Erythrocin15μg15.34S27.37S

注： R為耐藥, I為中度敏感，S為敏感。

Note: R indicate resistant, I indicate intermediate, S indicate sensitive.

①Concentration(Piece)；②Inhibition zone of VZ5；③Result；④ Inhibition zone of BZ5

2.3 感染實(shí)驗(yàn)

注射感染實(shí)驗(yàn)各組累計(jì)死亡率如表2所示，芽孢桿菌組和溶藻弧菌組與生理鹽水組(陰性對照組)的對蝦累計(jì)死亡率無顯著性差異(P>0.05)，2組對蝦累計(jì)死亡率顯著低于哈維氏弧菌組(陽性對照組)(P<0.05)。由此可見，向?qū)ξr體內(nèi)注射106cfu/mL濃度的芽孢桿菌BZ5株和溶藻弧菌VZ5株菌體對對蝦未顯示明顯毒害作用。

浸泡感染實(shí)驗(yàn)各組累計(jì)死亡率如表3所示，芽孢桿菌組和溶藻弧菌組死亡率與對照組無顯著性差異(P>0.05)，且顯著低于哈維氏弧菌組(陽性對照組)(P<0.05)。由此可見，水體中芽孢桿菌BZ5株和溶藻弧菌VZ5株濃度達(dá)到106cfu/mL時(shí)對對蝦無明顯毒害作用。

表2　注射感染實(shí)驗(yàn)中凡納濱對蝦的累計(jì)死亡率(Mean±S.D.)Table 2　The cumulative mortality rate of L. vannamei in injection test　/%

注：最后一行不同上標(biāo)字母為差異顯著(P<0.05)。

Note: Different superscripts indicate significant difference in the last line (P<0.05).

表3　浸泡感染實(shí)驗(yàn)中凡納濱對蝦的累計(jì)死亡率(mean±S.D.)Table 3　The cumulative mortality of L. vannamei in immersing tes　/%

注：最后一行不同上標(biāo)字母為差異顯著(P<0.05)。

Note: Different superscripts indicate significant difference in the last line (P<0.05).

2.4 注射感染方式下兩菌株對凡納濱對蝦免疫相關(guān)酶活力、抗WSSV能力的影響

各組對蝦SOD活力變化如圖2所示，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中芽孢桿菌組和溶藻弧菌組凡納濱對蝦的SOD活力處于較高水平，顯著高于對照組(P<0.05)。對照組對蝦SOD活力處于較低水平，感染W(wǎng)SSV后略有上升。前96 h，芽孢桿菌組SOD活力最大值比對照組提高131.06%，感染W(wǎng)SSV后，芽孢桿菌組SOD活力略有下降，但仍高于其他二組。溶藻弧菌組SOD活力變化趨勢與芽孢桿菌組相同，但是SOD活力水平總體上低于芽孢桿菌組。實(shí)驗(yàn)表明，注射芽孢桿菌BZ5株和溶藻弧菌VZ5株可顯著提高凡納濱對蝦SOD活力，其中芽孢桿菌BZ5株的效果優(yōu)于溶藻弧菌VZ5株。

(不同字母代表差異顯著(P<0.05), 下圖同。Different letters indicate significant difference (P<0.05).The same case in the following figures.)

圖2注射不同菌株對蝦SOD活力變化

Fig.2The variation of SOD activity ofL.vannameiinjected by different strains

各組對蝦POD活力變化如圖3所示，整個(gè)過程中芽孢桿菌組和溶藻弧菌組凡納濱對蝦的POD活力顯著高于對照組(P<0.05)。在前96 h，芽孢桿菌組和溶藻弧菌組對蝦POD活力最大值分別比對照組提高95.35%和21.77%。在感染W(wǎng)SSV后，各組POD活力均下降。實(shí)驗(yàn)表明，注射芽孢桿菌BZ5株和溶藻弧菌VZ5株可顯著提高凡納濱對蝦POD活力，整體上講，芽孢桿菌BZ5株效果顯著高于溶藻弧菌VZ5株。

圖3　注射不同菌株對蝦POD活力變化Fig.3　The variation of POD activity of L. vannameiinjected by different strains

各組對蝦抗菌酶活力如圖4所示，前96 h，芽孢桿菌組和溶藻弧菌組凡納濱對蝦的抗菌酶活力顯著性高于對照組(P<0.05)，但兩組之間無顯著性差異(P>0.05)。感染W(wǎng)SSV后，芽孢桿菌組和溶藻弧菌組凡納濱對蝦的抗菌酶活力下降，與對照組差異不顯著。

