陶站華劉軍賢師德強(qiáng)康健，(廣西科學(xué)院生物物理實(shí)驗(yàn)室，南寧5000)　(廣西師范大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，桂林54004)(廣西科學(xué)院國(guó)家非糧生物質(zhì)能源工程技術(shù)研究中心，南寧5000)

基于單細(xì)胞拉曼光譜技術(shù)的葡萄球菌黃素生物合成分析

陶站華*1劉軍賢2師德強(qiáng)3康健1，2
1(廣西科學(xué)院生物物理實(shí)驗(yàn)室，南寧530003)2(廣西師范大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，桂林541004)3(廣西科學(xué)院國(guó)家非糧生物質(zhì)能源工程技術(shù)研究中心，南寧530003)

利用光鑷?yán)庾V技術(shù)研究吲哚對(duì)金葡菌細(xì)胞中葡萄球菌黃素合成的抑制作用以及色素含量在分批培養(yǎng)過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化。收集經(jīng)不同濃度吲哚(終濃度為0，0．2，0．6，0．8，1．2和1．5 mmol/L)處理后的以及不同培養(yǎng)時(shí)間的金葡菌單細(xì)胞的拉曼光譜，以光譜1523 cm-1峰強(qiáng)度表征色素含量，并與紫外可見(jiàn)分光光度法得到的結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果表明，細(xì)菌拉曼光譜1523 cm-1峰強(qiáng)度與分光光度法測(cè)得的色素含量有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達(dá)0．9772;群體和單細(xì)胞水平的光譜數(shù)據(jù)均表明，吲哚可劑量依賴(lài)性地抑制葡萄球菌黃素的合成，色素含量降低幅度超過(guò)70%;在分批培養(yǎng)中細(xì)菌色素含量在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期(12 h)達(dá)到最大值，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的群體內(nèi)部細(xì)胞間色素含量的異質(zhì)性較小，RSD在39．2%～61．1%之間。本研究表明光鑷?yán)庾V技術(shù)是一種在單細(xì)胞水平分析葡萄球菌黃素含量的可靠方法。

單細(xì)胞分析;光鑷?yán)庾V;金黃色葡萄球菌;葡萄球菌黃素

1　引言

由于生物群體細(xì)胞常存在不均一性，傳統(tǒng)的基于群體平均值的分析方法可能掩蓋個(gè)體細(xì)胞攜帶的信息。為了揭示群體中個(gè)體細(xì)胞之間的差異，更深入地理解細(xì)胞的生理或病理過(guò)程，需要準(zhǔn)確測(cè)定單細(xì)胞內(nèi)化學(xué)組分的含量，因此單細(xì)胞分析技術(shù)成為當(dāng)前分析化學(xué)中一個(gè)相當(dāng)活躍的研究領(lǐng)域。目前，較為常見(jiàn)的單細(xì)胞分析手段包括流式細(xì)胞術(shù)、顯微鏡技術(shù)、毛細(xì)管電泳、單細(xì)胞拉曼光譜等［1～3］。光鑷?yán)庾V技術(shù)(Laser tweezers Raman spectroscopy，LTRS)將光鑷技術(shù)和拉曼光譜技術(shù)結(jié)合起來(lái)，利用高度匯聚的激光束，囚禁溶液中的活細(xì)胞，再通過(guò)瞬時(shí)加大囚禁細(xì)胞的光束激發(fā)細(xì)胞內(nèi)分子的拉曼散射［4～7］。該技術(shù)充分結(jié)合了共焦顯微、光鑷、拉曼光譜的優(yōu)點(diǎn)，提高了檢測(cè)的靈敏度、準(zhǔn)確度，是研究生理狀態(tài)下單個(gè)活細(xì)胞內(nèi)化學(xué)物質(zhì)含量及結(jié)構(gòu)變化的有力工具。目前，LTRS技術(shù)已被應(yīng)用于研究Ca2+誘導(dǎo)下線粒體內(nèi)分子的變化［8］，紅酵母類(lèi)胡蘿卜素含量的測(cè)定［9］，體內(nèi)血糖濃度的檢測(cè)［10］，以及微血管內(nèi)單個(gè)紅細(xì)胞的表征［11］等。

