于麗 曾楨 李婷 廖秦平

【摘要】目的：檢測子宮內(nèi)膜癌組織中孕激素受體膜成分1（PGRMC1）的蛋白表達特點，分析其臨床意義；并探討PGRMC1對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖調(diào)控的影響。方法：采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western blot）檢測70例子宮內(nèi)膜癌組織及28例對照子宮內(nèi)膜組織中PGRMC1蛋白表達水平；應(yīng)用細(xì)胞免疫組化方法檢測三種人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系中PGRMC1的表達定位；將PGRMC1的小分子抑制劑Ag205以不同濃度分別刺激人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa、Hec-1A、KLE 72小時，應(yīng)用CCK-8（cell counting kit 8）方法檢測Ag205對細(xì)胞活力的影響。結(jié)果：子宮內(nèi)膜癌組織中PGRMC1表達較正常內(nèi)膜顯著升高（P=0.038）；PGRMC1在各期子宮內(nèi)膜癌組織中的表達無差異，但在Ⅰ期患者中，PGRMC1在Ⅰa期表達較Ⅰb期顯著高（P=0.019）；PGRMC1表達與子宮內(nèi)膜癌組織中ER表達水平相關(guān)（P=0.015），但與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及脈管癌栓無關(guān)，與 PR、p53、Ki-67及bcl-2表達亦無顯著相關(guān)性；20μM Ag205顯著抑制三種子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖活力，其中以KLE細(xì)胞的抑制作用最明顯，從最低濃度（5μM）即出現(xiàn)抑制效應(yīng)，并隨濃度增加抑制作用逐步增強。結(jié)論：子宮內(nèi)膜癌內(nèi)膜中PGRMC1表達顯著增高；增高的PGRMC1參與調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖活性。

【關(guān)鍵詞】子宮內(nèi)膜癌；孕激素受體膜成分1；增殖活力；蛋白質(zhì)免疫印跡法

The expression of PGRMC1 in endometrial cancer andits effect on endometrial cancer cell proliferationYU Li， ZENG Zhen， LI Ting， LIAO Qinping△. Department of Obstetrics and Gynecology， Peking University First Hospital， Beijing 100034， China

【Abstract】Objectives： To investigate the expression pattern of progesterone receptor membrane component 1 （PGRMC1） in endometrial carcinoma （EC）， and evaluate the probable role of PGRMC1 in the proliferation of endometrial cancer cells. Methods： 70 endometrial cancer tissues and 28 noncancerous endometrial tissues were collected as experimental group and control group respectively. The expression of PGRMC1 was detected by Western blot. Three endometrial cancer cell lines were cultured in vitro， then the expression location of PGRMC1 were tested by immunohistochemistry. The cell viability was detected by CCK-8 after treatment with Ag205 for 72 hours individually， which was the specific inhibitor of PGRMC1. Results： The expression of PGRMC1 was significantly higher in EC patients than control group （P=0.038）. There was no difference among different stages， but the expression of PGRMC1 was significantly higher in patients with stage Ia than stage Ib （P=0.019）. In endometrial carcinoma the increase of PGRMC1 was detected in those with high ER status （P=0.015）. PGRMC1 expression had no relationship with lymph node metastasis or vascular invasion， and was unrelated to the expression of PR， p53， Ki-67， bcl-2. The proliferation of three endometrial cancer cell lines was all heavily inhibited by 20μM Ag205. In KLE cells Ag205 showed the strongest growth repression， since from 5μM the repression effect began to appear. Conclusion： The expression of PGRMC1 is significantly higher in EC patients than that in control group. The over-expression of PGRMC1 in endometrial carcinoma may play a role in the proliferation activity of endometrial cancer cells.

【Key words】Endometrial carcinoma； Progesterone receptor membrane component 1 （PGRMC1）； Proliferation activity； Western blot