感染W(wǎng)SSV后各組對蝦累計(jì)死亡率如圖5所示，各組半數(shù)致死時(shí)間LT50：對照組84 h，溶藻弧菌組102 h，芽孢桿菌組107 h。芽孢桿菌組和溶藻弧菌組半數(shù)致死時(shí)間分別比對照組延長了27.38%和21.43%。在120 h時(shí)對照組累計(jì)死亡率達(dá)到100%，而芽孢桿菌組為66.67%，溶藻弧菌組為78.79%。結(jié)果表明，注射芽孢桿菌BZ5株和溶藻弧菌VZ5株可以增強(qiáng)凡納濱對蝦抗WSSV能力，降低死亡率，其中，芽孢桿菌BZ5株效果更加明顯。

圖4　注射不同菌株對蝦抗菌酶活力變化Fig.4　The variation of antibacterial enzymes activity ofL. vannamei injected by different strains

圖5　注射方式下感染W(wǎng)SSV對蝦的累計(jì)死亡率Fig.5　Cumulative mortality of L. vannameiinfected with WSSV in injection test

2.5 浸泡方式下兩菌株對凡納濱對蝦免疫相關(guān)酶活力、抗WSSV能力的影響

各組對蝦SOD活力如圖6所示，芽孢桿菌組和溶藻弧菌組對蝦的SOD活力顯著高于對照組(P<0.05)，在前期，芽孢桿菌提高對蝦SOD活力效果更加明顯。感染W(wǎng)SSV后，芽孢桿菌組和溶藻弧菌組對蝦SOD活力差異不顯著，但是仍然顯著高于對照組(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)表明，水體中添加芽孢桿菌BZ5株和溶藻弧菌VZ5株能夠顯著提高凡納濱對蝦SOD活力。

圖6　浸泡不同菌株對蝦SOD活力變化Fig.6　The variation of SOD activity of L. vannameiimmersed by different strains

各組對蝦POD活力如圖7所示，芽孢桿菌組和溶藻弧菌組對蝦的POD活力顯著高于對照組(P<0.05)，但2組之間差異不顯著(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)表明，水體中添加芽孢桿菌BZ5株和溶藻弧菌VZ5株能夠顯著提高凡納濱對蝦POD活力。

圖7　浸泡不同菌株對蝦POD活力變化Fig.7　The variation of POD activity of L. vannameiimmersed by different strains

各組對蝦抗菌酶活力如圖8所示，芽孢桿菌組和溶藻弧菌組的抗菌酶活力顯著高于對照組(P<0.05)。在前期，芽孢桿菌組和溶藻弧菌組對蝦的抗菌酶活力差異不顯著(P>0.05)。感染W(wǎng)SSV后，芽孢桿菌組抗菌酶活力顯著高于溶藻弧菌組(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)表明，水體中添加芽孢桿菌BZ5株和溶藻弧菌VZ5株能夠顯著提高凡納濱對蝦的抗菌酶活力，且芽孢桿菌BZ5株的效果更好。

圖8　浸泡不同菌株對蝦抗菌酶活力變化Fig.8　The variation of antibacterial enzymes activity ofL. vannamei immersed by different strains

感染W(wǎng)SSV后各組對蝦累計(jì)死亡率如圖9所示，各組半數(shù)致死時(shí)間LT50：對照組93 h，溶藻弧菌組101 h，芽孢桿菌組116 h。芽孢桿菌組和溶藻弧菌組半數(shù)致死時(shí)間分別比對照組延長了24.73%和8.60%。結(jié)果表明，浸泡芽孢桿菌BZ5株和溶藻弧菌VZ5株可以提高凡納濱對蝦抗WSSV能力，其中，芽孢桿菌BZ5株效果更好。

3　討論

芽孢桿菌作為水產(chǎn)益生菌已被人們廣泛接受并應(yīng)用，溶藻弧菌作為水產(chǎn)益生菌的相關(guān)報(bào)道較少。一些學(xué)者研究結(jié)果表明，溶藻弧菌能夠感染對蝦，是對蝦養(yǎng)殖過程中的條件致病菌[15]。然而，溶藻弧菌作為益生菌應(yīng)用于對蝦苗種生產(chǎn)能夠有效提高對蝦幼體的抗病力[16]。本研究結(jié)果表明，溶藻弧菌VZ5株為非毒力菌株，對凡納濱對蝦不具備致病性，是一株潛在的水產(chǎn)益生菌。溶藻弧菌具有很強(qiáng)的遺傳多樣性，即使來自相同生物的溶藻弧菌菌株也具有明顯的差異性[17-18]。因此，不同溶藻弧菌菌株明顯的基因差異可能導(dǎo)致不同菌株的毒力差異，從而形成毒力菌株和非毒力菌株[19]。

圖9　浸泡方式下感染W(wǎng)SSV的凡納濱對蝦的累計(jì)死亡率Fig.9　Cumulative mortalityof L. vannameiinfected with WSSV in immersion test