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引起社區(qū)和醫(yī)院內(nèi)感染的重要致病菌［12］，其細(xì)胞膜上附著的金黃色色素——葡萄球菌黃素(Staphyloxanthin)是一種重要的毒力因子，能有效中和有毒氧化物，保護(hù)細(xì)菌免受宿主吞噬細(xì)胞生成的活性氧分子的損傷［13］，研究表明，阻斷葡萄球菌黃素生物合成是一種很有前景的治療金葡菌感染的新手段［14，15］。準(zhǔn)確測(cè)定金萄菌細(xì)胞內(nèi)葡萄球菌黃素含量是研究該色素生物合成調(diào)控、致毒力機(jī)理，以及進(jìn)行新型抗感染藥物篩選和活性評(píng)價(jià)的先決條件。傳統(tǒng)的測(cè)定葡萄球菌黃素的方法是先用有機(jī)溶劑抽提菌體內(nèi)的色素，然后用紫外可見(jiàn)分光光度法［16］或高效液相色譜法［17］定量。這種方法樣品需求量較大，臨床或自然環(huán)境中分離到的菌株需要先經(jīng)過(guò)液體擴(kuò)大培養(yǎng)才能測(cè)定色素含量，不能對(duì)存活于不同環(huán)境中的細(xì)菌實(shí)施原位檢測(cè)。此外，該測(cè)定方法得到的是金葡菌群體細(xì)胞色素含量的平均結(jié)果，無(wú)法反映單個(gè)細(xì)胞色素含量的信息。

本研究建立了一種利用LTRS技術(shù)原位檢測(cè)金葡菌細(xì)胞內(nèi)葡萄球菌黃素含量的方法，并利用此方法在單細(xì)胞和群體水平研究了不同濃度吲哚對(duì)色素合成的抑制作用，以及在一個(gè)生長(zhǎng)周期內(nèi)金葡菌細(xì)胞內(nèi)色素含量的變化規(guī)律。與傳統(tǒng)的分析方法相比，具有樣品需要量小(只需取10μL菌懸液進(jìn)行適當(dāng)稀釋)、無(wú)損、可實(shí)現(xiàn)原位單細(xì)胞分析等優(yōu)點(diǎn)。

2　實(shí)驗(yàn)部分

2．1細(xì)菌培養(yǎng)與藥物處理

2．1．1菌株和培養(yǎng)基金黃色葡萄球菌菌株ATCC 6538購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。固體培養(yǎng)基TSA組成為胰蛋白胨17 g/L、大豆胨3 g/L、葡萄糖2．5 g/L、NaCl5 g/L、K2HPO42．5 g/L、瓊脂粉15 g/L;液體培養(yǎng)基TSB除了不含有瓊脂粉外，其它成分與TSA一致。

2．1．2金黃色葡萄球菌的預(yù)培養(yǎng)挑取生長(zhǎng)于TSA培養(yǎng)基上的單菌落，接種于5 mL TSB培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)16 h。

2．1．3吲哚對(duì)金葡菌色素合成的抑制實(shí)驗(yàn)在5個(gè)裝有50 mL TSB培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中分別加入終濃度為0，0．2，0．6，0．8，1．2和1．5 mmol/L吲哚，以10%的比例接入金葡菌預(yù)培養(yǎng)物，37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。每個(gè)樣品取0．1 mL菌液用于拉曼光譜分析，其余的用紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)定菌體中葡萄球菌黃素的含量。

2．1．4金葡菌在一個(gè)生長(zhǎng)周期內(nèi)色素積累實(shí)驗(yàn)金葡菌預(yù)培養(yǎng)物以10%比例接種于250 mL裝有50 mL TSB培養(yǎng)基的搖瓶中，37℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，每隔2 h取0．1mL菌液置于4℃保存，用于后續(xù)單細(xì)胞拉曼光譜檢測(cè)。

2．2葡萄球菌黃素的紫外可見(jiàn)分光光度法定量

葡萄球菌黃素的提取及分光光度法定量根據(jù)文獻(xiàn)［16］方法并略做修改:細(xì)菌懸液離心收集菌體，以ddH2O洗滌2次，真空凍干后稱(chēng)重，重懸于適宜體積甲醇中，劇烈渦旋，55℃孵育3 min，離心，收集上清液，重復(fù)抽提3次，合并提取液，以紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)量465 nm處的吸光值，樣品中的葡萄球菌黃素含量用OD465/細(xì)胞干重表示。

用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮干色素的甲醇提取液的溶劑后，可得到葡萄球菌黃素的固體粉末。

2．3拉曼光譜收集及光譜數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)所用光鑷?yán)庾V系統(tǒng)與文獻(xiàn)［9］描述的一致。

取10μL菌液加入990μL ddH2O，再加入終濃度為0．1%(V/V)的Tween 80，劇烈渦旋0．5 min，以獲得更多分散的單細(xì)胞。將細(xì)菌懸液置于樣品槽內(nèi)，外加蓋玻片密封。100×油浸物鏡尋找目標(biāo)細(xì)胞，光鑷隨機(jī)俘獲單個(gè)細(xì)胞，激光強(qiáng)度調(diào)整為45mW，信號(hào)累積時(shí)間為30 s，收集目標(biāo)細(xì)胞的拉曼光譜，于細(xì)胞附近以相同條件收集背景拉曼光譜，每個(gè)樣品收集70個(gè)單細(xì)胞的拉曼光譜及5個(gè)背景光譜。