【中圖分類號】R737.33【文獻標(biāo)志碼】A

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道常見惡性腫瘤之一，最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率已經(jīng)超過子宮頸癌和卵巢癌發(fā)病的總和，成為嚴(yán)重威脅女性健康的疾病[1]。子宮內(nèi)膜癌發(fā)生及惡性進展與雌、孕激素作用失衡密切相關(guān)，近年來研究發(fā)現(xiàn)性激素能夠通過不依賴其核受體的非基因組效應(yīng)調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲等功能，對于腫瘤的發(fā)生與發(fā)展起重要作用，由此發(fā)現(xiàn)一系列腫瘤相關(guān)分子，孕激素受體膜成分1（Progesterone receptor membrane component 1，PGRMC1）即是其中一員[2]。PGRMC1在介導(dǎo)孕激素的非基因組效應(yīng)中發(fā)揮重要作用，在體內(nèi)參與卵泡發(fā)育、精子的頂體反應(yīng)等生理過程[3， 4]；其還能夠與血紅素直接結(jié)合激活細(xì)胞色素P450參與調(diào)節(jié)體內(nèi)類固醇、藥物代謝及性激素的合成[5]；此外多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)PGRMC1表達異常，因此明確PGRMC1在子宮內(nèi)膜癌中的分布及其功能有助于豐富內(nèi)膜癌的病因?qū)W研究。本文將檢測PGRMC1在人子宮內(nèi)膜癌組織中的表達特點，分析PGRMC1對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長的影響，初步探討PGRMC1在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生進展中的作用。

1材料來源

1.1人子宮內(nèi)膜癌組織留取

回顧性選取2001年至2010年就診于我院婦產(chǎn)科并接受手術(shù)治療的70名子宮內(nèi)膜癌患者。排除術(shù)前已發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移、術(shù)中術(shù)后明顯并發(fā)癥影響患者遠(yuǎn)期生存、腫瘤切緣陽性的患者。了解所有患者的年齡、是否絕經(jīng)、手術(shù)方式、腫瘤分期、腫瘤分化、淋巴結(jié)狀態(tài)、是否存在脈管癌栓等信息。選取同期因其他疾病就診，行子宮切除術(shù)或分段診刮術(shù)、術(shù)后病理證實子宮內(nèi)膜為正?；驗榱夹圆∽兊?8例患者。所有子宮內(nèi)膜組織術(shù)前均無激素應(yīng)用史。將子宮內(nèi)膜組織在術(shù)后半小時內(nèi)取得并明確標(biāo)記后放入凍存管于液氮中過夜后移至-80℃冰箱中長期保存。所有內(nèi)膜組織取材均經(jīng)患者知情同意。

1.2樣本保存

人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa、Hec-1A、KLE由我院婦產(chǎn)科實驗室保存。

1.3主要試劑

RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、30%丙烯酰胺、SDS-PAGE電泳緩沖液、電轉(zhuǎn)移液及封閉-洗滌緩沖液（TBST）等試劑均購自于北京普利來基因技術(shù)有限公司。兔抗PGRMC1多克隆抗體購自于英國PROTEINTEC公司，小鼠抗β-actin單克隆抗體、HRP標(biāo)記抗兔和抗小鼠二抗購自于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。CCK-8（cell counting kit 8）試劑盒購于日本同仁化學(xué)研究所。Ag205 購于TIMTEC公司，溶于DMSO中配成40mM儲液，隨后用DMSO稀釋成不同濃度的1000×儲液，加藥刺激前用含0.5%活性炭處理FBS的無酚紅DMEM/F-12稀釋為工作液，濃度分別為0.1%DMSO、5μM Ag205、10μM Ag205、20μM Ag205、40μM Ag205。

2方法

2.1蛋白印跡法（Western Blot）檢測PGRMC1蛋白的表達水平

子宮內(nèi)膜癌及正常對照子宮內(nèi)膜組織按常規(guī)方法提取總蛋白，參照BCA試劑盒步驟測定總蛋白濃度，與2×Loading buffer混合變性后分裝-20℃保存?zhèn)溆谩Ｖ苽?2% SDS-PAGE分離膠和5% SDS-PAGE層積膠，以每孔總上樣量為50μg依次上樣電泳。切膠后200mA恒流2.5h電轉(zhuǎn)移至NC膜。5%脫脂奶粉封閉1h后，分別加入兔抗PGRMC1多克隆抗體和小鼠抗β-actin單克隆抗體室溫孵育1h后4℃過夜。次日用TBST洗滌后分別加入的HRP標(biāo)記抗兔和抗小鼠二抗室溫孵育1h，滴加ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑，Image station 400MMPRO 柯達顯像儀曝光獲得圖片（如圖1）。所有實驗均重復(fù)3次，圖像分析Image-J進行圖像灰度分析，以β-actin作為內(nèi)參，所得的Integrated Density column（IntDen）數(shù)值為條帶平均灰度和面積大小的乘積。樣品PGRMC1蛋白相對表達量= PGRMC1 IntDen/β-actin IntDen。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)與傳代