溶血實(shí)驗(yàn)是體外安全性評價(jià)的一個(gè)重要方面，益生菌的溶血性被認(rèn)為是體外安全性評價(jià)的指標(biāo)之一[20]。Zheng等實(shí)驗(yàn)表明，有些芽孢桿菌菌株廣泛含有溶血素和腸毒素基因等毒素基因，對養(yǎng)殖動(dòng)物甚至對人類有潛在的致病性[21]。本研究中，芽孢桿菌BZ5株和溶藻弧菌VZ5株都未表現(xiàn)出溶血特征，說明這2株菌株不產(chǎn)生溶血素，對紅細(xì)胞無潛在的致病性，可以作為潛在的益生菌進(jìn)行進(jìn)一步的安全性評估。

為了使所篩選的益生菌在環(huán)境中使用安全，所篩選的菌株應(yīng)該對大部分抗生素敏感，從而避免其在環(huán)境中無限制生長。目前，很多學(xué)者主要采用紙片擴(kuò)散法來評價(jià)益生菌對廣譜抗生素的耐藥性。本實(shí)驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法測試了芽孢桿菌BZ5株和溶藻弧菌VZ5株對20種常見抗生素的耐藥性，發(fā)現(xiàn)兩菌株對大部分抗生素敏感或者中度敏感，因此可以在對蝦養(yǎng)殖中使用。

小規(guī)模浸泡實(shí)驗(yàn)是評價(jià)潛在益生菌株對養(yǎng)殖動(dòng)物安全性的良好方式[22]。胡修貴[23]通過向凡納濱對蝦蝦體注射菌液的方式證明巨大芽孢桿菌等3株菌株在107cfu/mL濃度下時(shí)對凡納濱對蝦無顯著毒害作用，安健等[24]通過向健康小鼠和草魚注射菌液的方式評價(jià)了解淀粉芽孢桿菌對小鼠和草魚的安全性。本研究中的注射感染實(shí)驗(yàn)和浸泡感染實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，106cfu/mL濃度的芽孢桿菌BZ5株和溶藻弧菌VZ5株對凡納濱對蝦無明顯的毒害作用，進(jìn)而進(jìn)一步確定這2株菌株在凡納濱對蝦養(yǎng)殖中使用的安全。

對蝦血清中SOD、POD及抗菌酶在對蝦防御反應(yīng)中起到重要作用，可以清除多余的氧自由基，從而防止細(xì)胞損傷、延緩細(xì)胞衰亡，是反映對蝦免疫能力的重要指標(biāo)[25]。本實(shí)驗(yàn)中，無論是體內(nèi)注射還是水體中添加，芽孢桿菌BZ5株和溶藻弧菌VZ5株都可以不同程度地提高凡納濱對蝦的SOD、POD及抗菌酶的活力，表明兩菌株的使用能夠有效提高對蝦的免疫水平。一般認(rèn)為，益生菌進(jìn)入水產(chǎn)動(dòng)物腸道后，其表面抗原或代謝物充當(dāng)免疫原不斷刺激動(dòng)物的免疫防御系統(tǒng)，同時(shí)其通過與致病菌爭奪營養(yǎng)和附著位點(diǎn)，保護(hù)機(jī)體免受侵染，從而增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫和抗病力[26]。注射方式下，菌體進(jìn)入對蝦機(jī)體，刺激對蝦免疫防御系統(tǒng)，從而增強(qiáng)了機(jī)體的非特異性免疫。浸泡方式下，菌體有可能從環(huán)境進(jìn)入腸道，定殖，從而起到保護(hù)機(jī)體，增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫的效果。本研究中，芽孢桿菌BZ5株的效果更好，可能是由于其分泌的物質(zhì)能夠更有效的刺激對蝦非特異性免疫系統(tǒng)，從而更有效的提高對蝦的免疫水平。具體的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。

各組凡納濱對蝦的半致死時(shí)間為芽孢桿菌組>溶藻弧菌組>對照組，說明芽孢桿菌BZ5株與溶藻弧菌VZ5株能夠提高對蝦的抗WSSV能力，這與已有類似研究結(jié)果相似, 胡毅等[27]和劉君等[28]等分別證實(shí)應(yīng)用芽孢桿菌能夠提高對蝦非特異免疫功能和抗WSSV感染能力。本研究中芽孢桿菌BZ5株對感染W(wǎng)SSV的凡納濱對蝦的免疫保護(hù)作用優(yōu)于溶藻弧菌VZ5株。綜合兩菌株對凡納濱對蝦免疫相關(guān)酶活力的影響，推測可能是芽孢桿菌BZ5株能夠更有效刺激凡納濱對蝦非特異免疫系統(tǒng)，從而增強(qiáng)了凡納濱對蝦抵御WSSV的能力。