光譜預(yù)處理采用Matlab 7．0編寫(xiě)的程序進(jìn)行，每個(gè)細(xì)胞的原始光譜分別經(jīng)過(guò)背景扣除，5點(diǎn)Savitzky-Golay平滑，基線校正后得到細(xì)胞的實(shí)際光譜，然后以光譜1523 cm-1處的峰高對(duì)細(xì)胞內(nèi)的葡萄球菌黃素進(jìn)行定量分析。光譜圖的繪制及光譜數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析在軟件Origin 8．5中進(jìn)行，小提琴圖的繪制利用R語(yǔ)言中的ggplot2包完成。

3　結(jié)果與討論

3．1金黃色葡萄球菌的拉曼光譜

從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看，葡萄球菌黃素屬于C30三萜色素，與常見(jiàn)的C40類(lèi)胡蘿卜素結(jié)構(gòu)有很大相似性。實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定了葡萄球菌黃素固體粉末和培養(yǎng)6 h金葡菌單細(xì)胞的拉曼光譜(圖1)。葡萄球菌黃素由于存在多個(gè)共軛雙鍵，拉曼光譜信號(hào)很強(qiáng)(曲線A)，其中最強(qiáng)的3個(gè)特征峰1523，1160和1001 cm-1分別歸屬于C＝C伸縮振動(dòng)、C-C伸縮振動(dòng)和C＝C 面內(nèi)搖擺振動(dòng)［18］，這與常見(jiàn)C40類(lèi)胡蘿卜素的主要特征峰形狀類(lèi)似，峰位略有偏移。在金葡菌單細(xì)胞光譜(曲線B)中，雖然金葡菌僅培養(yǎng)6 h，細(xì)胞內(nèi)色素含量較低，但3個(gè)主要特征峰(1523，1160和1001 cm-1)強(qiáng)度還是遠(yuǎn)高于細(xì)胞內(nèi)其它化學(xué)成分的拉曼光譜信號(hào)，可見(jiàn)LTRS技術(shù)對(duì)金葡菌細(xì)胞內(nèi)色素具有很高的檢測(cè)靈敏度。在這3個(gè)特征峰中，1523 cm-1峰強(qiáng)度高，峰形對(duì)稱(chēng)、尖銳，周?chē)鷽](méi)有其它物質(zhì)的特征峰干擾，適合色素的定量分析。除與葡萄球菌黃素相關(guān)的特征峰外，金葡菌細(xì)胞拉曼光譜還包含來(lái)源于細(xì)胞內(nèi)其它生物分子的特征峰，如歸屬于核酸的722，780和1092 cm-1峰，與蛋白質(zhì)CN鍵伸縮振動(dòng)相關(guān)的1126 cm-1峰，來(lái)源于蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶α螺旋的1663 cm-1峰，與蛋白質(zhì)、脂類(lèi)和碳水化合物都有關(guān)聯(lián)的1452 cm-1峰，能提供細(xì)胞在環(huán)境信號(hào)影響下各種生物分子結(jié)構(gòu)和含量的動(dòng)態(tài)變化信息。

圖1　葡萄球菌黃素粉末(A)和培養(yǎng)6 h金葡菌單細(xì)胞的拉曼光譜(B)Fig．1　Raman spectra of staphyloxanthin powder(A)and Staphylococcus aureus single cells cultivated for 6 h(B)

3．2利用LTRS研究吲哚對(duì)葡萄球菌黃素生物合成的抑制作用

3．2．1吲哚對(duì)葡萄球菌黃素合成的劑量依賴(lài)性抑制葡萄球菌黃素合成抑制劑有望成為一類(lèi)新的治療金葡菌感染的有效藥物，現(xiàn)有的色素合成抑制劑的篩選和評(píng)價(jià)一般是通過(guò)目測(cè)比較候選藥物處理后菌體的顏色進(jìn)行粗略估計(jì)，這種方法主觀性強(qiáng)，且無(wú)法提供定量數(shù)據(jù)。LTRS方法能精確測(cè)量單個(gè)細(xì)胞內(nèi)葡萄球菌黃素的相對(duì)含量，可以從群體和單細(xì)胞兩個(gè)水平對(duì)候選藥物對(duì)色素合成的抑制效果進(jìn)行定量評(píng)估。本研究將金葡菌與終濃度為0，0．2，0．6，0．8，1．2和1．5mmol/L吲哚孵育培養(yǎng)12 h，然后每個(gè)樣品測(cè)定70個(gè)單細(xì)胞的拉曼光譜，各樣品的平均光譜如圖2所示，隨著吲哚濃度提高，細(xì)菌拉曼光譜1523 cm-1處的峰強(qiáng)度逐漸降低，從吲哚濃度為0 mol/L時(shí)的3561降低到吲哚濃度為1．5mmol/L時(shí)的1126，下降幅度約70%。這一方面說(shuō)明，吲哚可以劑量依賴(lài)性地抑制葡萄球菌黃素合成;另一方面也說(shuō)明，金葡菌細(xì)胞拉曼光譜1523 cm-1峰強(qiáng)度是反映葡萄球菌黃素含量的靈敏而可靠的標(biāo)志。