人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株Ishikawa、Hec-1A、KLE用含10%FBS、105U/L青霉素、105U/L鏈霉素的DMEM/F-12培養(yǎng)基，置于在37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合至70%～80%時按1：3比例進行傳代，取狀態(tài)良好的細(xì)胞進行實驗。

2.3細(xì)胞免疫組化方法檢測三種子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中PGRMC1的表達 取狀態(tài)良好的細(xì)胞，以合適密度接種于無菌載玻片上，放置于培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁牢固后用冰丙酮固定10min，依次進行穿孔、一抗及二抗孵育、顯色、脫水、封片后，在顯微鏡下觀察并拍照。用PBS代替一抗孵育后作為陰性對照。

2.4CCK-8法檢測Ag205作用后子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞活力

取狀態(tài)良好的細(xì)胞，以合適密度接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后更換為無血清無酚紅的DMEN/F-12饑餓24h，隨后加入不同濃度的Ag205，每個濃度設(shè)三個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)72h后加入CCK-8，37℃孵育1h后用酶標(biāo)儀在450nm波長處檢測其吸光度（A）值，該值與細(xì)胞密度成正比，以此反應(yīng)細(xì)胞活力。

2.5統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用（±s）表示，應(yīng)用SPSS20.0軟件包單因素方差（ONE-WAY ANOVA）分析及LSD及SNK檢驗；當(dāng)P<0.05時差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1PGRMC1在子宮內(nèi)膜癌與正常內(nèi)膜組織中的表達差異

本研究共納入70例子宮內(nèi)膜癌患者與28名子宮內(nèi)膜癌患者，子宮內(nèi)膜癌患者內(nèi)膜中PGRMC1的表達較正常內(nèi)膜PGRMC1的表達顯著升高（P=0.038）。見表1。28例對照組內(nèi)膜包括萎縮期內(nèi)膜4例，增殖期內(nèi)膜12例，分泌期內(nèi)膜7例，單純增生或復(fù)雜性增生3例，非典型增生2例。各型正常內(nèi)膜PGRMC1的表達無差異（P=0.880）。

表1PGRMC1在子宮內(nèi)膜癌內(nèi)膜及正常內(nèi)膜中的表達組別最大值最小值中位數(shù)PGRMC1表達量P子宮內(nèi)膜癌組織（n=70）4.200.271.211.34±0.740.038正常內(nèi)膜組織（n=28）1.610.240.940.99±0.35

3.2子宮內(nèi)膜癌組織中 PGRMC1表達與子宮內(nèi)膜癌病理分型的關(guān)系本研究中Ⅰ型癌59例，包括高分化者23例，中分化28例，低分化8例；Ⅱ型癌9例；此外還有2例為非典型增生伴癌變。各型病理類型子宮內(nèi)膜癌中PGRMC1的表達水平?jīng)]有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.225）。C1～C5： 子宮內(nèi)膜癌N1～N2： 正常子宮內(nèi)膜 Hec-1A： 人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系

3.3PGRMC1與子宮內(nèi)膜癌分期的關(guān)系

根據(jù)2009年FIGO分期，Ⅰ期患者56例，Ⅱ期3例，Ⅲ期10例，Ⅳ期1例。PGRMC1在各期子宮內(nèi)膜癌內(nèi)膜中的表達無差異（P=0.908）。在56例Ⅰ期患者中包括Ⅰa期47例，Ⅰb期9例，PGRMC1在Ⅰa期中的表達較Ⅰb期顯著高（P=0.019）。見表2、表3。

3.4PGRMC1與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移/脈管癌栓的關(guān)系

子宮內(nèi)膜癌內(nèi)膜中PGRMC1的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)（P=0.262）；與脈管癌栓無關(guān)（P=0.830）。

3.5PGRMC1表達水平與ER、PR、p53、Ki-67、bcl-2的關(guān)系

將子宮內(nèi)膜癌根據(jù)不同ER、PR、p53、Ki-67、bcl-2表達狀態(tài)進行分組，比較PGRMC1在各組間的表達，如表4所示，PGRMC1表達在ER高表達組明顯高于ER低表達組（P=0.015），而在其余組間表達則無統(tǒng)計學(xué)差異。