4　結(jié)語

本研究結(jié)果表明，芽孢桿菌BZ5株與溶藻弧菌VZ5株對凡納濱對蝦不具備致病性，可應(yīng)用于凡納濱對蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)中。注射和浸泡方式下，芽孢桿菌BZ5株和溶藻弧菌VZ5株能夠有效提高凡納濱對蝦的SOD、POD、抗菌酶活力和抗WSSV能力，其中芽孢桿菌BZ5株效果更好。由于溶藻弧菌是條件致病菌，加之自然界中細(xì)菌的變異以及菌株之間的基因轉(zhuǎn)移普遍存在，因此，溶藻弧菌VZ5株在使用時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制添加量和使用周期，或者以滅活的形式使用。

致謝：感謝中國水產(chǎn)科學(xué)院黃海水產(chǎn)研究所海水養(yǎng)殖疾病控制與分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室以及中國海洋大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物病害與免疫實(shí)驗(yàn)室為本研究所提供的病原菌株和WSSV。

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責(zé)任編輯朱寶象

Safety Evaluation of two Probiotics Strains and Their Effects on the Immunity and the Ability of Anti-WSSV ofLitopenaeusVannamei

WANG Xiao-Lin, MA Shen， SHAN Hong-Wei

(The Key Laboratory of Mariculture, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Probiotics are widely used in aquaculture due to their excellent performance in promoting the growth and immunity of cultured aquatic animals, decreasing epidemic disease infection, and improving the culture environment. With the extension of their applications, safety problems aroused wide attentions. The purpose of this study was to evaluate the safety ofBacillussp. BZ5 andV.alginolyticusVZ5 and reveale their effects on the immune-related enzyme activity and the ability of anti-WSSV ofL.vannamei. This study included hemolysis, drug sensitivity, injection and immersion tests. In hemolysis test, strain BZ5 and VZ5 were cultured in Luria-Bertan medium with a salinity of 30 for 24 h, and then inoculated in blond agar for observation of hemolysis. In drug sensitivity test, a sensitive degree of strain BZ5 and VZ5 to 20 kinds of common antibiotics were recorded. In injection test, strain BZ5 and VZ5 (50 μL, 106cfu/mL) were injected to shrimp muscle. In immersion test, shrimp were immersed in culture environment containing 106cfu/mL of BZ5 and VZ5. The WSSV was injected to the shrimp muscle at the 4thof injection test and the 16thof immersion test. Cumulative mortality and immune-related enzyme activity of shrimp were recorded during the injection test and immersion test. Strain BZ5 and VZ5 did not cause a hemolysis phenomenon, and were sensitive or moderately sensitive to most of the common antibiotics. BZ5 and VZ5 did not show toxic effect onL.vannameiat 106cfu/mL (invivoinjection and immersion in bacterium solution). In some studies,Vibrioalginolyticuswas reported as a pathogen of shrimp. This may be related to the genetic diversity ofV.alginolyticusstrains resulting in greatly different virulence. The activity of SOD, POD of shrimp inBacillusSp. group andV.alginolyticusgroup were significantly higher than those of the control (P<0.05), and those in theBacillusSp. group were significantly higher than those inV.alginolyticusgroup (P<0.05). The strain BZ5 showed better performance because its metabolites could more efficiently stimulate the non-specific immune system of shrimp. Ininvivoinjection test, the median lethal time (LT50) of shrimp inBacillussp. group andV.alginolyticusgroup was extended by 27.38% and 21.43%, respectively compared with the control. In immersed test, the median lethal time (LT50) of shrimp inBacillussp. group andV.alginolyticusgroup were extended by 24.73% and 8.60%, respectively compared with the control. In conclusion, the results indicated that strain BZ5 and VZ5 were safe when used in shrimp culture, and have potential application in improving the immunity and ability of anti-WSSV ofL.vannamei. It is noted thatVibrioalginolyticuswas a kind of conditional pathogen, and the variation of bacteria and the gene transfer between strains were widespread. Therefore, the application amount of strain VZ5 should be strictly controlled or used in inactivation form.

Bacillus. sp;Vibrioalginolyticus;Litopenaeusvannamei; safety evaluation; immunity; ability of anti-WSSV

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2014CP005);公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)項(xiàng)目(201103034)資助

2015-10-03；

2016-01-18

王曉琳(1988-)，女，碩士生，主要從事水產(chǎn)益生菌的相關(guān)研究。E-mail: wangxiaolin1225@126.com

??通訊作者：E-mail: shanhongwei@ouc.edu.cn

S968.22

A

1672-5174(2016)10-039-09

10.16441/j.cnki.hdxb.20150344

Supported by Shandong Provincial Natural Science Foundation(ZR2014CP005); Special Fund for Agroscientific Research in the Public Interest (201103034)