圖2　與不同濃度吲哚孵育的金葡菌細(xì)胞的平均拉曼光譜，A～F分別為0，0．2，0．6，0．8，1．2和1．5 mmol/L吲哚處理的細(xì)菌的拉曼光譜Fig．2　Average Raman spectra of Staphylococcus aureus cells exposed to various concentrations of indol，A－F represent Raman spectra of bacterial cells incubated with 0，0．2，0．6，0．8，1．2 and 1．5 mmol/L of indol，respectively

3．2．2紫外可見(jiàn)分光光度法與LTRS法檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性為了進(jìn)一步驗(yàn)證LTRS定量葡萄球菌黃素的可靠性，將LTRS測(cè)得的各樣品拉曼光譜1523 cm-1平均峰高與紫外可見(jiàn)分光光度法測(cè)得的OD465nm/菌體干重進(jìn)行線性相關(guān)分析，得到圖3，二者相關(guān)系數(shù)R=0．9772，線性相關(guān)性良好，證明LTRS定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖3　LTRS法測(cè)得的不同濃度吲哚處理的金葡菌細(xì)胞拉曼光譜1523 cm-1峰強(qiáng)度與UV測(cè)得的OD465nm/菌體干重相關(guān)性分析Fig．3　Correlation relationship between 1523 cm-1Raman peak intensities of Staphylococcus aureus cells exposed to various doses of indol and OD465nm/bacterial cell dry weightmeasured by UV spectrometry

3．2．3吲哚對(duì)葡萄球菌黃素合成抑制作用的單細(xì)胞分析傳統(tǒng)的基于溶劑提取后UV或HPLC測(cè)定的分析方法只能得到色素合成情況的群體平均值，掩蓋了單個(gè)細(xì)胞色素含量的信息。如果某種候選藥物能抑制侵入體內(nèi)大部分細(xì)菌的色素合成，但由于遺傳或代謝異質(zhì)性原因［9］，在少數(shù)菌細(xì)胞中色素含量仍然較高，它們就有可能逃避宿主免疫系統(tǒng)的氧化清除而存活，而某些毒力很強(qiáng)的菌株只需少許幾個(gè)活菌體就可以對(duì)宿主造成致死性感染。因此，只有將群體數(shù)據(jù)和基于單細(xì)胞分析的數(shù)據(jù)結(jié)合起來(lái)得到的金葡菌色素含量的信息才能更全面、客觀地反映藥物的抑制效果。LTRS是一種單細(xì)胞分析方法，能揭示個(gè)體細(xì)胞間色素含量的差異及不同色素含量細(xì)胞在群體內(nèi)的分布情況。圖4是LTRS方法得到的不同濃度吲哚處理后單細(xì)胞色素含量分布的小提琴圖。小提琴圖是一種用來(lái)對(duì)多組數(shù)據(jù)的分布進(jìn)行比較的方法［19］，圖中間的白色圓圈代表中位數(shù)，便于比較多個(gè)樣品中色素含量的平均水平;黑色長(zhǎng)方形的上下兩邊分別表示第一和第三分位數(shù);而外圍的琴盒表示變量在不同數(shù)值處的概率密度，直觀地顯示了不同色素含量的單細(xì)胞在群體中所占的比例:當(dāng)吲哚濃度為0 mol/L時(shí)，少數(shù)單細(xì)胞內(nèi)色素含量遠(yuǎn)高于群體平均值，其1523 cm01峰高超過(guò)10000(群體平均值為3561)，而在1．5 mmol/L吲哚抑制下，色素含量最高的細(xì)菌單細(xì)胞的此項(xiàng)數(shù)值也僅為2500，因此，無(wú)論從群體平均值還是從單細(xì)胞分布情況來(lái)看，吲哚的色素抑制效果均很顯著，因此，本實(shí)驗(yàn)從單細(xì)胞水平進(jìn)一步證實(shí)了LTRS用于定量評(píng)價(jià)葡萄球菌黃素合成抑制藥物的可行性。

圖4　不同濃度吲哚處理的金葡菌單細(xì)胞1523 cm01峰強(qiáng)度分布的小提琴圖Fig．4　Violin plots for distributions of 1523 cm01Raman peak intensities of individual Staphylococcus aureus cells exposed to various doses of indol

3．3葡萄球菌黃素含量在一個(gè)生長(zhǎng)周期內(nèi)的漲落規(guī)律

金葡菌在快速增殖過(guò)程中，隨著細(xì)胞密度增加，環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗，代謝產(chǎn)物逐漸積累，細(xì)菌細(xì)胞必然會(huì)通過(guò)代謝調(diào)控對(duì)環(huán)境信號(hào)的變化作出響應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)從群體和單細(xì)胞兩個(gè)水平研究在一個(gè)生長(zhǎng)周期內(nèi)細(xì)菌色素含量的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。