表4PGRMC1在人子宮內(nèi)膜癌組織中的表達及與臨床病理特征的相關(guān)性臨床病理特征PGRMC1PⅠ期1.34±0.740.098Ⅱ期1.07±0.51Ⅲ期1.43±0.83Ⅳ期1.19Ⅰa期1.43±0.760.019Ⅰb期0.86±0.44ER（3.6子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中PGRMC1的表達

三種子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中均可見到PGRMC1陽性表達顆粒，其主要定位于胞漿中，在Hec-1A和KLE中可見細(xì)胞核周邊表達相對密集，三種細(xì)胞細(xì)胞核中未見陽性表達顆粒。見圖2。

3.7Ag205對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖活力的影響

在三種子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中，隨著Ag205濃度的增加，細(xì)胞活力均逐漸下降，如圖3所示。在Ishikawa和Hec-1A細(xì)胞中，抑制趨勢基本一致，低濃度組（5μM和10μM）Ag205與對照組相比細(xì)胞活力無明顯改變，從20μM時出現(xiàn)顯著下降；而在KLE細(xì)胞中，Ag205的抑制作用較為顯著，從最低濃度5μM即出現(xiàn)細(xì)胞活力明顯下降，并逐步增強至40μM達到最大，而且各濃度組間細(xì)胞活力均存在顯著性差異。見表5。

4討論

PGRMC1是新近受到關(guān)注的腫瘤相關(guān)小分子蛋白，其在多種腫瘤中高表達，如乳腺癌、甲狀腺癌、結(jié)腸癌、宮頸癌及肺癌等[1，6]，在晚期卵巢癌中，PGRMC1表達亦明顯增高[7]，可能參與腫瘤的發(fā)生及進展，但具體機制還不明確。目前，子宮內(nèi)膜癌中PGRMC1的表達特點及臨床意義亦不清楚。本研究顯示子宮內(nèi)膜癌組織中PGRMC1表達增高；PGRMC1抑制劑Ag205能夠明顯抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞活力，提示高表達的PGRMC1對于子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖具有促進作用，此增強腫瘤生長的特性有望使其成為腫瘤治療的有效靶點。

PGRMC1基因位于Xq24，編碼單次穿膜蛋白，分子量約為25KD。其N端為穿膜區(qū)，C端為細(xì)胞色素b5功能區(qū)及配體結(jié)合區(qū)，能夠與含有SH2及SH3結(jié)構(gòu)域的蛋白結(jié)合[8-10]。PGRMC1廣泛分布于全身各組織，如肝、腎、肺、腎上腺、乳腺、子宮、卵巢、白細(xì)胞等，發(fā)揮多種功能[9， 11]。生理條件下PGRMC1通過與血紅素直接結(jié)合，激活細(xì)胞色素p450酶系統(tǒng)，參與體內(nèi)膽固醇、藥物代謝，也與甾體類激素合成密切相關(guān)[5]。此外，PGRMC1能夠與其他小分子蛋白共同形成孕激素受體復(fù)合物，介導(dǎo)體內(nèi)孕激素的快速非基因組作用，調(diào)控排卵、受精及神經(jīng)保護等功能[12]。

在腫瘤領(lǐng)域，關(guān)于PGRMC1的研究主要集中于肺癌、乳腺癌及卵巢癌，子宮內(nèi)膜癌相關(guān)研究僅在細(xì)胞系中見到。因此，本研究首次對子宮內(nèi)膜癌中PGRMC1蛋白表達進行了全面檢測，結(jié)果顯示正常內(nèi)膜和內(nèi)膜癌組織中均存在PGRMC1表達，但癌組織中PGRMC1表達量明顯增高。Shakeel等檢測了15例肺鱗癌和15例肺腺癌病人的癌及癌旁正常肺組織中PGRMC1的蛋白表達，分別有12例（80%）肺鱗癌及6例（40%）肺腺癌中PGRMC1顯著增高，而且PGRMC1含量增高5倍以上的8例肺鱗癌均為低分化[13]。與肺癌不同，子宮內(nèi)膜癌病灶多為彌漫性，與正常內(nèi)膜界限不清，同時由于內(nèi)膜癌病人以圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后為主，年齡相對大，正常內(nèi)膜薄，加之內(nèi)膜癌病人術(shù)前多已進行了分段診刮，正常內(nèi)膜量更少，以上三方面因素造成癌旁正常內(nèi)膜取材困難、準(zhǔn)確性欠佳，因此本研究未選取癌旁內(nèi)膜作為對照組，而是選取因其他疾病行子宮切除術(shù)或分段診刮術(shù)、術(shù)后病理證實為正常或為良性病變的內(nèi)膜作為對照組。本研究發(fā)現(xiàn)，對照內(nèi)膜中增生期、分泌期及萎縮期內(nèi)膜間PGRMC1表達無明顯差異，提示生理條件下子宮內(nèi)膜中PGRMC1表達受體內(nèi)雌、孕激素水平影響較小。在牛子宮內(nèi)膜中，亦未檢測到PGRMC1表達隨動情周期改變[14]；此外Jens等發(fā)現(xiàn)人外周血白細(xì)胞中PGRMC1表達也不隨月經(jīng)周期改變[11]，上述研究從不同角度支持本研究結(jié)果。但Chen等提出人子宮內(nèi)膜中PGRMC1表達在分泌期低于增生期[15]；另一項研究在去勢獼猴行人工周期的子宮內(nèi)膜中，PGRMC1 mRNA和蛋白在增生期高表達，隨后逐步下降，到分泌晚期降低至幾乎檢測不到[16]。因此，正常子宮內(nèi)膜中PGRMC1的分布特點還需要進一步擴大樣本量從而得到更準(zhǔn)確的結(jié)論。

本研究顯示，子宮內(nèi)膜癌中PGRMC1表達與腫瘤分期、分化均無關(guān)，但在Ⅰ期內(nèi)膜癌中，PGRMC1表達在Ⅰa期明顯高于Ⅰb期，提示PGRMC1可能在腫瘤早期階段發(fā)揮重要作用。PGRMC1能夠被致癌劑二噁英誘導(dǎo)表達[17]，而且是非基因致癌物刺激后早期表達的6個蛋白之一，可能與DNA損傷耐受及凋亡抑制相關(guān)，從而在腫瘤發(fā)生早期協(xié)助腫瘤細(xì)胞得以存活。同時本研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜癌中PGRMC1與ER表達狀態(tài)相關(guān)，在ER強陽性組PGRMC1表達明顯增高，而Neubauer等則在乳腺癌中則發(fā)現(xiàn)PGRMC1在ER陰性的乳腺癌中高表達[18]，兩種腫瘤中PGRMC1表達與ER表達的不一致需要深入功能研究闡述其機制，這也是未來研究的方向之一。

體外子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞免疫組化顯示PGRMC1在三種人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中均為陽性表達，定位于細(xì)胞質(zhì)中，而在細(xì)胞核中未見陽性表達。肺癌細(xì)胞A549中PGRMC1也定位于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞核中陰性表達[13]。但也有報道在卵巢癌Ovcar-3和宮頸癌Hela細(xì)胞中可觀察到PGRMC1在細(xì)胞核中的表達[7， 19]，PGRMC1的核轉(zhuǎn)位可能參與胞漿中信號向核內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

為了明確PGRMC1過表達與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的關(guān)系，應(yīng)用其小分子抑制劑Ag205干預(yù)三種子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞，結(jié)果顯示Ag205能夠有效抑制內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖，但在低分化內(nèi)膜癌細(xì)胞KLE中抑制作用最明顯。陸琳等應(yīng)用SiRNA抑制PGRMC1后，Ishikawa細(xì)胞生長受到抑制，細(xì)胞凋亡增加[20]。Ahmed等通過在肺癌中的研究提出PGRMC1可能通過穩(wěn)定EGFR（Epidemal Growth Factor Receptor）實現(xiàn)對腫瘤特性的調(diào)節(jié)[13]。因此，過表達的PGRMC1有望成為內(nèi)膜癌治療的新靶點。

綜上，本研究已完成子宮內(nèi)膜癌中PGRMC1分布特點分析，并觀察了PGRMC1對內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的影響，下一步將深入研究PGRMC1促進子宮內(nèi)膜癌增殖的機制及對其他惡性生物學(xué)特性如侵襲、轉(zhuǎn)移和化療耐藥的影響，探討PGRMC1與雌、孕激素作用的關(guān)系，更加全面闡述PGRMC1參與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的機制。

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