圖5　金葡菌的生長(zhǎng)曲線(A)，分批培養(yǎng)的金葡菌細(xì)胞中葡萄球菌黃素含量的時(shí)間依賴(lài)性變化(B)Fig．5　Growth behavior of Staphylococcus aureus(A) and time-dependent changes of staphyloxanthin content in bacterial cells during batch culture(B)

3．3．1分批培養(yǎng)中色素含量動(dòng)態(tài)變化的群體水平

金葡菌于TSB培養(yǎng)基中37℃，200 r/min培養(yǎng)24 h，每隔2 h取樣用于生長(zhǎng)曲線測(cè)定和色素合成分析(圖5):測(cè)量不同培養(yǎng)時(shí)間的菌液的吸光度值 OD600nm，并繪制細(xì)菌生長(zhǎng)曲線(曲線A);每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)量70個(gè)單細(xì)胞的拉曼光譜，以70個(gè)光譜1523 cm01峰高平均值隨時(shí)間的漲落表征色素含量在細(xì)胞群體水平的動(dòng)態(tài)變化(曲線B)。對(duì)比曲線A，B可知，金葡菌在進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期不久(6 h)即開(kāi)始快速合成葡萄球菌黃素，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期(12 h)細(xì)胞內(nèi)色素含量達(dá)到最大值，此后色素含量逐漸下降，這與一般微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成規(guī)律有較大不同，很多微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期或穩(wěn)定期才達(dá)到最大值。

3．3．2色素含量動(dòng)態(tài)變化的單細(xì)胞水平分析相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)是統(tǒng)計(jì)學(xué)中表征數(shù)據(jù)變異程度的參數(shù)。本研究采用RSD反映色素含量的細(xì)胞異質(zhì)性。表1分別顯示了不同培養(yǎng)時(shí)間70個(gè)單細(xì)胞拉曼光譜1523 cm01峰高平均值和RSD。在細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)的延遲期(2 h)、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期(6 h)、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期(12 h)、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期(20 h)和穩(wěn)定期(24 h)，細(xì)胞色素含量的群體平均值波動(dòng)較大，但每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的群體內(nèi)部細(xì)胞間色素含量的異質(zhì)性并不大，尤其是對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期(12 h)，RSD僅為39．2%，表明群體內(nèi)的大多數(shù)細(xì)胞色素積累幾乎同步達(dá)到最大含量，即同一群體內(nèi)細(xì)胞色素含量相對(duì)均一。

4　結(jié)論

本研究利用光鑷?yán)庾V技術(shù)分析單個(gè)金葡菌細(xì)胞內(nèi)葡萄球菌黃素相對(duì)含量，并考察吲哚濃度及培養(yǎng)時(shí)間對(duì)色素含量的影響。結(jié)果表明，細(xì)菌細(xì)胞拉曼光譜1523 cm-1峰強(qiáng)度與分光光度法測(cè)得的色素含量有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0．9772;群體和單細(xì)胞水平光譜數(shù)據(jù)均表明吲哚都能劑量依賴(lài)性的抑制葡萄球菌黃素的合成;在分批培養(yǎng)中，群體中大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)色素含量在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期同步達(dá)到最大值。因此，光鑷?yán)庾V技術(shù)是一種在單細(xì)胞水平分析葡萄球菌黃素含量的可靠方法。

表1　不同生長(zhǎng)階段金葡菌拉曼光譜1523 cm-1峰強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)分析Table 1　Statistical summary of 1523 cm-1peak intensities of Raman spectra of Staphylococcus aureus cells during various growth stages

References

1Lindstrm S．Single Cell Analysis．Stockholm:Humana Press，2012:1－12

2AIMin，LIU Jun-Xian，HUANG Shu-Shi，WANGGui-Wen，CHEN Xiu-Li，CHEN Zhi-Cheng，YAO Hui-lu．Chinese J．A-nal．Chem．，2009，37(5):758－763艾敏，劉軍賢，黃庶識(shí)，王桂文，陳秀麗，陳植成，姚輝璐．分析化學(xué)，2009，37(5):758－763

3LAI Jun-Zhuo，LIU Bin，WANG Gui-Wen，TAO Zhan-Hua，HUANG Shu-Shi．Spectroscopy and Spectral Analysis，2011，31(2):412－417賴(lài)鈞灼，劉斌，王桂文，陶站華，黃庶識(shí)．光譜學(xué)與光譜分析，2011，31(2):412－417

4Xie C，Dinno M A，Li Y Q．Optics Letters，2002，27(4):249－251

5WANG Yan-Jun，YAO Hui-Lu，WANG Gui-Wen，WANG Yun，F(xiàn)ENGMei-Fu．Spectroscopy and Spectral Analysis，2009，29(7):1881－1883王雁軍，姚輝璐，王桂文，汪蘊(yùn)，豐美福．光譜學(xué)與光譜分析，2009，29(7):1881－1883

6Xie CG，Li Y Q．J．Appl．Phys．，2003，93(5):2982－2986

7ZHOU Bing，LU Ming-Qian，ZHAO Li-Wei，HUANG Shu-Shi，CHEN Li-Mei．Chinese J．Anal．Chem．，2013，41(12): 1789－1794周冰，盧明倩，趙麗偉，黃庶識(shí)，陳麗梅．分析化學(xué)，2013，41(12):1789－1794

8Tang H，Yao H，Wang G，Wang Y，Li Y Q，F(xiàn)eng M．Optics Express，2007，15(20):12708－12716

9Tao ZH，Wang GW，Xu X D，Yuan Y F，Wang X，Li Y Q．FEMSMicrobiol．Lett．，2011，314(1):42－48

10Shao JW，Lin M M，Li Y Q，Li X，Liu JX，Liang JP，Yao H L．Plos One，2012，7(10):

11Shao JW，Yao H L，Meng L J，Li Y Q，Lin M M，Li X，Liu JX，Liang JP．Vib Spectrosc，2012，63367－63370

12Fitzgerald-Hughes D，Devocelle M，Humphreys H．FEMS Immunol．Med．Microbiol．，2012，65(3):399－412

13Clauditz A，Resch A，Wieland K P，Peschel A，Gotz F．Infect．Immun．，2006，74(8):4950－4953

14Daum R S．New England J．Med．，2008，359(1):85－87

15Oldfield E．Accounts Chem．Res．，2010，43(9):1216－1226

16Lee JH，Park JH，Cho M H，Lee J．CurrentMicrobiology，2012，65(6):726－732

17Kocher S，Breitenbach J，Muller V，Sandmann G．Arch．Microbiol．，2009，191(2):95－104

18Vitek P，Jehlicka J，Edwards H G，Osterrothova K．Anal．Bioanal．Chem．，2009，393(8):1967－1975

19Hintze JL，Nelson R D．Am．Stat，1998，52(2):181－184

環(huán)境儀器新需求不斷如何把握先機(jī)?

最嚴(yán)環(huán)保法、天津危化品爆炸、閱兵藍(lán)、北京首發(fā)紅色預(yù)警，持續(xù)一年的環(huán)保熱詞反映了公眾強(qiáng)烈的環(huán)境訴求。為了我國(guó)的持續(xù)發(fā)展，國(guó)家也將環(huán)境治理作為一項(xiàng)重要工作來(lái)抓，習(xí)近平總書(shū)記曾提出“綠水青山就是金山銀山”，“大氣十條”、“水十條”、“土十條”，一項(xiàng)項(xiàng)政策的發(fā)布表達(dá)了政府對(duì)環(huán)境治理的決心?？梢灶A(yù)見(jiàn)我國(guó)環(huán)保產(chǎn)業(yè)必將會(huì)是一個(gè)大有發(fā)展前景的產(chǎn)業(yè)。

而作為衡量環(huán)境質(zhì)量重要工具的科學(xué)儀器，在環(huán)境治理當(dāng)中的作用不言而喻，隨著環(huán)境產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，無(wú)論是技術(shù)水平、儀器種類(lèi)還是市場(chǎng)規(guī)模，環(huán)境領(lǐng)域科學(xué)儀器都得到了快速的發(fā)展。

三大行動(dòng)計(jì)劃全方位開(kāi)啟環(huán)境攻堅(jiān)戰(zhàn)

“大氣十條”、“水十條”、“土十條”被稱(chēng)為環(huán)?！叭髴?zhàn)役”，其中前兩部已分別于2013年和2015年發(fā)布，相信“土十條”的發(fā)布也為期不遠(yuǎn)。隨著“三大戰(zhàn)役”的開(kāi)啟和不斷深入，與之相配套的科學(xué)儀器及解決方案也越來(lái)越豐富。

大氣監(jiān)測(cè)經(jīng)過(guò)幾年的發(fā)展，逐步形成空地一體、全方位的監(jiān)控體系。比如為了解我國(guó)基本空氣質(zhì)量，在全國(guó)范圍內(nèi)建設(shè)了環(huán)境空氣質(zhì)量監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò);為說(shuō)清空氣污染來(lái)源問(wèn)題，重點(diǎn)城市紛紛建立了源解析系統(tǒng);在監(jiān)控工業(yè)污染的排放方面，煙塵/煙氣監(jiān)測(cè)系統(tǒng)發(fā)揮了重要作用。除此之外，VOCs監(jiān)測(cè)系統(tǒng)、揚(yáng)塵監(jiān)測(cè)系統(tǒng)、油煙監(jiān)測(cè)系統(tǒng)、無(wú)人機(jī)、激光雷達(dá)等等也開(kāi)始投入使用。

水質(zhì)監(jiān)測(cè)的發(fā)展則主要表現(xiàn)在檢測(cè)指標(biāo)和監(jiān)測(cè)范圍的擴(kuò)張上。隨著“水十條”的發(fā)布，對(duì)總氮總磷的總量控制提上了日程，水質(zhì)重金屬在線分析儀器的需求將更加明確，污水處理廠出水檢測(cè)指標(biāo)也將增多。在飲用水監(jiān)測(cè)方面，已從城市已經(jīng)擴(kuò)展到了廣大農(nóng)村，水體的監(jiān)測(cè)從重點(diǎn)監(jiān)測(cè)地表水向地表水、地下水并重發(fā)展，交通部和海洋局也制定了水質(zhì)監(jiān)測(cè)的計(jì)劃。

土壤問(wèn)題的復(fù)雜性導(dǎo)致了“土十條”遲遲沒(méi)有出臺(tái)，但從現(xiàn)實(shí)需求出發(fā)至少可以預(yù)見(jiàn)土壤質(zhì)量監(jiān)測(cè)和土壤修復(fù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展是離不開(kāi)科學(xué)儀器的支持的。

搶占先機(jī)各大儀器廠商紛紛布局環(huán)境領(lǐng)域

為了滿(mǎn)足我國(guó)環(huán)境領(lǐng)域廣大用戶(hù)對(duì)科學(xué)儀器的需求，搶占我國(guó)環(huán)境領(lǐng)域儀器市場(chǎng)，各大儀器廠商紛紛行動(dòng)，積極布局。

賽默飛世爾在水、空氣、輻射、土壤和固體廢棄物等環(huán)境方面均有完整的監(jiān)測(cè)解決方案。為滿(mǎn)足中國(guó)環(huán)境用戶(hù)的新需求，賽默飛世爾一方面陸續(xù)推出環(huán)境領(lǐng)域新產(chǎn)品，如低濃度CEMS系統(tǒng)、汞連續(xù)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)、COD在線自動(dòng)監(jiān)測(cè)儀等，一方面發(fā)布分析儀器在環(huán)境領(lǐng)域的整體解決方案，如PM2．5來(lái)源解析全面解決方案。

珀金埃爾默為環(huán)境領(lǐng)域用戶(hù)提供從無(wú)機(jī)到有機(jī)檢測(cè)、從離線到在線監(jiān)測(cè)、從前處理到儀器分析的完整環(huán)境解決方案。其產(chǎn)品不僅包括色譜、質(zhì)譜、光譜等分析儀器，還包括空氣中VOCs連續(xù)在線監(jiān)測(cè)方案，Elm多傳感器空氣質(zhì)量監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)和便攜式GC/MS等多種環(huán)境監(jiān)測(cè)專(zhuān)用儀器。

堀場(chǎng)為保護(hù)環(huán)境提供整體解決方案，針對(duì)大氣、水質(zhì)、土壤等環(huán)保問(wèn)題，提供實(shí)驗(yàn)室、便攜式和在線式多種類(lèi)型儀器。其產(chǎn)品包括大氣自動(dòng)成分分析裝置、污染源排放全面解決方案、水質(zhì)過(guò)程監(jiān)測(cè)方案、油分分析儀、土壤樣品有害元素分析儀等。

聚光科技以打造“綠色智慧環(huán)境”綜合管理平臺(tái)為目標(biāo)，業(yè)務(wù)涵蓋環(huán)境物聯(lián)網(wǎng)儀器儀表、環(huán)境信息化平臺(tái)、環(huán)境大數(shù)據(jù)及咨詢(xún)管理、環(huán)境治理工程及運(yùn)營(yíng)服務(wù)等。通過(guò)收購(gòu)中科光電、吉天儀器、上海安譜等公司，加快環(huán)境監(jiān)測(cè)平臺(tái)的建設(shè);通過(guò)自主研發(fā)和合作開(kāi)發(fā)，將整個(gè)業(yè)務(wù)平臺(tái)有機(jī)結(jié)合，從而推出了“智慧環(huán)境”整體規(guī)劃建設(shè)方案。

天瑞儀器在環(huán)境重金屬分析方面有著自己的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，其產(chǎn)品同樣涵蓋大氣、水質(zhì)、土壤等領(lǐng)域，包括大氣重金屬在線分析儀、水質(zhì)重金屬在線分析儀、便攜式水質(zhì)重金屬分析儀和手持式XRF土壤重金屬分析儀等。

開(kāi)拓商機(jī)analytica China 2016打造環(huán)境檢測(cè)盛宴

為給廣大儀器廠商提供一個(gè)集中展示新產(chǎn)品和解決方案的平臺(tái)，給用戶(hù)一個(gè)便捷了解新產(chǎn)品、新技術(shù)以及行業(yè)發(fā)展的機(jī)會(huì)，目前亞洲最重要的分析、實(shí)驗(yàn)室技術(shù)、診斷和生化技術(shù)領(lǐng)域的專(zhuān)業(yè)博覽會(huì)之一——慕尼黑上海分析生化展(analytica China 2016)將從產(chǎn)品展示和同期研討會(huì)兩個(gè)方面展示環(huán)境領(lǐng)域新產(chǎn)品、新技術(shù)、新應(yīng)用和行業(yè)動(dòng)態(tài)。

在analytica China 2016展會(huì)現(xiàn)場(chǎng)您可以找到環(huán)境檢測(cè)與監(jiān)控領(lǐng)域的最新產(chǎn)品和技術(shù)。展會(huì)將集中展示樣品前處理儀器、分析儀器、實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備、大氣分析儀、水質(zhì)分析儀和土壤專(zhuān)業(yè)分析儀等最新產(chǎn)品以及PM2．5、重金屬、VOCs等熱門(mén)環(huán)境問(wèn)題整體解決方案。部分參展廠商企業(yè)有:賽默飛世爾、珀金埃爾默、島津、堀場(chǎng)、安捷倫、劉梅克斯、美國(guó)TSI、聚光科技、天瑞儀器、上海儀電等等。

高水平學(xué)術(shù)研討會(huì)一直是analytica China 2016重點(diǎn)和亮點(diǎn)之一。analytica China 2016同期將舉辦“第八屆上海國(guó)際分析化學(xué)研討會(huì)”，其環(huán)境分會(huì)場(chǎng)將會(huì)邀請(qǐng)國(guó)內(nèi)外多名專(zhuān)家以及知名廠商專(zhuān)家就新型儀器開(kāi)發(fā)、最新檢測(cè)技術(shù)以及最新應(yīng)用進(jìn)行探討。此會(huì)議每年都會(huì)吸引超過(guò)500名專(zhuān)家、學(xué)者及相關(guān)從業(yè)人員的參與。此外，展會(huì)還將舉辦多個(gè)技術(shù)培訓(xùn)班，對(duì)環(huán)境領(lǐng)域用戶(hù)關(guān)注的熱門(mén)技術(shù)，如氣相色譜/液相色譜技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)、樣品前處理等進(jìn)行培訓(xùn)。

欲獲得更多環(huán)境領(lǐng)域科學(xué)儀器行業(yè)動(dòng)態(tài)，歡迎參加2016年10月10～12日在上海新國(guó)際博覽中心舉行的“2016慕尼黑上海分析生化展”。

更多信息，敬請(qǐng)?jiān)L問(wèn)展會(huì)官網(wǎng):www．a(chǎn)nalyticachina．com．cn，或關(guān)注官方微信:analyticaChina。

Analysis of Staphyloxanthin Biosynthesis Using Single Cell Raman Spectroscopy

TAO Zhan-Hua*1，LIU Jun-Xian2，SHIDe-Qiang3，KANG Jian1，2
1(Lab of Biophysics，Guangxi Academy of Sciences，Nanning 530003，China)2(College of Physics and Technology，Guangxi Normal University，Guilin 541004，China)3(National Engineering Research Center for Non-Food Biorefinery，Guangxi Academy of Sciences，Nanning 530003，China)

Laser tweezers Raman spectroscopy(LTRS)was used to study the inhibitory effect of indol on staphyloxanthin biosynthesis in Staphylococcus aureus cells and the dynamic changes of this pigment content inside bacterial cells during batch cultivation．The Raman spectra of Staphylococcus aureus cells cultivated for different time and exposed to various doses of indol were acquired．The intensity of 1523 cm-1band was used for the quantification of staphyloxanthin，in themeantime，the pigmentwasmeasured by UV spectrometry．The experimental result showed that an excellent linear relationship existed between the intensities of Raman peak at 1523 cm-1of bacterial cells and the pigment contents estimated by UV spectrometry，with a correlation coefficient of 0．9772．The spectral data at population level aswell as single cell level revealed that indol could inhibit the production of pigment in dose-dependent manner，and the pigment content in bacterial cells incubated with indol decreased by 70%．Under the batch growth condition，the pigment amount in Staphylococcus aureus cells reached the maximum value during the middle exponential growth phase(12 h) and the heterogeneity of pigment content in bacterial cellswithin certain populations at various time pointswas relatively small，with RSDs of 39．2%to 61．1%．This investigation indicates that LTRS can be served as a reliablemethod for the analysis of staphyloxanthin content at single cell level．

Single cell analysis;Laser tweezers Raman spectroscopy;Staphylococcus aureus;Staphyloxanthin

15 September 2015;accepted 20 November 2015)

10．11895/j．issn．0253-3820．150729

2015-09-15收稿;2015-11-20接受

本文系廣西自然科學(xué)基金(No．2014GXNSFAA118193)和廣西科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)資助項(xiàng)目(No．15YJ22SL08)資助

*E-mail:taozhanhua@163．com